CN109197585A - 一种铁皮石斛快速成苗的方法 - Google Patents

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邵丽丽
刘琴
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Nanjing Longyuan Ecological Agriculture Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛快速成苗的方法，所述步骤依次包括1）取材与消毒；2）诱导培养，3）增殖分化培养将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行；温度26℃，光照度2200~2500lx，光照时间为13h/d；4）生根培养；5）出瓶苗的过渡管理。本发明中通过各步骤的培育，在省去了炼苗环节，大大缩短了培育周期，节省成本的同时，而且保证了成苗的存活率。

Description

一种铁皮石斛快速成苗的方法
技术领域
本发明属于石斛培养领域，具体涉及一种铁皮石斛快速成苗的方法。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium candidum)，俗称铁皮枫斗，是兰科石斛属多年生草本植
物，为名贵的传统中药, 具重要的药用价值, 有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺之功效，颇具市场开发价值。近年来, 由于人们对其过度采挖, 导致其野生资源急剧减少, 日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物。由于铁皮石斛对生态环境要求高，自然条件下铁皮石斛繁殖率低生长速度缓慢，采用传统方法繁育铁皮石斛效率很低。因此铁皮石斛的组织培养研究得到了重视并获得了较大的进展。。传统的无性繁殖方式繁殖系数低，原球茎的培养经过原球茎诱导、增殖、分化，生根，壮苗，炼苗步骤，繁殖周期长、成苗率低。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种铁皮石斛快速成苗的方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供的一种铁皮石斛快速成苗的方法，所述培养步骤包括如下：
1）取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净，在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；
2）诱导培养
诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；培养条件为25℃，光照为1900 ~2200lx，光照时间为14h/d；
3）增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行；：温度26℃，光照度2200~2500lx，光照时间为13h/d；
4）生根培养
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养，培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根；，培养条件：温度25-26℃，光照度1700-2100 lx，光照时间为13-14h/d；
5）出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可出瓶移栽，移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，然后将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8～10min，栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中。
进一步地，所述步骤2）中的诱导培养基由以下组分组成：MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.6 ～ 2.5mg/L，萘乙酸0.6 ～ 0.8mg/L，PQQ 0.5 ～ 1.5umol/L，植物提取混合物16 ～28mg/L，蔗糖80 ～ 120 mg/L，培养基功能液5 ～8mg/L；
进一步地，所述步骤3）中所述增殖分化培养基由以下组分组成：1/2MS基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.6 ～ 2.5mg/L，萘乙酸0.6 ～ 0.8mg/L，PQQ 0.5 ～ 1.5umol/L，植物提取混合物16 ～28mg/L，蔗糖40 ～ 60 mg/L，维生素B2 0.2~0.3 mg/L； 培养基功能液5 ～8mg/L；
进一步地，所述MS基本培养基由以下组分组成：
硝酸铵NH4NO3 600 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 656 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 196 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NH2·CH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L；
进一步地，所述1/2MS基本培养基由以下组分组成：
硝酸铵NH4NO3 300 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 328 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 98mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NH2·CH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
进一步地，所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。
进一步地，所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
进一步地，生根培养基由以下组分组成：1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .5～2.0mg/L+PQQ 0.5 ～ 1.5umol/L +胺鲜酯0 .02～0 .1mg/L+香蕉肉汁5～15g/L+柠檬酸5～12g/L+维生素B2 0.2~0.3 mg/L+植物提取混合物12 ～18mg/L+培养基功能液5 ～8mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成；所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：8：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
有益效果：本发明相对于现有技术而言具备以下优点：
1）本发明中通过各步骤的培育，在省去了炼苗环节，大大缩短了培育周期，节省成本的同时，而且保证了成苗的存活率。
2）本发明提供的培养基中培养基功能液包括芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸且通过特定比例，使得培养基呈液体与固定之间，培养基呈悬浮状态，液体之间呈微流动状态，使得培养基中的组分之间均匀，不会因石斛茎芽发育而造成的组分分布不均；且最终成苗移栽时，比较容易拔出，不易伤根伤茎，从而提高成苗存活率。
3）本发明提供的培养基中植物提取混合物包括桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质以及特定比例，能够适应增殖分化期间的光照强度，从而成苗率高，成苗移栽后，阳光适应能力强，完成适应三伏天的光照强度和长度，不会造成灼伤等现象。
4）本发明提供的培养基中植物提取混合物包括桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质以及特定比例，能够使得根部抗逆性强，成苗移栽后，不会出现烂根或者根部发育不良现象。
5）本发明改进的1/2MS基本培养基和MS基本培养基，与培养基其他组分相互配合，能够大大增高增殖系数，增殖倍数可达8～10倍，培养周期短。
具体实施方式
MS基本培养基和1/2MS基本培养基中：包括如下成份：
常量元素的组分如下：硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）、氯化钙（CaCl2·2H2O）、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸钾（K2SO4）；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO4·H2O）、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）、硼酸（H3BO3）、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、硫酸铜（CuSO4·5H2O）、氯化钴 （CoCl2.62 ）；
铁盐的组分如下：乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA ）、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）；
有机成分的组分如下：肌醇、甘氨酸（Gly）、盐酸硫胺素（VB1）、盐酸吡哆醇（VB6）、烟酸（VPP）。
MS基本培养基由以下组分组成：
硝酸铵NH4NO3 600 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 656 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 196 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NH2·CH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L；
1/2MS基本培养基由以下组分组成：
硝酸铵NH4NO3 300 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 328 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 98mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NH2·CH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
实施例1：
一种铁皮石斛快速成苗的方法，所述培养步骤包括如下：
1）取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净，在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；
2）诱导培养
诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；培养条件为25℃，光照为2200lx，光照时间为14h/d；诱导培养基由以下组分组成：MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤2.5mg/L，萘乙酸0.6mg/L，PQQ 0.5umol/L，植物提取混合物16mg/L，蔗糖80mg/L，培养基功能液5mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3）增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行；：温度26℃，光照度2500lx，光照时间为13h/d；增殖分化培养基由以下组分组成：1/2MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤2.5mg/L，萘乙酸0.6 mg/L，PQQ 0.5umol/L，植物提取混合物16mg/L，蔗糖40mg/L，维生素B2 0.2mg/L；培养基功能液5mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4）生根培养
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养，培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根；，培养条件：温度25-26℃，光照度1700lx，光照时间为13-14h/d；生根培养基由以下组分组成：1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA2 .0mg/L+PQQ 0.5umol/L +胺鲜酯0 .02mg/L+香蕉肉汁5g/L+柠檬酸5g/L+维生素B2 0.2mg/L+植物提取混合物12mg/L+培养基功能液5mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成；所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：8：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5）出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可出瓶移栽，移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，然后将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8～10min，栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中。
实施例2：
一种铁皮石斛快速成苗的方法，所述培养步骤包括如下：
1）取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净，在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；
2）诱导培养
诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；培养条件为25℃，光照为1900 lx，光照时间为14h/d；诱导培养基由以下组分组成：MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.6 mg/L，萘乙酸0.8mg/L，PQQ 1.5umol/L，植物提取混合物28mg/L，蔗糖120 mg/L，培养基功能液8mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3）增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行：温度26℃，光照度2200~2500lx，光照时间为13h/d；增殖分化培养基由以下组分组成：1/2MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.6mg/L，萘乙酸0.8mg/L，PQQ 1.5umol/L，植物提取混合物28mg/L，蔗糖60 mg/L，维生素B2 0.3 mg/L； 培养基功能液8mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4）生根培养
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养，培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根；，培养条件：温度25-26℃，光照度2100 lx，光照时间为13h/d；生根培养基由以下组分组成：1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .5mg/L+PQQ 1.5umol/L +胺鲜酯0 .1mg/L+香蕉肉汁15g/L+柠檬酸12g/L+维生素B2 0.3 mg/L+植物提取混合物18mg/L+培养基功能液8mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成；所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：8：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5）出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可出瓶移栽，移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，然后将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8～10min，栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中。
实施例3：
一种铁皮石斛快速成苗的方法，所述培养步骤包括如下：
1）取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净，在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；
2）诱导培养
诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；培养条件为25℃，光照为2000lx，光照时间为14h/d；诱导培养基由以下组分组成：MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.9mg/L，萘乙酸0.7mg/L，PQQ 0.8umol/L，植物提取混合物23mg/L，蔗糖110 mg/L，培养基功能液7mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3）增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行；：温度26℃，光照度2300lx，光照时间为13h/d；增殖分化培养基由以下组分组成：1/2MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.8mg/L，萘乙酸0.7mg/L，PQQ 1.2umol/L，植物提取混合物22mg/L，蔗糖55 mg/L，维生素B2 0.25 mg/L； 培养基功能液6mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4）生根培养
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养，培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根；，培养条件：温度26℃，光照度2000 lx，光照时间为13h/d；生根培养基由以下组分组成：1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .9mg/L+PQQ 1.3umol/L +胺鲜酯0 .06mg/L+香蕉肉汁8g/L+柠檬酸8g/L+维生素B20.25 mg/L+植物提取混合物15mg/L+培养基功能液7mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成；所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：8：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5）出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可出瓶移栽，移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，然后将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8～10min，栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中。
实施例4：
一种铁皮石斛快速成苗的方法，所述培养步骤包括如下：
1）取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净，在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；
2）诱导培养
诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；培养条件为25℃，光照为2000lx，光照时间为14h/d；诱导培养基由以下组分组成：MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤2.1mg/L，萘乙酸0.7mg/L，PQQ 0.9umol/L，植物提取混合物27mg/L，蔗糖115 mg/L，培养基功能液7mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3）增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行；：温度26℃，光照度2300lx，光照时间为13h/d；增殖分化培养基由以下组分组成：1/2MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤2.3mg/L，萘乙酸0.7mg/L，PQQ 1.2umol/L，植物提取混合物26mg/L，蔗糖55 mg/L，维生素B2 0.25 mg/L； 培养基功能液7mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4）生根培养
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养，培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根；培养条件：温度25-26℃，光照度1800 lx，光照时间为14h/d；生根培养基由以下组分组成：1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .7mg/L+PQQ 1.1umol/L +胺鲜酯0 .09mg/L+香蕉肉汁13g/L+柠檬酸6g/L+维生素B2 0.27 mg/L+植物提取混合物17mg/L+培养基功能液7mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成；所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：8：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5）出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可出瓶移栽，移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，然后将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8～10min，栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中。
本实施例1~4经过近万株石斛培养试验：
实施例 平均生根率 光抗逆性 平均根粗 移栽烂根率
实施例1 99.2% 无灼伤，良好 0.22 0
实施例2 99.5% 无灼伤，良好 0.23 0
实施例3 99.9% 无灼伤，良好 0.24 0
实施例4 99.7% 无灼伤，良好 0.23 0
现有方法 75% 灼伤率15%左右 0.15 12.5%
光抗逆性数据来自南京地区2017年7~9月光照强度试验；平均根粗；实施例中的平均周期相比现有技术培育周期缩短30天左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述培养步骤包括如下：
1）取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净，在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；
2）诱导培养
诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；培养条件为25℃，光照为1900 ~2200lx，光照时间为14h/d；
3）增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行；：温度26℃，光照度2200~2500lx，光照时间为13h/d；
4）生根培养
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养，培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根；，培养条件：温度25-26℃，光照度1700-2100 lx，光照时间为13-14h/d；
5）出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可出瓶移栽，移栽前，将生根瓶苗打开瓶盖，然后将瓶苗取出，洗去附着在根部的培养基，用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8～10min，栽种于已灭菌的碎树皮基质中，放置在遮光度50%～60%、湿度达80%以上的温室中。
2.根据权利要求1所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述步骤2）中的诱导培养基由以下组分组成：MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.6 ～ 2.5mg/L，萘乙酸0.6 ～0.8mg/L，PQQ 0.5 ～ 1.5umol/L，植物提取混合物16 ～28mg/L，蔗糖80 ～ 120 mg/L，培养基功能液5 ～8mg/L。
3.根据权利要求3所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述步骤3）中所述增殖分化培养基由以下组分组成：1/2MS基本培养基，6- 苄氨基腺嘌呤1.6 ～ 2.5mg/L，萘乙酸0.6 ～ 0.8mg/L，PQQ 0.5 ～ 1.5umol/L，植物提取混合物16 ～28mg/L，蔗糖40 ～ 60mg/L，维生素B2 0.2~0.3 mg/L；培养基功能液5 ～8mg/L。
4.根据权利要求4所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述步骤4）中生根培养基由以下组分组成：1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .5～2 .0mg/L+PQQ 0.5 ～1.5umol/L +胺鲜酯0 .02～0 .1mg/L+香蕉肉汁5～15g/L+柠檬酸5～12g/L+维生素B2 0.2~0.3 mg/L+植物提取混合物12 ～18mg/L+培养基功能液5 ～8mg/L；所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成；所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：8：1；所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成；所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5.根据权利要求2中所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述MS基本培养基由以下组分组成：
硝酸铵NH4NO3 600 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 656 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 196 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NH2·CH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
6.根据权利要求3或4中所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述1/2MS基本培养基由以下组分组成：
硝酸铵NH4NO3 300 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 328 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 98mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NH2·CH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
7.根据权利要求2或者3所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成。
8.根据权利要求7所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。
9.根据权利要求2或者3中所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。
10.根据权利要求8所述铁皮石斛快速成苗的方法，其特征在于：所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
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