CN109197585A - 一种铁皮石斛快速成苗的方法 - Google Patents

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CN109197585A CN201810879671.8A CN201810879671A CN109197585A CN 109197585 A CN109197585 A CN 109197585A CN 201810879671 A CN201810879671 A CN 201810879671A CN 109197585 A CN109197585 A CN 109197585A
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dendrobium candidum
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邵丽丽
刘琴
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Nanjing Longyuan Ecological Agriculture Co Ltd
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Nanjing Longyuan Ecological Agriculture Co Ltd
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008Methods for regeneration to complete plants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001Culture apparatus for tissue culture

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛快速成苗的方法,所述步骤依次包括1)取材与消毒;2)诱导培养,3)增殖分化培养将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行;温度26℃,光照度2200~2500lx,光照时间为13h/d;4)生根培养;5)出瓶苗的过渡管理。本发明中通过各步骤的培育,在省去了炼苗环节,大大缩短了培育周期,节省成本的同时,而且保证了成苗的存活率。

Description

一种铁皮石斛快速成苗的方法
技术领域
本发明属于石斛培养领域,具体涉及一种铁皮石斛快速成苗的方法。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium candidum),俗称铁皮枫斗,是兰科石斛属多年生草本植
物,为名贵的传统中药, 具重要的药用价值, 有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺之功效,颇具市场开发价值。近年来, 由于人们对其过度采挖, 导致其野生资源急剧减少, 日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物。由于铁皮石斛对生态环境要求高,自然条件下铁皮石斛繁殖率低生长速度缓慢,采用传统方法繁育铁皮石斛效率很低。因此铁皮石斛的组织培养研究得到了重视并获得了较大的进展。。传统的无性繁殖方式繁殖系数低,原球茎的培养经过原球茎诱导、增殖、分化,生根,壮苗,炼苗步骤,繁殖周期长、成苗率低。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供了一种铁皮石斛快速成苗的方法。
技术方案:为解决上述技术问题,本发明提供的一种铁皮石斛快速成苗的方法,所述培养步骤包括如下:
1)取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,在流水下冲洗,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,并经自来水充分洗净,在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~6次;
2)诱导培养
诱导培养:用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下,接种在诱导培养基中进行培养;15~20天后,外植体开始萌动,茎段膨大,切面及顶部组织形成疏松组织;继续培养20天后,转入微放置室中,切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物,随着培养时间的延长,颗粒物长大形成直径1~2mm的类原球茎颗粒物;培养条件为25℃,光照为1900 ~2200lx,光照时间为14h/d;
3)增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行;:温度26℃,光照度2200~2500lx,光照时间为13h/d;
4)生根培养
待增殖芽数量较多时,将高1~2cm、带有2~3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养,培养30天左右,基部开始出现2~3条约1cm长的白色根;,培养条件:温度25-26℃,光照度1700-2100 lx,光照时间为13-14h/d;
5)出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3~4片叶时,便可出瓶移栽,移栽前,将生根瓶苗打开瓶盖,然后将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基,用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8~10min,栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水),放置在遮光度50%~60%、湿度达80%以上的温室中。
进一步地,所述步骤2)中的诱导培养基由以下组分组成:MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.6 ~ 2.5mg/L,萘乙酸0.6 ~ 0.8mg/L,PQQ 0.5 ~ 1.5umol/L,植物提取混合物16 ~28mg/L,蔗糖80 ~ 120 mg/L,培养基功能液5 ~8mg/L;
进一步地,所述步骤3)中所述增殖分化培养基由以下组分组成:1/2MS基本培养基,6-苄氨基腺嘌呤1.6 ~ 2.5mg/L,萘乙酸0.6 ~ 0.8mg/L,PQQ 0.5 ~ 1.5umol/L,植物提取混合物16 ~28mg/L,蔗糖40 ~ 60 mg/L,维生素B2 0.2~0.3 mg/L; 培养基功能液5 ~8mg/L;
进一步地,所述MS基本培养基由以下组分组成:
硝酸铵NH4NO3 600 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 656 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 196 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NHCH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L;
进一步地,所述1/2MS基本培养基由以下组分组成:
硝酸铵NH4NO3 300 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 328 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 98mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NHCH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
进一步地,所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1。
进一步地,所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
进一步地,生根培养基由以下组分组成:1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .5~2.0mg/L+PQQ 0.5 ~ 1.5umol/L +胺鲜酯0 .02~0 .1mg/L+香蕉肉汁5~15g/L+柠檬酸5~12g/L+维生素B2 0.2~0.3 mg/L+植物提取混合物12 ~18mg/L+培养基功能液5 ~8mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成;所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:8:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
有益效果:本发明相对于现有技术而言具备以下优点:
1)本发明中通过各步骤的培育,在省去了炼苗环节,大大缩短了培育周期,节省成本的同时,而且保证了成苗的存活率。
2)本发明提供的培养基中培养基功能液包括芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸且通过特定比例,使得培养基呈液体与固定之间,培养基呈悬浮状态,液体之间呈微流动状态,使得培养基中的组分之间均匀,不会因石斛茎芽发育而造成的组分分布不均;且最终成苗移栽时,比较容易拔出,不易伤根伤茎,从而提高成苗存活率。
3)本发明提供的培养基中植物提取混合物包括桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质以及特定比例,能够适应增殖分化期间的光照强度,从而成苗率高,成苗移栽后,阳光适应能力强,完成适应三伏天的光照强度和长度,不会造成灼伤等现象。
4)本发明提供的培养基中植物提取混合物包括桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质以及特定比例,能够使得根部抗逆性强,成苗移栽后,不会出现烂根或者根部发育不良现象。
5)本发明改进的1/2MS基本培养基和MS基本培养基,与培养基其他组分相互配合,能够大大增高增殖系数,增殖倍数可达8~10倍,培养周期短。
具体实施方式
MS基本培养基和1/2MS基本培养基中:包括如下成份:
常量元素的组分如下:硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸钾(K2SO4);
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下:硫酸锰(MnSO4·H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、硼酸(H3BO3)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、硫酸铜(CuSO5H2O)、氯化钴 (CoCl2.62 );
铁盐的组分如下:乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA )、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O);
有机成分的组分如下:肌醇、甘氨酸(Gly)、盐酸硫胺素(VB1)、盐酸吡哆醇(VB6)、烟酸(VPP)。
MS基本培养基由以下组分组成:
硝酸铵NH4NO3 600 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 656 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 196 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NHCH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L;
1/2MS基本培养基由以下组分组成:
硝酸铵NH4NO3 300 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 328 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 98mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NHCH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
实施例1:
一种铁皮石斛快速成苗的方法,所述培养步骤包括如下:
1)取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,在流水下冲洗,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,并经自来水充分洗净,在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~6次;
2)诱导培养
诱导培养:用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下,接种在诱导培养基中进行培养;15~20天后,外植体开始萌动,茎段膨大,切面及顶部组织形成疏松组织;继续培养20天后,转入微放置室中,切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物,随着培养时间的延长,颗粒物长大形成直径1~2mm的类原球茎颗粒物;培养条件为25℃,光照为2200lx,光照时间为14h/d;诱导培养基由以下组分组成:MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤2.5mg/L,萘乙酸0.6mg/L,PQQ 0.5umol/L,植物提取混合物16mg/L,蔗糖80mg/L,培养基功能液5mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3)增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行;:温度26℃,光照度2500lx,光照时间为13h/d;增殖分化培养基由以下组分组成:1/2MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤2.5mg/L,萘乙酸0.6 mg/L,PQQ 0.5umol/L,植物提取混合物16mg/L,蔗糖40mg/L,维生素B2 0.2mg/L;培养基功能液5mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4)生根培养
待增殖芽数量较多时,将高1~2cm、带有2~3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养,培养30天左右,基部开始出现2~3条约1cm长的白色根;,培养条件:温度25-26℃,光照度1700lx,光照时间为13-14h/d;生根培养基由以下组分组成:1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA2 .0mg/L+PQQ 0.5umol/L +胺鲜酯0 .02mg/L+香蕉肉汁5g/L+柠檬酸5g/L+维生素B2 0.2mg/L+植物提取混合物12mg/L+培养基功能液5mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成;所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:8:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5)出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3~4片叶时,便可出瓶移栽,移栽前,将生根瓶苗打开瓶盖,然后将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基,用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8~10min,栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水),放置在遮光度50%~60%、湿度达80%以上的温室中。
实施例2:
一种铁皮石斛快速成苗的方法,所述培养步骤包括如下:
1)取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,在流水下冲洗,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,并经自来水充分洗净,在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~6次;
2)诱导培养
诱导培养:用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下,接种在诱导培养基中进行培养;15~20天后,外植体开始萌动,茎段膨大,切面及顶部组织形成疏松组织;继续培养20天后,转入微放置室中,切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物,随着培养时间的延长,颗粒物长大形成直径1~2mm的类原球茎颗粒物;培养条件为25℃,光照为1900 lx,光照时间为14h/d;诱导培养基由以下组分组成:MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.6 mg/L,萘乙酸0.8mg/L,PQQ 1.5umol/L,植物提取混合物28mg/L,蔗糖120 mg/L,培养基功能液8mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3)增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行:温度26℃,光照度2200~2500lx,光照时间为13h/d;增殖分化培养基由以下组分组成:1/2MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.6mg/L,萘乙酸0.8mg/L,PQQ 1.5umol/L,植物提取混合物28mg/L,蔗糖60 mg/L,维生素B2 0.3 mg/L; 培养基功能液8mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4)生根培养
待增殖芽数量较多时,将高1~2cm、带有2~3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养,培养30天左右,基部开始出现2~3条约1cm长的白色根;,培养条件:温度25-26℃,光照度2100 lx,光照时间为13h/d;生根培养基由以下组分组成:1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .5mg/L+PQQ 1.5umol/L +胺鲜酯0 .1mg/L+香蕉肉汁15g/L+柠檬酸12g/L+维生素B2 0.3 mg/L+植物提取混合物18mg/L+培养基功能液8mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成;所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:8:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5)出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3~4片叶时,便可出瓶移栽,移栽前,将生根瓶苗打开瓶盖,然后将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基,用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8~10min,栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水),放置在遮光度50%~60%、湿度达80%以上的温室中。
实施例3:
一种铁皮石斛快速成苗的方法,所述培养步骤包括如下:
1)取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,在流水下冲洗,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,并经自来水充分洗净,在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~6次;
2)诱导培养
诱导培养:用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下,接种在诱导培养基中进行培养;15~20天后,外植体开始萌动,茎段膨大,切面及顶部组织形成疏松组织;继续培养20天后,转入微放置室中,切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物,随着培养时间的延长,颗粒物长大形成直径1~2mm的类原球茎颗粒物;培养条件为25℃,光照为2000lx,光照时间为14h/d;诱导培养基由以下组分组成:MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.9mg/L,萘乙酸0.7mg/L,PQQ 0.8umol/L,植物提取混合物23mg/L,蔗糖110 mg/L,培养基功能液7mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3)增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行;:温度26℃,光照度2300lx,光照时间为13h/d;增殖分化培养基由以下组分组成:1/2MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.8mg/L,萘乙酸0.7mg/L,PQQ 1.2umol/L,植物提取混合物22mg/L,蔗糖55 mg/L,维生素B2 0.25 mg/L; 培养基功能液6mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4)生根培养
待增殖芽数量较多时,将高1~2cm、带有2~3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养,培养30天左右,基部开始出现2~3条约1cm长的白色根;,培养条件:温度26℃,光照度2000 lx,光照时间为13h/d;生根培养基由以下组分组成:1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .9mg/L+PQQ 1.3umol/L +胺鲜酯0 .06mg/L+香蕉肉汁8g/L+柠檬酸8g/L+维生素B20.25 mg/L+植物提取混合物15mg/L+培养基功能液7mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成;所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:8:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5)出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3~4片叶时,便可出瓶移栽,移栽前,将生根瓶苗打开瓶盖,然后将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基,用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8~10min,栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水),放置在遮光度50%~60%、湿度达80%以上的温室中。
实施例4:
一种铁皮石斛快速成苗的方法,所述培养步骤包括如下:
1)取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,在流水下冲洗,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,并经自来水充分洗净,在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~6次;
2)诱导培养
诱导培养:用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下,接种在诱导培养基中进行培养;15~20天后,外植体开始萌动,茎段膨大,切面及顶部组织形成疏松组织;继续培养20天后,转入微放置室中,切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物,随着培养时间的延长,颗粒物长大形成直径1~2mm的类原球茎颗粒物;培养条件为25℃,光照为2000lx,光照时间为14h/d;诱导培养基由以下组分组成:MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤2.1mg/L,萘乙酸0.7mg/L,PQQ 0.9umol/L,植物提取混合物27mg/L,蔗糖115 mg/L,培养基功能液7mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
3)增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行;:温度26℃,光照度2300lx,光照时间为13h/d;增殖分化培养基由以下组分组成:1/2MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤2.3mg/L,萘乙酸0.7mg/L,PQQ 1.2umol/L,植物提取混合物26mg/L,蔗糖55 mg/L,维生素B2 0.25 mg/L; 培养基功能液7mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成;所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
4)生根培养
待增殖芽数量较多时,将高1~2cm、带有2~3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养,培养30天左右,基部开始出现2~3条约1cm长的白色根;培养条件:温度25-26℃,光照度1800 lx,光照时间为14h/d;生根培养基由以下组分组成:1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .7mg/L+PQQ 1.1umol/L +胺鲜酯0 .09mg/L+香蕉肉汁13g/L+柠檬酸6g/L+维生素B2 0.27 mg/L+植物提取混合物17mg/L+培养基功能液7mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成;所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:8:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、 皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5)出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3~4片叶时,便可出瓶移栽,移栽前,将生根瓶苗打开瓶盖,然后将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基,用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8~10min,栽种于已灭菌的碎树皮基质中(移栽前浇透水),放置在遮光度50%~60%、湿度达80%以上的温室中。
本实施例1~4经过近万株石斛培养试验:
实施例 平均生根率 光抗逆性 平均根粗 移栽烂根率
实施例1 99.2% 无灼伤,良好 0.22 0
实施例2 99.5% 无灼伤,良好 0.23 0
实施例3 99.9% 无灼伤,良好 0.24 0
实施例4 99.7% 无灼伤,良好 0.23 0
现有方法 75% 灼伤率15%左右 0.15 12.5%
光抗逆性数据来自南京地区2017年7~9月光照强度试验;平均根粗;实施例中的平均周期相比现有技术培育周期缩短30天左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述培养步骤包括如下:
1)取材与消毒
从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,在流水下冲洗,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,并经自来水充分洗净,在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后,再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~6次;
2)诱导培养
诱导培养:用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下,接种在诱导培养基中进行培养;15~20天后,外植体开始萌动,茎段膨大,切面及顶部组织形成疏松组织;继续培养20天后,转入微放置室中,切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物,随着培养时间的延长,颗粒物长大形成直径1~2mm的类原球茎颗粒物;培养条件为25℃,光照为1900 ~2200lx,光照时间为14h/d;
3)增殖分化培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中,同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1~2片小叶,原球茎的增殖与芽分化同时进行;:温度26℃,光照度2200~2500lx,光照时间为13h/d;
4)生根培养
待增殖芽数量较多时,将高1~2cm、带有2~3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养,培养30天左右,基部开始出现2~3条约1cm长的白色根;,培养条件:温度25-26℃,光照度1700-2100 lx,光照时间为13-14h/d;
5)出瓶苗的过渡管理
当苗高3cm以上、具3~4片叶时,便可出瓶移栽,移栽前,将生根瓶苗打开瓶盖,然后将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基,用 0.01%的高锰酸钾溶液浸泡8~10min,栽种于已灭菌的碎树皮基质中,放置在遮光度50%~60%、湿度达80%以上的温室中。
2.根据权利要求1所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述步骤2)中的诱导培养基由以下组分组成:MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.6 ~ 2.5mg/L,萘乙酸0.6 ~0.8mg/L,PQQ 0.5 ~ 1.5umol/L,植物提取混合物16 ~28mg/L,蔗糖80 ~ 120 mg/L,培养基功能液5 ~8mg/L。
3.根据权利要求3所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述步骤3)中所述增殖分化培养基由以下组分组成:1/2MS基本培养基,6- 苄氨基腺嘌呤1.6 ~ 2.5mg/L,萘乙酸0.6 ~ 0.8mg/L,PQQ 0.5 ~ 1.5umol/L,植物提取混合物16 ~28mg/L,蔗糖40 ~ 60mg/L,维生素B2 0.2~0.3 mg/L;培养基功能液5 ~8mg/L。
4.根据权利要求4所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述步骤4)中生根培养基由以下组分组成:1/2 MS基本培养基+吲哚丁酸IBA0 .5~2 .0mg/L+PQQ 0.5 ~1.5umol/L +胺鲜酯0 .02~0 .1mg/L+香蕉肉汁5~15g/L+柠檬酸5~12g/L+维生素B2 0.2~0.3 mg/L+植物提取混合物12 ~18mg/L+培养基功能液5 ~8mg/L;所述植物提取液由桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质组成;所述桑叶提取物、菱角叶汁以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:8:1;所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成;所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
5.根据权利要求2中所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述MS基本培养基由以下组分组成:
硝酸铵NH4NO3 600 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 656 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 196 mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 370 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 170 mg/L
硫酸钾K2SO4 990 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NHCH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
6.根据权利要求3或4中所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述1/2MS基本培养基由以下组分组成:
硝酸铵NH4NO3 300 mg/L
硝酸钙 Ca(NO3)2·4H2O 328 mg/L
氯化钙CaCl2·2H2O 98mg/L
硫酸镁MgSO4·7H2O 185 mg/L
磷酸二氢钾 KH2PO4 85mg/L
硫酸钾K2SO4 495 mg/L
乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3 mg/L
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8 mg/L
硫酸锰MnSO4·H2O 22.3 mg/L
硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L
硼酸H3BO3 8.2 mg/L
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.05mg/L
氯化钴 CoCl2.6 H2O 2 0.05 mg/L
肌醇C6H12O6·2H2O 500 mg/L
甘氨酸NHCH2·COOH 5mg/L
盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl 2 mg/L
盐酸吡哆醇C8H10NO5P 0.8 mg/L
烟酸NC5H4COOH 0.8mg/L。
7.根据权利要求2或者3所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成。
8.根据权利要求7所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5:4:1。
9.根据权利要求2或者3中所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。
10.根据权利要求8所述铁皮石斛快速成苗的方法,其特征在于:所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。
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