CN108684524A - 铁皮石斛的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛的组织培养方法，该组织培养方法包括：1）将铁皮石斛的茎芽进行消毒以得到外植体；2）将外植体置于诱导培养基中进行诱导培养以得到原球茎；3）将原球茎置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖苗；4）将增殖苗置于生根培养基中进行生根培养以得到铁皮石斛的幼苗；其中，诱导培养基包括B5培养基、6‑BA、IAA、腺嘌呤、叶酸、维生素B2；增殖培养基包括B5培养基、6‑BA、IBA、链霉素、土豆泥、椰汁；生根培养基包括1/2 B5培养基、CPA、GA3、NAA、水解乳蛋白、牛肉汁、活性炭。该组织培养方法能够高效地培育出铁皮石斛。

Description

铁皮石斛的组织培养方法
技术领域
本发明涉及组织培养基，具体地，涉及一种铁皮石斛的组织培养方法。
背景技术
铁皮石斛是一种喜阴凉的多年生草本植物，喜在温暖、潮湿、以年降雨量1000毫米以上、半阴半阳的环境，1月平均气温高于8℃的亚热带深山老林中生长为佳，适宜生长温度为15到28度，适宜生长空气湿度为60%以上，对土肥要求不甚严格，野生多在疏松且厚的树皮或树干上生长，有的也生长于石缝中。铁皮石斛属气生根系，主要要求根部通透性好，采用的基质最好能通风透气滤水，在适宜的温度湿度下，生长速度快，生存能力非常强。每年春末夏初，二年生茎上部节上抽出花序，开花后从茎基长出新芽发育成茎，秋冬季节进入休眠期。
铁皮石斛的平均自然结实率仅为0.31%，其中以开花当天萼片还没完全展开时的人工授粉结实率最高，铁皮石斛的自然授粉成功率仅为30%左右，同时铁皮石斛的野生种子的成活率很低；综上几种因素进而导致了铁皮石斛在繁殖过程中存在着较大困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛的组织培养方法，该组织培养方法能够高效地培育出铁皮石斛。
为了实现上述目的，本发明提供了一种铁皮石斛的组织培养方法，该组织培养方法包括：
1）将铁皮石斛的茎芽进行消毒以得到外植体；
2）将外植体置于诱导培养基中进行诱导培养以得到原球茎；
3）将原球茎置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖苗；
4）将增殖苗置于生根培养基中进行生根培养以得到铁皮石斛的幼苗；
其中，诱导培养基包括B5培养基、0.8-1.2mg/L的6-BA、0.1-0.3mg/L的IAA、0.01-0.05mg/L的腺嘌呤、0.01-0.03mg/L的叶酸、0.04-0.06mg/L的维生素B2；
增殖培养基包括B5培养基、0.2-0.5mg/L的6-BA、0.05-0.1mg/L的IBA、0.05-0.08mg/L的链霉素、15-20g/L的土豆泥、4-8g/L的椰汁；
生根培养基包括1/2 B5培养基、0.4-0.8mg/L的CPA、0.02-0.06mg/L的GA3、0.01-0.05mg/L的NAA、0.2-0.4mg/L的水解乳蛋白、2-6g/L的牛肉汁、7-10g/L的活性炭。
在上述技术方案中，本发明通过调整各诱导培养基、增殖培养基、生根培养基中的组分和含量，进而使得该方法能够快速、高效地通过组织培养得到铁皮石斛，进而能够实现铁皮石斛的大面积种植。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种铁皮石斛的组织培养方法，该组织培养方法包括：
1）将铁皮石斛的茎芽进行消毒以得到外植体；
2）将外植体置于诱导培养基中进行诱导培养以得到原球茎；
3）将原球茎置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖苗；
4）将增殖苗置于生根培养基中进行生根培养以得到铁皮石斛的幼苗；
其中，诱导培养基包括B5培养基、0.8-1.2mg/L的6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、0.1-0.3mg/L的IAA（吲哚乙酸）、0.01-0.05mg/L的腺嘌呤、0.01-0.03mg/L的叶酸、0.04-0.06mg/L的维生素B2；
增殖培养基包括B5培养基、0.2-0.5mg/L的6-BA、0.05-0.1mg/L的IBA（吲哚丁酸）、0.05-0.08mg/L的链霉素、15-20g/L的土豆泥、4-8g/L的椰汁；
生根培养基包括1/2 B5培养基、0.4-0.8mg/L的CPA（醋酸环丙孕酮）、0.02-0.06mg/L的GA3（赤霉素）、0.01-0.05mg/L的NAA（萘乙酸）、0.2-0.4mg/L的水解乳蛋白、2-6g/L的牛肉汁、7-10g/L的活性炭。
在上述各培养基中，pH的范围可以在宽的范围内选择，但是为了使该组织培养具有更优异的效率，优选地，诱导培养基、增殖培养基、生根培养基均满足以下条件：pH为5.3-5.5。
其中，pH的调节的方式也可以在宽的范围内选择，但是从培养基的稳定性上考虑，优选地，诱导培养基、增殖培养基、生根培养基的pH的调节采用缓冲溶液的方式进行。
在本发明中，为了更好地为各个组织提供优异的养分以及适宜的培养条件，优选地，诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有6.5-7.0g/L的琼脂和25-30g/L的蔗糖。
在发明中，诱导培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得该组织培养具有更有益的效率，优选地，诱导培养的条件为：在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和蓝光灯同时存在下进行，培养时间为10-15天；光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1700-1900lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在发明中，增殖培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得该组织培养具有更有益的效率，优选地，增殖培养的条件为：在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和紫光灯同时存在下进行，培养时间为15-20天；光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2000-2100lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在发明中，生根培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得该组织培养具有更有益的效率，优选地，生根培养的条件为：在光暗交替的情形下进行，光照采用自然光，培养时间为7-10天；光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2000-2100lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在本发明的步骤1）中，消毒的具体方式可以在宽的范围内选择，但是为了使得消毒的更加彻底，优选地，在步骤1）中，灭菌消毒具体为：先将茎芽置于60-70重量%酒精水溶液中浸泡30-60s，接着将其置于3-5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3-4min，最后通过蒸馏水进行清洗3-5次。
在本发明的步骤1）中，外植体的长度可以在宽的范围内选择，但是为了使得诱导培养更加彻底，优选地，在步骤1）中，外植体的长度为0.4-0.6cm。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
实施例1
1）将铁皮石斛的茎芽（长度为0.5cm）进行消毒（先将所述茎芽置于65重量%酒精水溶液中浸泡40s，接着将其置于4重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3min，最后通过蒸馏水进行清洗4次）以得到外植体；
2）将外植体置于诱导培养基（包括B5培养基、1mg/L的6-BA、0.2mg/L的IAA、0.03mg/L的腺嘌呤、0.02mg/L的叶酸、0.05mg/L的维生素B2、6.8g/L的琼脂和28g/L的蔗糖，pH为5.4）中进行诱导培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和蓝光灯同时存在下进行，培养时间为13天；光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1800lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以得到原球茎；
3）将原球茎置于增殖培养基（包括B5培养基、0.4mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、0.07mg/L的链霉素、18g/L的土豆泥、6g/L的椰汁、6.8g/L的琼脂和28g/L的蔗糖，pH为5.4）中进行增殖培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和紫光灯同时存在下进行，培养时间为18天；光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为2050lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以得到增殖苗；
4）将增殖苗置于生根培养基（包括1/2 B5培养基、0.6mg/L的CPA、0.04mg/L的GA3、0.03mg/L的NAA、0.3mg/L的水解乳蛋白、4g/L的牛肉汁、8g/L的活性炭、6.8g/L的琼脂和28g/L的蔗糖，pH为5.4）中进行生根培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用自然光，培养时间为8天；光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为2050lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以得到铁皮石斛的幼苗。
实施例2
1）将铁皮石斛的茎芽（长度为0.4cm）进行消毒（先将所述茎芽置于60重量%酒精水溶液中浸泡30s，接着将其置于3重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3min，最后通过蒸馏水进行清洗3次）以得到外植体；
2）将外植体置于诱导培养基（包括B5培养基、0.8mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.01mg/L的腺嘌呤、0.01mg/L的叶酸、0.04mg/L的维生素B2、6.5g/L的琼脂和25g/L的蔗糖，pH为5.3）中进行诱导培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和蓝光灯同时存在下进行，培养时间为10天；光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1700lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以得到原球茎；
3）将原球茎置于增殖培养基（包括B5培养基、0.2mg/L的6-BA、0.05mg/L的IBA、0.05mg/L的链霉素、15g/L的土豆泥、4g/L的椰汁、6.5g/L的琼脂和25g/L的蔗糖，pH为5.3）中进行增殖培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和紫光灯同时存在下进行，培养时间为15天；光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为2000lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以得到增殖苗；
4）将增殖苗置于生根培养基（包括1/2 B5培养基、0.4mg/L的CPA、0.02mg/L的GA3、0.01mg/L的NAA、0.2mg/L的水解乳蛋白、2g/L的牛肉汁、7g/L的活性炭、6.5g/L的琼脂和25g/L的蔗糖，pH为5.3）中进行生根培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用自然光，培养时间为7天；光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为2000lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以得到铁皮石斛的幼苗。
实施例3
1）将铁皮石斛的茎芽（长度为0.6cm）进行消毒（先将所述茎芽置于70重量%酒精水溶液中浸泡60s，接着将其置于5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡4min，最后通过蒸馏水进行清洗5次）以得到外植体；
2）将外植体置于诱导培养基（包括B5培养基、1.2mg/L的6-BA、0.3mg/L的IAA、0.05mg/L的腺嘌呤、0.03mg/L的叶酸、0.06mg/L的维生素B2、7.0g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.5）中进行诱导培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和蓝光灯同时存在下进行，培养时间为15天；光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为1900lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以得到原球茎；
3）将原球茎置于增殖培养基（包括B5培养基、0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、0.08mg/L的链霉素、20g/L的土豆泥、8g/L的椰汁、7.0g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.5）中进行增殖培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和紫光灯同时存在下进行，培养时间为20天；光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2100lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以得到增殖苗；
4）将增殖苗置于生根培养基（包括1/2 B5培养基、0.8mg/L的CPA、0.06mg/L的GA3、0.05mg/L的NAA、0.4mg/L的水解乳蛋白、6g/L的牛肉汁、10g/L的活性炭、7.0g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.5）中进行生根培养（在光暗交替的情形下进行，光照采用自然光，培养时间为10天；光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2100lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以得到铁皮石斛的幼苗。
对比例1
按照实施例1的方法进行，所不同的是诱导培养基为：包括B5培养基、0.6mg/L的6-BA、0.08mg/L的IAA、0.008mg/L的腺嘌呤、0.008mg/L的叶酸、0.03mg/L的维生素B2、6g/L的琼脂和20g/L的蔗糖。
对比例2
按照实施例1的方法进行，所不同的是诱导培养基为：包括B5培养基、1.3mg/L的6-BA、0.4mg/L的IAA、0.06mg/L的腺嘌呤、0.05mg/L的叶酸、0.07mg/L的维生素B2、7.2g/L的琼脂和32g/L的蔗糖。
对比例3
按照实施例1的方法进行，所不同的是生根培养基为：包括1/2 B5培养基、0.3mg/L的CPA、0.01mg/L的GA3、0.008mg/L的NAA、0.1mg/L的水解乳蛋白、1g/L的牛肉汁、5g/L的活性炭、6g/L的琼脂和20g/L的蔗糖。
对比例4
按照实施例1的方法进行，所不同的是生根培养基为：包括1/2 B5培养基、1mg/L的CPA、0.08mg/L的GA3、0.08mg/L的NAA、0.5mg/L的水解乳蛋白、7g/L的牛肉汁、11g/L的活性炭、8g/L的琼脂和28g/L的蔗糖。
结果统计：
以20cm长度的铁皮石斛带芽茎段分别于上述实施例和对比例中进行试验，然后计算步骤3）中的增殖率以及步骤4）中的成活率，具体结果见表1。
表1
增殖率 成活率%
实施例1 1：45 95
实施例2 1：43 98
实施例3 1：44 96
对比例1 1：8 97
对比例2 1：16 95
对比例3 1：42 48
对比例4 1：43 65
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于，所述组织培养方法包括：
1）将铁皮石斛的茎芽进行消毒以得到外植体；
2）将所述外植体置于诱导培养基中进行诱导培养以得到原球茎；
3）将所述原球茎置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖苗；
4）将所述增殖苗置于生根培养基中进行生根培养以得到铁皮石斛的幼苗；
其中，所述诱导培养基包括B5培养基、0.8-1.2mg/L的6-BA、0.1-0.3mg/L的IAA、0.01-0.05mg/L的腺嘌呤、0.01-0.03mg/L的叶酸、0.04-0.06mg/L的维生素B2；
所述增殖培养基包括B5培养基、0.2-0.5mg/L的6-BA、0.05-0.1mg/L的IBA、0.05-0.08mg/L的链霉素、15-20g/L的土豆泥、4-8g/L的椰汁；
所述生根培养基包括1/2 B5培养基、0.4-0.8mg/L的CPA、0.02-0.06mg/L的GA3、0.01-0.05mg/L的NAA、0.2-0.4mg/L的水解乳蛋白、2-6g/L的牛肉汁、7-10g/L的活性炭。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其中，所述诱导培养基、增殖培养基、生根培养基均满足以下条件：pH为5.3-5.5。
3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其中，所述诱导培养基、增殖培养基、生根培养基的pH的调节采用缓冲溶液的方式进行。
4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其中，所述诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有6.5-7.0g/L的琼脂和25-30g/L的蔗糖。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的组织培养方法，其中，所述诱导培养的条件为：在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和蓝光灯同时存在下进行，培养时间为10-15天；光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1700-1900lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的组织培养方法，其中，所述增殖培养的条件为：在光暗交替的情形下进行，光照采用白炽灯和紫光灯同时存在下进行，培养时间为15-20天；光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2000-2100lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的组织培养方法，其中，所述生根培养的条件为：在光暗交替的情形下进行，光照采用自然光，培养时间为7-10天；光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2000-2100lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
8.根据权利要求1-4中任意一项所述的组织培养方法，其中，在步骤1）中，所述灭菌消毒具体为：先将所述茎芽置于60-70重量%酒精水溶液中浸泡30-60s，接着将其置于3-5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3-4min，最后通过蒸馏水进行清洗3-5次。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤1）中，所述外植体的长度为0.4-0.6cm。
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