CN105684913A - 一种金丝李的组培快繁方法 - Google Patents

一种金丝李的组培快繁方法 Download PDF

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    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明属于组织培养生产技术领域，本发明涉及一种金丝李的组培快繁方法,包括如下步骤：(1)外植体的消毒；(2)愈伤组织培养；(3)愈伤组织分化芽；(4)芽生根：其中，根诱导培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.8-2.5mg/L吲哚乙酸+0.5-1.5mg/L激动素+0.8-1.5mg/L活性炭+0.1-0.5mg/L瑞毒霜+0.5-1.5mg/L复硝酚钠+0.3-0.8mg/L维生素D2+0.15-0.35mg/L微囊藻素。本发明具有能降低繁殖的成本，生长周期短、繁殖率高、方便管理、利于工业化生产和自动化监控大大的节约了人力、物力和田间作物的土地的优点。

Description

一种金丝李的组培快繁方法
技术领域
本发明属于组织培养生产技术领域，本发明涉及一种金丝李的组培快繁方法。
背景技术
金丝李为常绿乔木，树高达30米，胸径可达1.5米以上；树皮灰褐色。圳对生，革质，长椭圆形，长6-18厘米，宽2-6厘米，全缘，先端突尖或短渐尖，钝头，基部宽楔形，侧脉5-8对，在下面明显凸起；叶柄长6-15毫米。花杂性同株；雄花成腋生和顶生的聚伞花序，萼片4，近圆形，花瓣4，卵形，雄蕊多数，花丝短，合生成4裂的环，花药2室，纵裂，退化雌蕊近四棱形，柱头盾状凸起；雌花通常单生于叶腋，比雄花大，柱头盾状，中间隆起，子房圆球形，直径约2.5毫米，具1枚基生胚珠，退化雄蕊的花丝合成4束，短于子房，每束具退化花药6-8。浆果椭圆形或卵状椭圆形，长3.5-5厘米，直径1-2.5厘米，顶端具宿存的半球形柱头，柄长5-8毫米。主要分布于我国广西西南部，中心分布区为左、右江流域的龙州、凭祥、宁明、天等、崇左、大新、靖西、那坡田阳等北热带地区，向东北可延伸至桂中峰丛石山区东缘的忻城，向北可延伸至南亚热带范围的河池、东兰、凤山、田林、西林、巴马、都安、马山等县，不超过北纬25°；云南东南部麻栗坡一带也有分布。垂直分布多在海拔600米以下，最高可达海拔900米。越南北部也有分布。金丝李渐危种，是国家二极保护植物。其分布区狭窄，零星生长，由于过度采伐，大树已不多见。因生于石灰岩山上，种子不易发芽，天然更新不良，已逐渐陷入濒危状态。金丝李是产区石灰岩山地的珍贵树种资源，经济价值很高。木材条纹金黄色，纹理通直，结构密致，材质坚重，容重为0.96g/cm，干燥后有端裂，不变形，耐腐、耐磨、耐水湿性特强且不受虫蛀，古建筑经历百年不朽，为广西著名的四大铁木之一，古代多用于建筑庙宇、桥梁、舰船等，现代多为高级家具、室内装修、模具、器械用材等。根系发达，保持水土的效益高，为石山区的重要造林树种。幼叶鲜红，也可做风景树。通常用种子繁殖，结实大小年现象明显，间隔期为1～2年，开花结实期，各年不很定势，热量较高的地区，开花结实较多，结实期也较长，通常一年开花结实2次，一次为5～8月开花，翌年4～7月果实成熟，另一次为3～4月开花，当年9～11月果实成熟，以6～7月为主要果熟期。果实成熟后，易遭猴、狸等摘食，需及时采集，但采收的果实，要求充分成熟，否则不易去掉果皮果肉，且发芽迟缓，甚至不能发芽。采下的果实，可集中对沤，该草保湿，约经半月，果肉变软或变烂，装入框中置水搓擦冲洗，漂淘去果皮等杂质，勿伤种皮。种子忌失水，防止日晒或裸露存放，已处理的种子，立刻婚湿润沙贮藏。种子约有7～8个月的休眠期，少数种子的休眠期可达1年，不宜随采随播，6～7月采集的种子，沙藏至翌年3～4月播种。种子千粒重为4500g，含水量须保持30％～40％，用条播或点播法。经沙藏催芽的种子，一般播后半月左右发芽，发芽率约65％，另有少数种粒，迟后陆续发芽。种子发芽现象较奇特，胚芽和胚根分别从子叶的两端抽搐，幼苗成长后，子叶不腐烂脱落，变为苗木的基部或主侧根的基部。幼苗生长较缓慢，忌日灼霜冻，需搭棚防护。一般需要培育2年生苗后，方宜出圃混交终止。用于风景绿化，需培育4～5年生大苗，带土团出圃，一般10年生左右，生长较快速。
由此可见金丝李通过直接使用种子播种的方法来繁殖后代，缺点是对种子的保藏要求高，处理要求也很高，繁殖时间长，出苗率低。
发明内容
本发明针对上述存在的问题，提供一种金丝李的组培快繁方法，能降低繁殖的成本，生长周期短、繁殖率高、方便管理、利于工业化生产和自动化监控大大的节约了人力、物力和田间作物的土地。
本发明的方案是通过这样实现的：
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种金丝李的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：采摘6-7月份的金丝李叶，使用20-40％乐果乳剂稀释400-600倍液浸泡5-10min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒5-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，最后使用灭菌滤纸吸干金丝李叶表面的无菌水；
(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金丝李叶的茎干位置横切出长15-18cm，宽10-15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29-31℃下暗培养8-15天，而后转入26-28℃下进行8-15天的暗培养，获得金丝李愈伤组织；
(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.3-0.8mg/L6-苄基嘌呤+0.8-1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0-7.5，于25-28℃条件下，光暗培养30-45天后愈伤组织分化出芽；
(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5-6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.8-2.5mg/L吲哚乙酸+0.5-1.5mg/L激动素+0.8-1.5mg/L活性炭+0.1-0.5mg/L瑞毒霜+0.5-1.5mg/L复硝酚钠+0.3-0.8mg/L维生素D2+0.15-0.35mg/L微囊藻素，于25-28℃条件下，光暗培养20-30天，培养出幼苗，组培结束。
在本发明中，作为进一步说明，所述每个培养皿放入3-5片的叶条片。
在本发明中，作为进一步说明，所述愈伤组织培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.3-0.8mg/L6-苄基嘌呤+0.8-1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5-7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在121-130℃、1.1-1.5kg/cm2条件下进行灭菌30-50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中。
在本发明中，作为进一步说明，所述培养皿的规格为90×15mm；所述装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3-1/2。
在本发明中，作为进一步说明，所述步骤(3)和步骤(4)中的光暗培养周期为光培养12h，暗培养4h。
在本发明中，作为进一步说明，所述光培养的光照强度为1500-1700勒克斯。
在本发明中，作为进一步说明，所述金丝李叶为颜色嫩绿、完整、无病虫害；金丝李叶的采摘时间为晚上1-2点。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明通过在金丝李生根阶段添加了组合配方提供金丝李生根壮苗所需的因子，能够提供金丝李的良好生根条件，经过研究发现采用本发明的生根配方，能够快速促进金丝李种子细胞的分裂，加快出芽时间，且能保证芽苗健康成长，无病害，颜色油绿，芽肉厚度饱满，出芽率达到100％。其中分裂素需要在生长素存在的情况下才嫩给发挥作用，复配上的为激动素分裂素、吲哚乙酸为生长素相互作用，保证激动素在有生长素的情况下充分发挥其作用，吲哚乙酸能够调控植物维管组织的分化、育性，还可以与其他激素相互作用；微囊藻素中富含有活性氧，植物中低浓度的活性氧作为第二信使能在植物细胞信号转导途径中介导多种应答反应，但是高浓度的活性氧则引起生物大分子的氧化损伤甚至细胞死亡，经过试验研究在配方中添加微囊藻素0.15-0.35mg/L，保证能够提供给植物低浓度的活性氧，不会损伤细胞，起到第二信使的作用，促进赤霉素流向植物系统，促进生长素流向植物系统，使得根向地性更好，促进直根系生长；复配上的维生素D2具有能够，能诱导形成不定根，调节生长、促进生根，但是其的渗透力较差，需要借助外力将其带动流向植物全身，使其能够快速发挥作用；复硝酚钠能够与植物接触后能迅速渗透到植物体内，促进细胞的原生质流动，提高细胞活力，维生素D2在复硝酚钠的带动下也能迅速的渗透至植物体内；在组培过程中往往会出现黄化现象，一般两个原因，细胞活性不足死亡和病菌感染死亡，瑞毒霜的复配添加能够有效的抑制病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀死病菌，又能促进植物生长；并具有促进作物根系生长发育、生根壮苗，提且其渗透率极高，两个小时就能移动到茎部，保证了金丝李在第一时间上拥有健康的培养环境，提高金丝李的成活率。
2.本发明利用深夜的金丝李叶进行组培，为金丝李叶进行愈伤组织培养提供良好的条件，能够快速使金丝李叶形成金丝李叶愈伤组织，进而减少了组培的时间。
3.本发明形成金丝李叶愈伤组织后发芽、生根都进行光暗培养，不仅仅通过光培养促进金丝李叶愈伤组织形成叶绿素，进行光合作用合成能源提供生长所需能量，而且通过暗培养促进其进行呼吸作用，物质转换，促进生长。
4.本发明光培养使用的是较弱的光照强度，不仅提高了金丝李组培的增殖倍数，缩短周期培养的时间，且采用弱光的光培养能够减少日光灯补光时产生的电耗和产生的热量，减少降温所需的费用，因此采用此方法可提高生产效率，降低生产成本，有利产业的发展，通过本发明的方法金丝李的发芽率达到70％以上。
5.本发明的方法有利于工业化生产和自动化监控，大大的节约了人力、物力和田间作物的土地；在金丝李苗栽培生产领域中具有极大的推广价值。
【具体实施方式】
实施例1：
一种金丝李的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：在6月份晚上1点采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金丝李叶，使用20％乐果乳剂稀释400倍液浸泡5min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒5min，然后用无菌水冲洗3次，最后使用灭菌滤纸吸干金丝李叶表面的无菌水；
(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金丝李叶的茎干位置横切出长15cm，宽10cm的叶条片，将3片叶条片放入已经装入是培养皿1/3体积的愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29℃下暗培养8天，而后转入26℃下进行8天的暗培养，获得金丝李愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.3mg/L6-苄基嘌呤+0.8mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5；将培养基放入高温灭菌锅，在121℃、1.1kg/cm2条件下进行灭菌30min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中；
(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.3mg/L6-苄基嘌呤+0.8mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0，于25℃条件下，光暗培养30天后愈伤组织分化出芽，光培养：暗培养周期为3:1，光照强度为1500勒克斯；
(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.8mg/L吲哚乙酸+0.5mg/L激动素+0.8mg/L活性炭+0.1mg/L瑞毒霜+0.5mg/L复硝酚钠+0.3mg/L维生素D2+0.15mg/L微囊藻素，于25℃条件下，光暗培养20天，光培养：暗培养周期为3:1，光照强度为1700勒克斯，培养出幼苗，组培结束。
实施例2：
一种金丝李的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：在7月份晚上2点采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金丝李叶，使用40％乐果乳剂稀释600倍液浸泡10min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒10min，然后用无菌水冲洗5次，最后使用灭菌滤纸吸干金丝李叶表面的无菌水；
(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金丝李叶的茎干位置横切出长18cm，宽15cm的叶条片，将5片叶条片放入已经装入是培养皿1/2体积的愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在31℃下暗培养15天，而后转入28℃下进行15天的暗培养，获得金丝李愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+0.8mg/L6-苄基嘌呤+1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在130℃、1.5kg/cm2条件下进行灭菌50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中；
(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+0.8mg/L6-苄基嘌呤+1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为7.5，于28℃条件下，光暗培养45天后愈伤组织分化出芽，光培养：暗培养周期为3:1，光照强度为1700勒克斯；
(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+2.5mg/L吲哚乙酸+1.5mg/L激动素+1.5mg/L活性炭+0.5mg/L瑞毒霜+1.5mg/L复硝酚钠+0.8mg/L维生素D2+0.35mg/L微囊藻素，于28℃条件下，光暗培养30天，光培养：暗培养周期为3:1，光照强度为1700勒克斯培养出幼苗，组培结束。
实施例3：
一种金丝李的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：在6月份晚上1点采摘颜色嫩绿、完整、无病虫害的金丝李叶，使用30％乐果乳剂稀释500倍液浸泡8min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒8min，然后用无菌水冲洗4次，最后使用灭菌滤纸吸干金丝李叶表面的无菌水；
(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金丝李叶的茎干位置横切出长17cm，宽13cm的叶条片，将4片叶条片放入已经装入是培养皿1/3体积的愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在30℃下暗培养10天，而后转入27℃下进行12天的暗培养，获得金丝李愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.6mg/L6-苄基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.8；将培养基放入高温灭菌锅，在128℃、1.3kg/cm2条件下进行灭菌40min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中；
(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.6mg/L6-苄基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5，于26℃条件下，光暗培养41天后愈伤组织分化出芽，光培养：暗培养周期为3:1，光照强度为1650勒克斯；
(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5.5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6.5g/L琼脂+26g/L蔗糖+1.8mg/L吲哚乙酸+0.9mg/L激动素+1.0mg/L活性炭+0.3mg/L瑞毒霜+0.8mg/L复硝酚钠+0.6mg/L维生素D2+0.26mg/L微囊藻素，于27℃条件下，光暗培养28天，光培养：暗培养周期为3:1，光照强度为1600勒克斯，培养出幼苗，组培结束。
实施例4：
根诱导培养基的配方不含瑞毒霜+复硝酚钠+维生素D2微囊藻素，其余与实施例1相同。
实施例5：
根诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.8mg/L吲哚乙酸+0.5mg/L激动素+0.8mg/L活性炭+0.5mg/L瑞毒霜+1.5mg/L复硝酚钠+0.8mg/L维生素D2+0.40mg/L微囊藻素；其余与实施例1相同。
试验例：将实施例1-5的方法操作，直至出苗后观察统计金丝李生根和生长情况，并记录生根条数、根粗、生根率，结果见表1；
表1各个实施例金丝李的生长情况
试验组 生根率％ 平均根数(条) 根粗(cm)
实施例1 100 29.8 0.19
实施例2 100 28.5 0.18
实施例3 100 31.0 0.20
实施例4 100 19.8 0.15
实施例5 56 8.4 0.09
由上表可知，通过采用本发明的的技术方案(实施例1-3)，的生根率达到100％，平均根数和根粗也优于其他实施例，且实施例3为最佳效果配方。实施例4中没有添加瑞毒霜+复硝酚钠+维生素D2+微囊藻素，其他条件均与本发明实施例1技术方案相同，其生根率也达到100％，但是根数和根粗均比实施例1-3要低；实施例5，增加了瑞毒霜+复硝酚钠+维生素D2微囊藻素的含量且超过本发明中的上限值含量，不仅没有起到生根壮苗的效果，反而严重的影响了金丝李的生长，使得细胞死亡，金丝李黄化发育不良，影响生根率，根数与根粗与实施例1-3降低了50％以上。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.一种金丝李的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：采摘6-7月份的金丝李叶，使用20-40％乐果乳剂稀释400-600倍液浸泡5-10min，取出后放入超净工作台使用4％维生素C水溶液浸泡30min后再3％的次氯酸进行消毒5-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，最后使用灭菌滤纸吸干金丝李叶表面的无菌水；
(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着金丝李叶的茎干位置横切出长15-18cm，宽10-15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29-31℃下暗培养8-15天，而后转入26-28℃下进行8-15天的暗培养，获得金丝李愈伤组织；
(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.3-0.8mg/L6-苄基嘌呤+0.8-1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.0-7.5，于25-28℃条件下，光暗培养30-45天后愈伤组织分化出芽；
(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5-6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.8-2.5mg/L吲哚乙酸+0.5-1.5mg/L激动素+0.8-1.5mg/L活性炭+0.1-0.5mg/L瑞毒霜+0.5-1.5mg/L复硝酚钠+0.3-0.8mg/L维生素D2+0.15-0.35mg/L微囊藻素，于25-28℃条件下，光暗培养20-30天，培养出幼苗，组培结束。
2.根据权利要求1所述的金丝李的组培快繁方法，其特征在于，所述每个培养皿放入3-5片的叶条片。
3.根据权利要求1所述的金丝李的组培快繁方法，其特征在于，所述愈伤组织培养基的配方为MS+6-8g/L琼脂+25-29g/L蔗糖+0.3-0.8mg/L6-苄基嘌呤+0.8-1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5-7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在121-130℃、1.1-1.5kg/cm2条件下进行灭菌30-50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中。
4.根据权利要求1所述的金丝李的组培快繁方法，其特征在于，所述培养皿的规格为90×15mm；所述装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3-1/2。
5.根据权利要求1所述的金丝李的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中的光暗培养周期为光培养12h，暗培养4h。
6.根据权利要求1所述的金丝李的组培快繁方法，其特征在于，所述光培养的光照强度为1500-1700勒克斯。
7.根据权利要求1所述的金丝李的组培快繁方法，其特征在于，所述金丝李叶为颜色嫩绿、完整、无病虫害；金丝李叶的采摘时间为晚上1-2点。
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