CN115005105A - 一种蓝莓组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蓝莓组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明包括以下步骤：外植体诱导培养，增殖培养，壮苗培养及生根培养；其中，所述生根培养为瓶外生根培养，包括：将经过壮苗培养的组培苗切成茎段，用海藻素浸泡后扦插入苔藓中生根培养。本发明将传统蓝莓组织培养中的瓶内生根培养调整为瓶外生根培养，提升了蓝莓组织培养过程中的生根率，繁育周期短，组培苗强壮，移栽成活率高，大幅度提升了蓝莓组织培养的繁殖效率。

Description

一种蓝莓组织培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种蓝莓组织培养方法。
背景技术
蓝莓，学名越橘，属杜鹃花科越橘属灌木，果实为浆果，风味独特，营养丰富，并具有独特的营养保健价值，被誉为“浆果之王”。国际粮农组织将其列为人类5大健康食品之一。近年来我国蓝莓产业发展迅速，2020年栽培面积和产量分别为6.0147万hm2、28.505万t，在全球的占比分别为29.24％、20.54％，均位列全球首位。
蓝莓产业的发展带动了苗木市场的繁荣，但生产中蓝莓繁殖仍以传统的扦插为主，与组织培养繁育的苗木相比，繁殖速度较慢，品种容易退化，植株成龄后树势较弱，产量较低。要使之形成国内支柱产业参与国际市场竞争，应建立蓝莓良种快速繁殖体系，以支撑蓝莓产业化发展需要。同时，蓝莓属木本植物，组培培养中瓶内生根较为困难，且生根率低、发根周期长，成为制约蓝莓组培快繁体系的限制因素，因此，如何改善蓝莓组织培养中的生根培养过程，并提出一套完整的蓝莓组织培养繁殖体系，是当前蓝莓繁殖产业需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蓝莓组织培养方法，通过瓶外培养生根，相较于传统的瓶内生根，高效省时，生根率高，苗木健壮，移栽后成活率高，克服了常规组培方法繁殖系数低的缺点。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种蓝莓组织培养方法，包括外植体诱导培养，增殖培养，壮苗培养及生根培养；所述生根培养为瓶外生根培养，包括：将经过壮苗培养的组培苗切成茎段，用海藻素浸泡后扦插入苔藓中生根培养。
优选的是，诱导培养基组成为WPM+ZT 1.5-2.2mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L。
优选的是，增殖培养基组成为WPM+ZT 0.6-1.5mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L。
优选的是，壮苗培养基组成为WPM+ZT 0.25-0.5mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L。
优选的是，所述诱导培养，增殖培养和壮苗培养的培养条件为：温度为23℃-25℃，光照强度为1500-2500lx，光照周期为14h/10h。
优选的是，所述经过壮苗培养的组培苗生长至3-5cm，进行生根培养。
优选的是，所述生根培养时，茎段长度为1.5-2.5cm。
优选的是，所述茎段用1500-2500倍液的海藻素浸泡3-5min。
优选的是，所述苔藓厚度为4-6cm，扦插深度为0.8-1.5cm。
优选的是，所述生根培养的培养条件为：扣小拱棚和遮阳网，棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种蓝莓组织培养方法，将传统蓝莓组织培养中的瓶内生根培养调整为瓶外生根培养，提升了蓝莓组织培养过程中的生根率，由60％以上提升至90％以上，繁育周期短，仅30d左右组培苗即可生根，且组培苗苗木强壮，移栽成活率高，大幅度提升了蓝莓组织培养的繁殖效率。
具体实施方式
本发明提供了一种蓝莓组织培养方法，包括外植体诱导培养，增殖培养，壮苗培养及生根培养；所述生根培养为瓶外生根培养，包括：将经过壮苗培养的组培苗切成茎段，用海藻素浸泡后扦插入苔藓中生根培养。本发明将常规瓶内生根调整为瓶外生根，大幅缩短了生根时间，提高了生根率，根数、根长等性状也明显优于常规瓶内生根方法，明显提高了繁殖系数。
本发明蓝莓组织培养方法适用于‘密斯梯’等蓝莓品种。
本发明优选蓝莓组织培养的外植体为带单个腋芽的茎段，进一步优选茎段长度为1-2cm，更优选茎段长度为1.5cm。
本发明优选带腋芽茎段来源于春季新萌发半木质化枝条，或秋季刚停长封顶的枝条。更优选，枝条在春、秋两季的晴天、阳光充足的上午9点-10点的日光温室(或其他设施)中采集。在温室或其他设施中采集枝条，相较于露地栽植的蓝莓，携带有少的病原菌，组织培养过程中污染率低。
生长条件下采集的外植体都携带有病原菌，影响组织培养的成活率，因此，需要对外植体进行消毒；另外，不适宜的消毒方法也会对外植体造成损伤，影响组织培养进行。本发明优选外植体消毒方法包括：用流水冲洗外植体2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒60s后，用无菌水荡洗1-2次，然后用0.15％HgCl2消毒，浸泡3-7min；进一步优选HgCl2浸泡4-6min；更优选5min。此消毒方法能够保证外植体较低的污染率，且对腋芽损伤较小。
本发明优选诱导培养基组成为WPM+ZT 1.5-2.2mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L；进一步优选WPM+ZT 1.8-2.0mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L；更优选WPM+ZT 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L。
本发明优选增殖培养基组成为WPM+ZT 0.6-1.5mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L；进一步优选WPM+ZT 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L。本发明优选增殖培养过程中，当组培苗长至3-5cm时剪成1.5-2cm的茎段，每堆3-5个茎段，每瓶6堆，35-45d转接一次；进一步优选当组培苗长至4cm时剪成2cm的茎段，每堆4个茎段，每瓶6堆，40d转接一次。
本发明优选壮苗培养基组成为WPM+ZT 0.25-0.5mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L；进一步优选WPM+ZT 0.3-0.4mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L；更优选WPM+ZT 0.3mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L。
本发明优选诱导培养，增殖培养和壮苗培养的培养条件为：温度为23℃-25℃，光照强度为1500-2500lx，光照周期为14h/10h；进一步优选温度23.5-24.5℃，光照强度1800-2200lx；更优选温度24℃，光照强度2000lx。
本发明优选经过壮苗培养的组培苗生长至3-5cm，进行生根培养；进一步优选待组培苗生长4cm，进行生根培养。
本发明优选生根培养时，将组培苗切成长度为1.5-2.5cm的茎段；进一步优选茎段长度1.8-2.2cm；更优选2cm。本发明优选分切茎段时，将组培苗的茎尖段、茎中段和茎末段分别收集、分别扦插，以保证各茎段生长的一致性，便于之后的统一管理，提供成活率、降低成本。
本发明优选茎段用1500-2500倍液的海藻素浸泡3-5min；进一步优选用2000倍液海藻素浸泡4min。海藻素是一种海藻提炼、浓缩的植物营养液，还含有植物生长调节素，本发明通过海藻素处理，明显促进了组培茎段扦插生根。
本发明优选扦插时，苔藓厚度为4-6cm，进一步优选厚度为5cm，更优选苔藓下部铺设厚度2-4cm的草炭；扦插深度为0.8-1.5cm，进一步优选1.0-1.2cm，更优选1cm。扦插密度根据实际需求确定，作为一种可实施方式，本发明扦插株行距为2cm×2cm。
本发明优选瓶外生根培养时的培养条件为：扣小拱棚和遮阳网，棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％；进一步优选温度控制在白天25℃，夜间10℃，相对湿度85％。作为一种可实施方式，本发明根据天气情况揭、盖遮阳网，根据幼苗生长情况补充营养液，根据病虫害发生情况采取相应防治措施。
本发明优选1-2个月后，待组培苗根群形成、且底芽枝抽生时，进行组培苗移栽。优选将生根苗移栽入营养钵中，基质为草炭、田园土和有机肥，并经过调酸处理，适宜蓝莓生长，并加强水肥管理。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种蓝莓组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的采集及处理
在春季、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室栽植的蓝莓的新萌发半木质化枝条，去除叶片，剪成1.5cm含单个腋芽的茎段，再用流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒60s后，用无菌水荡洗1-2次，然后用0.15％HgCl2消毒5min；
(2)诱导培养
消毒处理后接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为WPM+ZT 2.0mg/L+IBA0.2mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L，培养室温度24℃，光照强度2000lx，光照14h，黑暗10h；
(3)增殖培养
将诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为WPM+ZT 1.0mg/L+IBA0.2mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L，培养条件同上，当组培苗长至4cm时剪成2cm的茎段，每堆4个茎段，每瓶6堆，40d转接一次；
(4)壮苗培养
将增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为WPM+ZT 0.3mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L，培养条件同上，每瓶15个茎段；
(5)瓶外生根培养
经壮苗培养的组培苗苗高长至3-5cm时，将组培苗剪成2cm的茎段，剪时需将组培苗的茎尖段、茎中段和茎末段分别收集、分别扦插，以保证各茎段生长的一致性，便于之后的统一管理，提供成活率、降低成本。将剪好的茎段用2000倍液的海澡素浸泡4min，移栽到浸泡、消毒好并压实的苔藓中，苔藓厚5cm，苔藓下层铺3cm草炭。扦插时根据实际情况设置扦插密度(2cm×2cm)，扦插深度1cm。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天25℃，夜间10℃，相对湿度85％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长；
(6)移栽
1.5-2月后，待根群形成、底芽枝抽生时，将穴盘苗移栽于营养钵中，基质为草炭、田园土、掺有机肥并完成调酸处理。加强水和营养液供应，促植株生长。
实施例2
一种蓝莓组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的采集及处理
在秋季、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室栽植的蓝莓的刚停长封顶的枝条，去除叶片，剪成1.0cm含单个腋芽的茎段，再用流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒60s后，用无菌水荡洗1-2次，然后用0.15％HgCl2消毒4min；
(2)诱导培养
消毒处理后接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为WPM+ZT 1.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖32g/L+琼脂4.5g/L，培养室温度23℃，光照强度1500lx，光照14h，黑暗10h；
(3)增殖培养
将诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为WPM+ZT 0.6mg/L+IBA0.1mg/L+糖32g/L+琼脂4.5g/L，培养条件同上，当组培苗长至3cm时剪成1.5cm的茎段，每堆5个茎段，每瓶6堆，35d转接一次；
(4)壮苗培养
将增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为WPM+ZT 0.25mg/L+IBA0.1mg/L+糖32g/L+琼脂4.5g/L，培养条件同上，每瓶15个茎段；
(5)瓶外生根培养
经壮苗培养的组培苗苗高长至3cm时，将组培苗剪成1.5cm的茎段，剪时需将组培苗的茎尖段、茎中段和茎末段分别收集、分别扦插，以保证各茎段生长的一致性，便于之后的统一管理，提供成活率、降低成本。将剪好的茎段用1500倍液的海澡素浸泡5min，移栽到浸泡、消毒好并压实的苔藓中，苔藓厚4cm，苔藓下层铺2cm草炭。扦插时根据实际情况设置扦插密度(2cm×2cm)，扦插深度0.8cm。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天22℃，夜间7℃，相对湿度90％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长；
(6)移栽
1.5-2月后，待根群形成、底芽枝抽生时，将穴盘苗移栽于营养钵中，基质为草炭、田园土、掺有机肥并完成调酸处理。加强水和营养液供应，促植株生长。
实施例3
一种蓝莓组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的采集及处理
在春季、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室栽植的蓝莓的新萌发半木质化枝条，去除叶片，剪成2.0cm含单个腋芽的茎段，再用流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒60s后，用无菌水荡洗1-2次，然后用0.15％HgCl2消毒6min；
(2)诱导培养
消毒处理后接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为WPM+ZT 2.2mg/L+IBA0.2mg/L+糖35g/L+琼脂5.0g/L，培养室温度25℃，光照强度2500lx，光照14h，黑暗10h；
(3)增殖培养
将诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为WPM+ZT 1.5mg/L+IBA0.2mg/L+糖35g/L+琼脂5.0g/L，培养条件同上，当组培苗长至5cm时剪成1.5cm和2cm的茎段，每堆3个茎段，每瓶6堆，45d转接一次；
(4)壮苗培养
将增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为WPM+ZT 0.5mg/L+IBA0.2mg/L+糖35g/L+琼脂5.0g/L，培养条件同上，每瓶15个茎段；
(5)瓶外生根培养
经壮苗培养的组培苗苗高长至5cm时，将组培苗剪成1.5cm和2cm的茎段，剪时需将组培苗的茎尖段、茎中段和茎末段分别收集、分别扦插，以保证各茎段生长的一致性，便于之后的统一管理，提供成活率、降低成本。将剪好的茎段用2500倍液的海澡素浸泡3min，移栽到浸泡、消毒好并压实的苔藓中，苔藓厚6cm，苔藓下层铺5cm草炭。扦插时根据实际情况设置扦插密度(2cm×2cm)，扦插深度0.8-1.2cm。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天27℃，夜间14℃，相对湿度80％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长；
(6)移栽
1.5-2月后，待根群形成、底芽枝抽生时，将穴盘苗移栽于营养钵中，基质为草炭、田园土、掺有机肥并完成调酸处理。加强水和营养液供应，促植株生长。
实施例4
取样地点和消毒方法对蓝莓诱导培养污染率的影响
以‘密斯梯’蓝莓为试材。
在春季的晴天、阳光充足的上午9点～10点采集日光温室栽植及露地的蓝莓枝条，选择新萌发半木质化枝条作为外植体材料，去除叶片，剪成1.5cm含单个腋芽的茎段，再用流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒60s后，用无菌水荡洗1-2次。然后用0.15％HgCl2消毒，时间设3，5，7，9min，每个处理10个茎段，无菌水荡洗3次，三次重复。2周后观察培养效果。根据表1和表2可以看出，在温室内采集枝条外植体、选择0.15％HgCl2消毒5min能够有效降低外植体组织培养污染率，且能够避免外植体受损。
表1日光温室栽植对蓝莓外植体诱导培养污染率的影响
Figure BDA0003764466080000081
实施例5
诱导培养基激素浓度对蓝莓诱导效果的影响
按照实施例4处理方法处理后，将消毒的外植体接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为WPM+ZT(1.5-2.2)mg/L+IBA 0.2mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L，培养室温度23℃-25℃，光照强度1500-2500lx，光照14h，黑暗10h。对照诱导培养基为WPM+ZT(0.3-1.0)mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L。培养30d时开始调查统计相关数据。
表3诱导培养基对蓝莓诱导培养效果的影响
Figure BDA0003764466080000091
根据表3可以看出，在诱导培养阶段，增加诱导培养基中的ZT和IBA至适宜浓度，对诱导萌芽时间和出芽质量没有影响，但能够明显提升萌芽率，提高出芽数量。
实施例6
增殖培养基激素浓度对蓝莓增殖效果的影响
将实施例5诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为WPM+ZT(0.6-1.5)mg/L+IBA 0.2mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L，当组培苗长至3-5cm时剪成1.5-2cm的茎段，每堆3-5个茎段，每瓶6堆，35-45d转接一次，培养条件同上。对照选择诱导培养基为WPM+ZT(0.3-1.0)mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L。培养45d时开始调查相关数据。
表4增殖培养基对蓝莓组培苗增殖效果的影响
Figure BDA0003764466080000092
根据表4可以看出，在增殖培养阶段，适宜的激素浓度能够明显提升蓝莓组织培养的增殖系数，并提升了组培苗的生长性状，能够明显提升蓝莓无性繁殖的效率。
实施例7
壮苗培养基对蓝莓组培苗壮苗培养效果的影响
将实施例6增殖培养后的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为WPM+ZT(0.25-0.5)mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L，培养条件同上，每瓶15个茎段。对照培养基WPM+ZT(0.1-0.2)mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.6g/L。培养40d时开始调查相关数据。
表5壮苗培养基对蓝莓组培苗壮苗培养效果的影响
Figure BDA0003764466080000101
根据表5可以看出，在壮苗培养阶段，适宜的激素浓度能够提升组培苗株高及长势，利于后续生根培养时组培苗生根，提高成活率。
实施例8
瓶外生根对蓝莓组培苗生根效果的影响
实施例7壮苗培养的组培苗苗高长至3-5cm时，将组培苗剪成2cm的茎段，剪时需将组培苗的茎尖段、茎中段和茎末段分别收集、分别扦插，以保证各茎段生长的一致性，便于之后的统一管理，提供成活率、降低成本。将剪好的茎段用2000倍液的海澡素浸泡3-5min，移栽到浸泡、消毒好并压实的苔藓中，苔藓厚5cm，苔藓下层铺3cm草炭。扦插时，根据实际情况设置扦插密度为2cm×2cm，扦插深度1cm左右。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长。设置对照瓶内生根培养基：1/2WPM+IBA 0.5mg/L+NAA(0.1-0.15)mg/L+糖15g/L+琼脂4.6g/L。45d时开始测定瓶外生根相关数据，75d时开始测定瓶内生根相关数据。
表6瓶外生根对蓝莓组培苗生根效果的影响
Figure BDA0003764466080000102
Figure BDA0003764466080000111
根据表6可以看出，瓶外生根培养明显优于常规瓶内生根培养，生根率达到90％以上，生根时间提前40d以上，缩短了繁育周期；生根量、根长及根质量也明显优于瓶内生根培养，利于移栽后幼苗成活，提升繁殖效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蓝莓组织培养方法，其特征在于，包括外植体诱导培养，增殖培养，壮苗培养及生根培养；
所述生根培养为瓶外生根培养，包括：将经过壮苗培养的组培苗切成茎段，用海藻素浸泡后扦插入苔藓中生根培养。
2.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，诱导培养基组成为WPM+ZT1.5-2.2mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L。
3.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，增殖培养基组成为WPM+ZT0.6-1.5mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L。
4.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，壮苗培养基组成为WPM+ZT0.25-0.5mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.5-5.0g/L。
5.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养，增殖培养和壮苗培养的培养条件为：温度为23℃-25℃，光照强度为1500-2500lx，光照周期为14h/10h。
6.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，所述经过壮苗培养的组培苗生长至3-5cm，进行生根培养。
7.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，所述生根培养时，茎段长度为1.5-2.5cm。
8.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，所述茎段用1500-2500倍液的海藻素浸泡3-5min。
9.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，所述苔藓厚度为4-6cm，扦插深度为0.8-1.5cm。
10.根据权利要求1所述的蓝莓组织培养方法，其特征在于，所述生根培养的培养条件为：扣小拱棚和遮阳网，棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％。
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