CN104871970A - 一种珙桐的组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种珙桐的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外植体的消毒；(2)愈伤组织培养；(3)愈伤组织分化芽；(4)芽生根。本发明提供一种珙桐的组培快繁方法，能降低繁殖的成本，生长周期短、繁殖率高、方便管理、利于工业化生产和自动化监控大大的节约了人力、物力和田间作物的土地。

Description

一种珙桐的组培快繁方法

技术领域

本发明属于组织培养生产技术领域，本发明涉及一种珙桐的组培快繁方法。

背景技术

珙桐为落叶乔木。可生长到15～25米高，叶子广卵形，边缘有锯齿。本科植物只有一属两种，两种相似，只是一种叶面有毛，另一种光叶珙桐是光面。色花奇美，是1000万年前新生代第三纪留下的孑遗植物，在第四纪冰川时期，大部分地区的珙桐相继灭绝，只有在中国南方的一些地区幸存下来，洛阳绿诚农业已规模化繁育及种植成功。成为了植物界今天的“活化石”，被誉为“中国的鸽子树”，又称“鸽子花树”、“水梨子”，野生种只生长在中国西南四川省和中部湖北省和周边地区。

珙桐有“植物活化石”之称，是国家8种一级重点保护植物中的珍品，因其花形酷似展翅飞翔的白鸽而被西方植物学家命名为“中国鸽子树”。由于森林的砍伐破坏及挖掘野生苗栽植，数量较少，分布范围也日益缩小，若不采取保护措施，有被其它阔叶树种更替的危险。珙桐是距今6000万年前新生代第三纪古热带植物区系的孑遗种。其不仅仅具有观赏价值：珙桐为世界著名的珍贵观赏树，常植于池畔、溪旁及疗养所、宾馆、展览馆附近，并有和平的象征意义；而且具有经济价值：材质沉重，是建筑的上等用材，可制作家具和作雕刻材料。有的分布区虽已建自然保护区，但无严格保护措施，在其它分布区也应设置保护点，应制定具体的保护管理措施，积极开展引种栽培和繁殖试验，进行人工造林，扩大其分布区。

但是通过嫁接、移栽的方法来保护珙桐的数量，缺点是见效时间长，试验成苗率低，繁殖珙桐现阶段主要用无性繁殖：其方法为：育苗用一年生枝条做插穗，长15～20厘米，直径0.3厘米以上，每个插穗上至少要有2个节间、2个芽，切口平滑不伤皮。3月上旬，在土壤刚化冻、芽萌动前扦插。插前细致整地，施足基肥，使土壤疏松、水分充足。行距20厘米，株距10厘米。以直插为主，插条深度因环境条件而异。过深土壤氧气不足，不利于插穗生根；过浅枝条外露多，蒸发量大，插穗易失水干枯。如在扦插时气候寒冷而干燥，插后上端应适当覆土；在温暖、湿润条件下，上面第一个芽子微露地表即可。由于枝条有极性现象，扦插时，切勿倒插。插后要踏实，使插穗和土壤密接，严防插穗下端蹬空，插后立印灌透水。插穗成活后，要适时灌溉、松土、除草、施肥和防治病虫。扦插育苗成苗率在60％左右。扦插前若用ABT生根粉对插穗进行处理，成苗率可提高10～20％。缺点是无性繁殖需要的原料还是直接来源于珙桐树本身，珙桐的价格本来就昂贵，取材为直接的珙桐，不仅成本高，而且试验的风险大，无性繁殖的条件要求高，成苗率低。

发明内容

本发明针对上述存在的问题，提供一种珙桐的组培快繁方法，能降低繁殖的成本，生长周期短、繁殖率高、方便管理、利于工业化生产和自动化监控大大的节约了人力、物力和田间作物的土地。

本发明的方案是通过这样实现的：

一种珙桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：采摘8～9月份的珙桐叶，使用80％～90％的敌百虫稀释1000倍液浸泡5～10min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒5～10min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；使用敌百虫对刚采摘的珙桐叶进行消毒，能将珙桐叶上的害虫爬行过后残留下的有害液体去除，然后使用维生素C浸泡再用次氯酸消毒不仅能有效延缓外植体褐化时间和保持外植体活力，而且能将珙桐叶上的细菌杀死，再使用无菌水冲洗，确保珙桐叶上其他液体无残留，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水，以防将珙桐叶放入愈伤组织培养基中对培养基有稀释作用。

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长15～18cm，宽10～15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29～31℃下暗培养8～15天，而后转入26～28℃下进行8～15天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；采用光暗培养的方式，暗培养的时间原大于光培养，可以避免珙桐叶修复期间过多的光照使其进行光合作用生成糖类，失去珙桐叶体内的一部分物质和能量，使得完成修复过程的物质和能量的总量减少，造成形成愈伤组织的时间变慢。

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.3～0.8mg/L 6-苄基嘌呤+0.8～1.5mg/L活性炭，调节培养基的pH值为6.5～7.0，于25～28℃条件下，光暗培养30～45天后愈伤组织分化出芽；添加6-苄基嘌呤在培养基中具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能。

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5～6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.8～2.5mg/L吲哚乙酸+0.5～1.5mg/L萘乙酸+0.8～1.5mg/L活性炭，于25～28℃条件下，光暗培养20～30天，培养出幼苗，组培结束。采用萘乙酸为培养基其中之一的添加物质能够促进细胞分裂和扩大，可诱导生根；而抗褐化剂活性炭可降低组培过程中外植体、原球茎和丛生芽产生褐化，目前已达到外植体初诱导、原球茎继代增殖褐化率控制在15％以下，丛生芽生根诱导褐化率低于5％以下。

本发明中，作为进一步说明，所述每个培养皿放入3～5片的叶条片。适当放入叶条片能保证每条叶条片能充分的吸收足量的养分，防止养分不足造成培养失败，即提高繁殖率。

本发明中，作为进一步说明，所述愈伤组织培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖，调节培养基的pH值为6.5～7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在121～130℃、1.1～1.5kg/cm²条件下进行灭菌30～50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中。

本发明中，作为进一步说明，所述培养皿的规格为90×15mm；所述装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3～1/2。采用直接倾倒的方法，相比使用量筒量取定量的培养基，具有快速，简便的优点。

本发明中，作为进一步说明，所述步骤(3)和步骤(4)中的光暗培养周期为光培养16～18h，暗培养6～8h。在愈伤组织发芽和生根期间，需要吸收足够的光源来形成叶绿素继而能通过吸收光源来完成光合作用，光合作用能够合成能源，补充生长所需的能量。

本发明中，作为进一步说明，所述光培养的光照强度为1700-2000勒克斯。采用这一光照强度属于较弱光的光培养，提高了珙桐组培的增殖倍数，缩短周期培养的时间，且采用较弱光的光培养能够减少日光灯补光时产生的电耗和产生的热量，减少降温所需的费用，因此采用此方法可提高生产效率，降低生产成本，有利产业的发展。

本发明中，作为进一步说明，所述珙桐叶为颜色嫩绿、完整、无病虫害；珙桐叶的采摘时间为晚上1～2点。在深夜对珙桐叶进行采摘，深夜的珙桐叶已经停止进行光合作用，但是还是进行呼吸作用，消耗了体内的淀粉，为珙桐叶进行愈伤组织培养提供良好的条件，减少形成愈伤组织的时间。与现有技术中先采摘叶片后进行暗培养一段时间后再进行愈伤组织培养的工序更加简单。

本发明的突出的实质性特点和显著进步是：

1.本发明利用深夜的珙桐叶进行组培，为珙桐叶进行愈伤组织培养提供良好的条件，能够快速使珙桐叶形成珙桐叶愈伤组织，进而减少了组培的时间。

2.本发明形成珙桐叶愈伤组织后发芽、生根都进行光暗培养，不仅仅通过光培养促进珙桐叶愈伤组织形成叶绿素，进行光合作用合成能源提供生长所需能量，而且通过暗培养促进其进行呼吸作用，物质转换，促进生长。

3.本发明光培养使用的是较弱的光照强度，不仅提高了珙桐组培的增殖倍数，缩短周期培养的时间，且采用较弱光的光培养能够减少日光灯补光时产生的电耗和产生的热量，减少降温所需的费用，因此采用此方法可提高生产效率，降低生产成本，有利产业的发展，通过本发明的方法组培出的珙桐成苗率达到70％以上。

4.本发明的方法有利于工业化生产和自动化监控，大大的节约了人力、物力和田间作物的土地；在珙桐苗栽培生产领域中具有极大的推广价值。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明，以使本发明的优点和特征更易于被理解，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一种珙桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：于8月份，采摘晚上1点颜色嫩绿、完整、无病虫害的珙桐叶，使用80％的敌百虫稀释1000倍液浸泡5min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒5min，然后用无菌水冲洗3次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长15cm，宽10cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，每个培养皿放入3片的叶条片，轻压叶条片，在29℃下暗培养8天，而后转入26℃下进行8天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖，调节培养基的pH值为6.5；将培养基放入高温灭菌锅，在121℃、1.1kg/cm²条件下进行灭菌30min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的规格为90×15mm的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3；

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.3mg/L 6-苄基嘌呤+0.8mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5，于25℃条件下，光暗培养周期为光培养16h，暗培养8h，光培养的光照强度为1700勒克斯，光暗培养30天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.8mg/L吲哚乙酸+0.5mg/L萘乙酸+0.8mg/L活性炭，于25℃条件下，光暗培养周期为光培养16h，暗培养8h，光培养的光照强度为1700勒克斯，光暗培养20天，培养出幼苗，组培结束。

实施例2：

一种珙桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：于9月份，采摘晚上2点颜色嫩绿、完整、无病虫害的珙桐叶，使用90％的敌百虫稀释1000倍液浸泡10min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒10min，然后用无菌水冲洗5次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长18cm，宽15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，每个培养皿放入5片的叶条片，轻压叶条片，在31℃下暗培养15天，而后转入28℃下进行15天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖，调节培养基的pH值为7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在130℃、1.5kg/cm²条件下进行灭菌50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的规格为90×15mm的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/2；

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+0.8mg/L 6-苄基嘌呤+1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为7.0，于28℃条件下，光暗培养周期为光培养18h，暗培养6h，光培养的光照强度为2000勒克斯，光暗培养45天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+8g/L琼脂+29g/L蔗糖+2.5mg/L吲哚乙酸+1.5mg/L萘乙酸+1.5mg/L活性炭，于28℃条件下，光暗培养周期为光培养18h，暗培养6h，光培养的光照强度为2000勒克斯，光暗培养30天，培养出幼苗，组培结束。

实施例3：

一种珙桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：于9月份，采摘晚上1点30分时颜色嫩绿、完整、无病虫害的珙桐叶，使用85％的敌百虫稀释1000倍液浸泡6min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒6min，然后用无菌水冲洗4次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长16cm，宽11cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，每个培养皿放入4片的叶条片，轻压叶条片，在30℃下暗培养9天，而后转入27℃下进行9天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖，调节培养基的pH值为6.7；将培养基放入高温灭菌锅，在125℃、1.2kg/cm²条件下进行灭菌35min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的规格为90×15mm的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3；

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.4mg/L 6-苄基嘌呤+0.9mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.7，于26℃条件下，光暗培养周期为光培养17h，暗培养7h，光培养的光照强度为1800勒克斯，光暗培养35天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5.5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+7g/L琼脂+26g/L蔗糖+0.9mg/L吲哚乙酸+0.6mg/L萘乙酸+0.9mg/L活性炭，于26℃条件下，光暗培养周期为光培养17h，暗培养7h，光培养的光照强度为1800勒克斯，光暗培养25天，培养出幼苗，组培结束。

实施例4：

一种珙桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：于9月份，采摘晚上1点20分时颜色嫩绿、完整、无病虫害的珙桐叶，使用82％的敌百虫稀释1000倍液浸泡7min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒7min，然后用无菌水冲洗3次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长17cm，宽12cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，每个培养皿放入3片的叶条片，轻压叶条片，在29℃下暗培养10天，而后转入27℃下进行10天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+6.5g/L琼脂+27g/L蔗糖，调节培养基的pH值为6.8；将培养基放入高温灭菌锅，在127℃、1.3kg/cm²条件下进行灭菌45min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的规格为90×15mm的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/2；

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+6.5g/L琼脂+28g/L蔗糖+0.6mg/L 6-苄基嘌呤+1.1mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.9，于27℃条件下，光暗培养周期为光培养17.5h，暗培养6.5h，光培养的光照强度为1900勒克斯，光暗培养38天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5～6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+7.5g/L琼脂+28.5g/L蔗糖+2.0mg/L吲哚乙酸+1.2mg/L萘乙酸+1.2mg/L活性炭，于26℃条件下，光暗培养周期为光培养17.5h，暗培养6.5h，光培养的光照强度为1850勒克斯，光暗培养28天，培养出幼苗，组培结束。

实施例5：

一种珙桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：于8月份，采摘晚上1点40分时颜色嫩绿、完整、无病虫害的珙桐叶，使用82％的敌百虫稀释1000倍液浸泡9min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒9min，然后用无菌水冲洗5次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长16cm，宽13cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，每个培养皿放入3片的叶条片，轻压叶条片，在29℃下暗培养12天，而后转入27℃下进行12天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的配方为MS+7g/L琼脂+28g/L蔗糖，调节培养基的pH值为6.6；将培养基放入高温灭菌锅，在129℃、1.4kg/cm²条件下进行灭菌48min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的规格为90×15mm的培养皿中，装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3；

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+7.5g/L琼脂+28.5g/L蔗糖+0.6mg/L 6-苄基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.7，于26℃条件下，光暗培养周期为光培养16.5h，暗培养7.5h，光培养的光照强度为1850勒克斯，光暗培养42天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5.5cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+7.5g/L琼脂+26.5g/L蔗糖+2.2mg/L吲哚乙酸+1.4mg/L萘乙酸+1.3mg/L活性炭，于27℃条件下，光暗培养周期为光培养16.5h，暗培养7.5h，光培养的光照强度为1750勒克斯，光暗培养29天，培养出幼苗，组培结束。

如实施例1～5各条件下进行组培的条件下，对各实施例的组织培养的总数、愈伤组织培养阶段的情况变化和出苗率统计表如表1，愈伤组织培养期间每隔3天进行一次叶片颜色变化的记录，总结变化趋势。

表1出苗率统计表

如表1得出结论，在其他条件不变的情况下，采用每个培养皿适合培养3片叶片，能提供足量的能量，使得愈伤组织能快速发芽，随着培养皿中培养的叶片数越多，成苗率逐渐降低，所以适当控制培养叶片片数，能提高通过组织培养成苗率。

Claims (7)

1.一种珙桐的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：采摘8～9月份的珙桐叶，使用80％～90％的敌百虫稀释1000倍液浸泡5～10min，取出后放入超净工作台使用3％维生素C水溶液浸泡30min后再2％的次氯酸进行消毒5～10min，然后用无菌水冲洗3～5次，最后使用灭菌滤纸吸干珙桐叶表面的无菌水；

(2)愈伤组织培养：使用解剖刀沿着珙桐叶的茎干位置横切为长15～18cm，宽10～15cm的叶条片，将叶条片放入已经装入愈伤组织培养基的培养皿中，轻压叶条片，在29～31℃下暗培养8～15天，而后转入26～28℃下进行8～15天的暗培养，获得珙桐愈伤组织；

(3)愈伤组织分化芽：将上述得到的愈伤组织移置芽诱导培养基中，其中，芽诱导培养基的配方为1/2MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.3～0.8mg/L 6-苄基嘌呤+0.8～1.5mg/L萘乙酸，调节培养基的pH值为6.5～7.0，于25～28℃条件下，光暗培养30～45天后愈伤组织分化出芽；

(4)芽生根：待步骤(3)中芽长至5～6cm时，将芽移置根诱导培养基中，其中，根诱导培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖+0.8～2.5mg/L吲哚乙酸+0.5～1.5mg/L萘乙酸+0.8～1.5mg/L活性炭，于25～28℃条件下，光暗培养20～30天，培养出幼苗，组培结束。

2.根据权利要求1所述的珙桐的组培快繁方法，其特征在于，所述每个培养皿放入3～5片的叶条片。

3.根据权利要求1所述的珙桐的组培快繁方法，其特征在于，所述愈伤组织培养基的配方为MS+6～8g/L琼脂+25～29g/L蔗糖，调节培养基的pH值为6.5～7.0；将培养基放入高温灭菌锅，在121～130℃、1.1～1.5kg/cm²条件下进行灭菌30～50min，然后取出冷却至45℃后迅速在超净工作台中倾倒分装到已经经过高温灭菌锅灭菌的培养皿中。

4.根据权利要求1所述的珙桐的组培快繁方法，其特征在于，所述培养皿的规格为90×15mm；所述装入培养皿中的培养基为培养皿体积的1/3～1/2。

5.根据权利要求1所述的珙桐的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中的光暗培养周期为光培养16～18h，暗培养6～8h。

6.根据权利要求1所述的珙桐的组培快繁方法，其特征在于，所述光培养的光照强度为1700-2000勒克斯。

7.根据权利要求1所述的珙桐的组培快繁方法，其特征在于，所述珙桐叶为颜色嫩绿、完整、无病虫害；珙桐叶的采摘时间为晚上1～2点。