CN105613291A - 一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：一，对外植体进行清洗、消毒，然后接入诱导培养基中进行诱导培养；二，将步骤一中诱导的原球茎接入液体增殖培养基中进行悬浮震荡培养；三，将步骤二中获得的原球茎转接到分化培养基中培养获得分化苗；四，将步骤三中1-2cm高的苗转接到生根培养基中生根。本发明可以提高增殖倍率，实现产业化快速繁殖，该方法培育的铁皮石斛原球茎分化率高，干重鲜重含量提高，移栽成活率相应提高。

Description

一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法。

背景技术

铁皮石斛(DendrobiumcandidumWall.exLindl)是兰科石斛属多年生附生草本植物，是我国名贵的传统中药材之一，也是一种重要的花卉植物，分布于我国南方浙江、广西、福建、贵州、云南、安徽等省的原始森林中，有益胃生津，滋阴清热，止咳润肺等功效。由于生长环境特殊，长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材。同时，铁皮石斛的种子极小，无胚乳，自然条件下需与真菌共生才能萌发，繁殖速度慢，长势不一且变异率高。

20世纪70年开始，铁皮石斛的研究工作在组织培养、种植、药理药效方面发展很快，但在铁皮石斛的组织培养中存在组培苗生产成本高，移栽成活率低等问题。铁皮石斛原球茎是铁皮石斛离体培养产生的组织，具有植株的物质代谢和形态发育的潜能。一方面，铁皮石斛原球茎可以分化成苗，培养成植株，或者作为人工种子繁殖体解决试管苗移栽的问题，另一方面可以从原球茎中直接提取有效的药用成分，代替野生或栽培的植株。然而，铁皮石斛原球茎通过固体培养进行增殖，50-60天继代一次，周期长增殖倍率不高，长势不均匀。

有鉴于此，本发明研发出一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，以提高增殖倍率，实现产业化快速繁殖，该方法培育的铁皮石斛原球茎分化率高，干重鲜重含量提高，移栽成活率相应提高。

为达成上述目的，本发明的解决方案为：

一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

一，对外植体进行清洗、消毒，然后接入诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基配比为：MS培养基，6-BA0.1mg/L，NAA0.3mg/L，100g/L土豆泥，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度1500-2000lux，光照时间10h，温度25±2℃；

二，将步骤一中诱导的原球茎接入液体增殖培养基中进行悬浮震荡培养，液体增殖培养基为：1/2MS培养基，6-BA2.0mg/L，NAA0.5mg/L，蔗糖30g/L，PH5.6-5.8，培养条件为采用工业摇床进行悬浮震荡培养，转速100r/min，光照强度2000-2500lux，光照时间8h，温度25±2℃；

三，将步骤二中获得的原球茎转接到分化培养基中培养获得分化苗，培养基配方：1/2MS培养基，6-BA1.5-2.0mg/L，NAA0.3-0.5mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃；

四，将步骤三中1-2cm高的苗转接到生根培养基中生根，生根培养基配比：1/2MS培养基，NAA1.0mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃。

进一步，步骤一中，选择长势旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条为外植体，去除所有叶片，切除顶芽，然后将外植体放入含洗衣粉的水中浸泡10min，清水冲洗干净转移至无菌操作台上，用质量浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用质量浓度为0.1％的生汞消毒7-8min，无菌水冲洗5次，沥干，将茎段切成2-3cm带节的茎段，接种到诱导培养基中。

进一步，步骤二中，铁皮石斛原球茎液体增殖培养所采用的瓶子为85mm耐高温PP组培瓶，装液量为瓶身的1/5-1/6，接种量为其装液量的10％-15％(质量浓度)，置于旋装式工业摇床上进行震荡培养。

进一步，1/2MS培养基主要由1000mg/LNH₄NO₃、1500mg/LKNO₃、170mg/LKH₂PO₄、300mg/L无水CaCl₂和185mg/LMgSO₄·7H₂O组成。

采用上述方案后，本发明解决铁皮石斛原球茎增殖过程中周期长，增殖倍率低，生产成本高等问题，实现商业化规模化快速繁育，45天增殖倍率达20-23倍，原球茎的干重达到27.02g/L，分化效果好，生根率100％，满足工业化生产，为铁皮石斛的推广种植解决种苗需求问题。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做详细描述。

一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

一，外植体的预处理和诱导

选择长势旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条为外植体，去除所有叶片，切除顶芽，然后将外植体放入含洗衣粉的水中浸泡10min，自来水冲洗干净转移至无菌操作台上，用质量浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用质量浓度为0.1％的生汞消毒7-8min，消毒过程中轻轻晃动瓶子使之充分接触，最后无菌水冲洗5次，每次2min，沥干，将茎段切成2-3cm带节的茎段，接种到诱导培养基中。培养条件：光照强度1500-2000lux，光照时间10h，温度25±2℃，诱导培养基本培养基为MS培养基，土豆泥100g/L，分别添加不同浓度的6-BA和NAA，考察激素对原球茎诱导的影响，结果见表1。从表1中可以看出较适合原球茎诱导的是实验组合2，原球茎诱导培养基为MS、6-BA0.1mg/L、NAA0.3mg/L。

表1不同激素组合对原球茎诱导率的影响

二、铁皮石斛原球茎液体增殖培养

将诱导萌发的铁皮石斛原球茎直接接入到液体培养基中进行增殖培养，原球茎的液体增殖每隔15天更换一次培养液，换液时保留部分原有培养基再加入新鲜培养基，培养45天后进入筛选程序，挑选结构紧密，颗粒饱满，颜色鲜绿，直径大的原球茎进入分化阶段培养成分化苗；同时，当液体增殖的生物量达到一定程度时，可以将该原球茎做成药源植物，提取有效成分。

1、液体增殖培养采用旋转式大型工业摇床进行原球茎液体悬浮震荡培养，铁皮石斛原球茎液体增殖培养所采用的瓶子为85mm耐高温PP组培瓶，培养液的量为50ml，接种量为7-8g。

2、基本培养基及激素的选择对原球茎液体增殖的影响

2.1不同培养基对原球茎液体增殖的影响

不同基本培养基中盐浓度差异较大，盐浓度不同导致渗透压差异很大，这对原球茎的增殖具有重要影响且影响后期的分化，因此选取合适的基本培养基至关重要。选取相同条件下生长状况良好的原球茎接到液体培养基中，以MS、1/2MS、B5、N6为基本培养基，蔗糖30g/L，30天后观察原球茎增殖情况，见表2。由表2可以看出1/2MS较适宜作为原球茎液体增殖的基本培养基，B5、N6由于含有高的钾盐浓度不利于原球茎增殖导致原球茎脱水死亡。

表2不同培养基对原球茎液体增殖的影响

2.2不同激素对原球茎液体增殖的影响

激素种类及浓度对原球茎的增殖有重要的影响作用，前期实验显示对原球茎液体增殖有明显影响的激素为6-BA和NAA，故本方案主要考虑6-BA、NAA两种激素组合对原球茎液体增殖的影响。基本培养基为1/2MS，蔗糖30g/L，接种量7-8g/瓶，装液量50ml/瓶，光照强度2000-2500lux，时间12h，PH5.6-5.8，转速100r/min，45天后1瓶原球茎可以转接9-11瓶原球茎，按9瓶计算鲜重干重及增殖倍率，结果见表3。由表3可以看出不同浓度的激素组合对原球茎的液体增殖倍率影响较大，对原球茎的干重没有显著性的影响，6-BA浓度过高会导致培养后期出现芽分化，综合考虑其增值率、鲜重及形态等方面的因素选择液体增殖培养基为1/2MS、6-BA2.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖30g/L，采用该培养基进行原球茎液体增殖培养45天增殖倍率达20-23倍，原球茎的干重27.02g/L。增殖倍率＝(培养后的湿重-接种重量)/接种重量，鲜重测量发放是将原球茎置于吸水纸上并放于通风处30min，晾干水分后称其重量，干重测量方法为将原球茎置于105℃杀青30min后置于60℃烘箱过夜至恒重，下同。

表3不同激素组合对原球茎液体增殖的影响

2.3基本培养条件对原球茎液体增殖的影响

基本条件主要是考察光照强度、装液量、转速、培养周期对其影响。光照强度对原球茎液体增殖影响见表4，30天为一个周期。通过实验对比发现暗培养会导致原球茎死亡，光照不足影响原球茎的质量，过高的光强也会使原球茎停止生长，因此最适的光强在2000-2500lux，在这个光照强度下原球茎颜色翠绿，颗粒饱满分散均一。

表4光照强度对原球茎液体增殖的影响

原球茎接种量一定的情况下，装液量过多或过少都不适宜原球茎的增殖，装液量为瓶身的1/5-1/6，接种量为其装液量的10％-15％(w/v)时原球茎能最大限度的吸收营养物质进行增殖。摇床的转速对于原球茎的生长影响非常显著，在光照强度与接种量一定的情况下对转速进行比较，30天为一个周期，考察转速对原球茎液体增殖的影响，见表5。从表5中可以看出原球茎转速过低容易聚集成团，静止易因缺氧导致死亡，因此在转速100r/min时原球茎质量最好，翠绿饱满且分散增殖速度也快，符合生产要求。

表5转速对原球茎液体增殖的影响

培养周期也是影响原球茎液体悬浮培养的一个重要因素，本方案中发现原球茎液体增殖20-30天是一个快速增长时期，45天后开始不增长或出现溶解苗，因此液体培养周期45天为宜。

综上所述，铁皮石斛原球茎液体增殖培养的基本条件即光照强度2000-2500lux，光照8h，接种量为装液量的10％-15％(w/v)，转速100r/min，培养周期45天，基本培养基配方1/2MS、6-BA2.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖30g/L，PH5.6-5.8，通过本方法原球茎在45天增殖20-23倍，干重达到27.02g/L，且培养出的原球茎翠绿且圆润饱满，均一分散。

2.4不同培养方式对原球茎增殖的影响

通过茎段诱导出的原球茎接种到固体增殖培养基中培养，固体培养配方：1/2MS，6-BA2.0mg/L，NAA0.5mg/L，土豆泥100g/L，PH5.6-5.8，与液体增殖培养进行比较，每组随机抽样10瓶，观察固体培养和液体培养对原球茎增殖的影响，见表6。从表6中可以看出无论从干重还是增殖倍率、时间来看，原球茎通过液体增殖效果明显优于固体增殖的效果。

表6不同的培养方式对原球茎增殖的影响

三、铁皮石斛原球茎的分化

将经过液体增殖后的原球茎含水量高，分化培养基采用改良的1/2MS培养基防止原球茎脱水死亡。具体配方：改良1/2MS培养基，6-BA1.5-2.0mg/L，NAA0.4-0.6mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃。待苗高1-2cm，即可转入到生根培养基中。

四、铁皮石斛苗生根培养

当分化苗长到长至1-2cm，2-3片叶子即转接到生根培养基中培养，每瓶8-10丛，每丛2-3株，生根培养基配比：改良1/2MS培养基，NAA1.0mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃。

铁皮石斛原球茎通过液体增殖再转入固体培养基中进行分化生根，这种固液交换的培养方式缩短了整个培养周期，能大量的增殖和分化，分化率达到70-85％，生根率100％，经炼苗移栽铁皮石斛苗成活率提高，可进行工业化大规模生产。

Claims (4)

1.一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

一，对外植体进行清洗、消毒，然后接入诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基配比为：MS培养基，6-BA0.1mg/L，NAA0.3mg/L，100g/L土豆泥，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度1500-2000lux，光照时间10h，温度25±2℃；

二，将步骤一中诱导的原球茎接入液体增殖培养基中进行悬浮震荡培养，液体增殖培养基为：1/2MS培养基，6-BA2.0mg/L，NAA0.5mg/L，蔗糖30g/L，PH5.6-5.8，培养条件为采用工业摇床进行悬浮震荡培养，转速100r/min，光照强度2000-2500lux，光照时间8h，温度25±2℃；

三，将步骤二中获得的原球茎转接到分化培养基中培养获得分化苗，培养基配方：1/2MS培养基，6-BA1.5-2.0mg/L，NAA0.3-0.5mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃；

四，将步骤三中1-2cm高的苗转接到生根培养基中生根，生根培养基配比：1/2MS培养基，NAA1.0mg/L，香蕉泥100g/L，蔗糖20g/L，PH5.6-5.8，培养条件是光照强度2000-2500lux，光照时间12h，温度25±2℃。

2.如权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，步骤一中，选择长势旺盛的铁皮石斛幼嫩枝条为外植体，去除所有叶片，切除顶芽，然后将外植体放入含洗衣粉的水中浸泡10min，清水冲洗干净转移至无菌操作台上，用质量浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用质量浓度为0.1％的生汞消毒7-8min，无菌水冲洗5次，沥干，将茎段切成2-3cm带节的茎段，接种到诱导培养基中。

3.如权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，步骤二中，铁皮石斛原球茎液体增殖培养所采用的瓶子为85mm耐高温PP组培瓶，装液量为瓶身的1/5-1/6，接种量为其装液量的10％-15％，置于旋装式工业摇床上进行震荡培养。

4.如权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，1/2MS培养基主要由1000mg/LNH₄NO₃、1500mg/LKNO₃、170mg/LKH₂PO₄、300mg/L无水CaCl₂和185mg/LMgSO₄·7H₂O组成。