CN102002474B - 一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法 - Google Patents

一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法，该方法包括愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖和分化小鳞茎、以及小鳞茎生长各步骤，所采用的诱导愈伤组织培养基为MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+IAA0.1～0.5mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1，愈伤组织增殖培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5～1mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1，分化鳞茎培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1～0.4mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1；小鳞茎生长培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1。本发明可以大量快速繁殖川贝母鳞茎，且培养成本低，繁殖率高。

Description

一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法
技术领域
本发明涉及一种鳞茎的增殖方法，特别是涉及一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法。
背景技术
珍稀濒危药材川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科植物，生长在海拔3500m-4500m的高度，主产于四川、西藏、云南等省区。川贝母喜冷凉气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温、喜荫蔽的特性。气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，在海拔低、气温高的地区不能生存。川贝母具有清热润肺，化痰止咳之功效，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等症状。川贝母是稀有的治疗咳嗽等的良药，由于川贝母价格昂贵，加之近年来无计划盲目的采挖，自然资源日趋枯竭，预计在近几十年内也难以缓解。组织培养技术生长周期短，繁殖率高，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产，因此应用组织培养的方法进行川贝母快速繁殖是解决川贝母药材资源短缺问题的有效方法之一。现有的鳞茎组织培养方法都是以鳞茎为外植体进行培养，由于鳞茎本身为入药部位，资源有限，所以以鳞茎为外植体培养鳞茎，在获得鳞茎的同时又在消耗鳞茎，这相当于增加了鳞茎的培养成本，也使得鳞茎的资源短缺现状无法得到快速缓解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法，该方法在培养鳞茎的同时不需消耗鳞茎，培养成本低，繁殖率高。
为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：
(1)愈伤组织的诱导：选取已经消毒处理的川贝母植株叶为外植体，将其在超净工作台上切成小片，接种于诱导愈伤组织培养基MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+IAA0.1～0.5mg·L-1中；
(2)愈伤组织增殖：将(1)步骤诱导产生的愈伤组织切成适当大小并转接到愈伤组织增殖培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5～1mg·L-1中进行增殖培养；
(3)愈伤组织分化鳞茎：选取上述生长紧密的愈伤组织转接入鳞茎分化培养基MS+6～BA2.0mg·L-1+NAA0.1～0.3mg·L-1中进行鳞茎分化培养；
(4)鳞茎的生长：切取(3)步骤诱导产生的小鳞茎以2～4个为一组接入到鳞茎生长培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中，待鳞茎长至所需体积后即可收获；
上述所有培养基的配制pH值为5.6～6.0、蔗糖30～50g·L-1、琼脂6.0～7.0g·L-1；
上述培养条件均为温度18～22℃、每天光照8～12小时、光照强度为1000～1800lx。
上述(1)步骤中所述的川贝母植株叶可采取组培苗幼叶，由于组培苗幼叶是在无细菌的环境中长成，因此在此步骤中无需再作专门的消毒处理。
上述(2)步骤中所述愈伤组织按35g培养基中接入2g的比例接入增殖培养基中。
上述(3)步骤中愈伤组织接入在分化培养基中，其插入部分的长度占整个长度的3/5。
本发明由于采用以川贝母植株叶为外植体的组织培养方法再生鳞茎，因此与传统栽培方法相比所花的时间大大缩短，克服了传统栽培中时间长，收获量低等问题，而且培养的鳞茎总生物碱含量可达0.190％，是市售鳞茎总生物碱含量的2.8倍(市售鳞茎总生物碱含量为0.068％)，也高于野生鳞茎的总生物碱含量(0.109％)，另外由于川贝母植株叶本身不是入药部位，因此该方法变相增加了鳞茎的产出量，降低了培养成本。此外实施该方法只需有简单的植物组织培养设备即可进行，实用性强，且不受季节限制。
下面结合实施例对本发明进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
(1)愈伤组织的诱导：选取生长健康的幼嫩川贝母植株叶作为外植体，将其用洗衣粉液洗净后于流水下冲洗30min，再用2.0％次氯酸钠溶液漂洗15min，用清水洗净吸干后放入0.1％升汞溶液中消毒5min，再用无菌水冲洗3次，并用无菌滤纸吸干表面的水分，然后将处理后的植株叶在超净工作台上切成2cm左右的大小，并将伤口处插入MS+6-BA2.0mg·L-1+IAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1培养基中，在20～21℃、光照强度为1000～1800lx、每天光照12小时的条件下进行培养，培养35～45天可诱导出大量的愈伤组织；
(2)愈伤组织增殖：选取(1)步骤中生长速度快的黄绿色愈伤组织，将其在超净工作台上切成2g左右重量后接入35g培养基中，其愈伤组织的增殖培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，在20℃、光照强度为1200lx、每天光照12小时的条件下进行培养，培养28天后，愈伤组织可增加2.6倍；
(3)愈伤组织分化鳞茎：选取选取(2)步骤中生长紧密的淡黄色和黄色愈伤组织，在超净工作台上切成1cm左右见方大小后以3/5的比例(插入部分的长度占整个长度的比)接入到鳞茎分化培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0g·L-1中，在20℃、光照强度为1000lx、每天光照12小时的条件下进行培养，培养20天后在紧密愈伤组织表面开始分化出小鳞茎，40天后统计鳞茎分化率为76％，每个外植体上平均分化出6个左右的小鳞茎，且部分鳞茎抽苗；
(4)鳞茎体积的长大：将上述由愈伤组织分化的小鳞茎按纵切法分割成2～4个一组，接入MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1的培养基中，在22℃、光照强度1500lx、每天光照12小时的条件下进行培养，小鳞茎体积快速增大，培养40d后，小鳞茎体积增大4倍左右，即可收获。如果培养时间过长，膨大的鳞茎会出现愈伤化现象。
实施例2
(1)愈伤组织的诱导：选取生长健康的川贝母组培苗幼叶作为外植体，将其在超净工作台上切成2cm左右的大小，并将伤口处插入MS+6-BA2.0mg·L-1+IAA0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1培养基中，在20～21℃、光照强度为1000～1800lx、每天光照12小时的条件下进行培养，培养35～45天可诱导出大量的愈伤组织；
(2)愈伤组织增殖：选取(1)步骤中生长速度快的黄绿色愈伤组织，将其在超净工作台上切成2g左右重量后接入35g培养基中，其愈伤组织的增殖培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，在20℃、光照强度为1200lx、每天光照12小时的条件下进行培养，培养28天后，愈伤组织可增加3.2倍；
(3)愈伤组织分化鳞茎：选取选取(2)步骤中生长紧密的淡黄色和黄色愈伤组织，在超净工作台上切成1cm左右见方大小后以3/5的比例(插入部分的长度占整个长度的比)插入到鳞茎分化培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0g·L-1中，在20℃、光照强度为1000lx、每天光照12小时的条件下进行培养，培养20天后在紧密愈伤组织表面开始分化出小鳞茎，40天后统计鳞茎分化率为87％，每个外植体上平均分化出9个以上的小鳞茎；
(4)鳞茎体积的长大：将上述由愈伤组织分化的小鳞茎按纵切法分割成2～4个一组，接入MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1的培养基中，在22℃、光照强度1500lx、每天光照12小时的条件下进行培养，小鳞茎体积快速增大，培养40d后，小鳞茎体积增大4倍左右，即可收获。

Claims (4)

1.一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)愈伤组织的诱导：选取已经消毒处理的川贝母植株叶为外植体，将其在超净工作台上切成小片，接种于诱导愈伤组织培养基中，培养基的配制为：MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+IAA0.1～0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0～7.0g·L-1，pH值为5.6～6.0，培养条件为：温度20～21℃，每天光照12小时，光照强度为1000～1800lx；
(2)愈伤组织增殖：将(1)步骤诱导产生的愈伤组织切成适当大小并转接到愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养，培养基的配制为：MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH值为5.6～6.0，培养条件为：温度20℃，每天光照12小时，光照强度为1200lx；
(3)愈伤组织分化鳞茎：选取上述生长紧密的愈伤组织转接入鳞茎分化培养基中进行鳞茎分化培养，培养基的配制为：MS+6～BA2.0mg·L-1+NAA0.2～0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0g·L-1，pH值为5.6～6.0，培养条件为：温度20℃，每天光照12小时，光照强度为1000lx；
(4)鳞茎的生长：切取(3)步骤诱导产生的小鳞茎以2～4个为一组接入到鳞茎生长培养基pH值为5.6～6.0，MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中，待鳞茎长至所需体积后即可收获，培养条件为：温度22℃，每天光照12小时，光照强度为1500lx。
2.根据权利要求1所述的一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法，其特征在于：上述(1)步骤中所述的川贝母植株叶为组培苗幼叶。
3.根据权利要求1或2所述的一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法，其特征在于：上述(2)步骤中所述愈伤组织按35g培养基中接入2g的比例接入增殖培养基中。
4.根据权利要求1或2所述的一种以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法，其特征在于：上述(3)步骤中愈伤组织接入在分化培养基中，其插入部分的长度占整个长度的3/5。
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