CN103621406B - 一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法 - Google Patents

一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法，该方法以川贝母根尖为外植体成功诱导出有效组份含量高的川贝母愈伤组织，并完成了川贝母愈伤组织的快速增殖培养，该方法不仅为利用生物技术大规模生产川贝母有效成分提供了一种新途径，也可在一定程度上解决川贝母药材资源短缺的问题，满足药材市场对川贝母有效组份的需求。

Description

一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法
技术领域
本发明涉及一种川贝母愈伤组织的培养方法，特别是涉及一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法。
背景技术
川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)是百合科植物，生长在海拔3500m—4500m的高度，主产于四川、西藏、云南等省区。川贝母具有清热润肺，化痰止咳之功效，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等症状，是稀有的治疗咳嗽等的良药。由于川贝母价格昂贵，加之近年来无计划盲目的采挖，自然资源日趋枯竭，预计在近几十年内也难以缓解。组织培养技术生长周期短，繁殖率高，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产，因此应用组织培养的方法进行川贝母快速繁殖是解决川贝母药材资源短缺问题的有效方法之一。
根据2010年药典规定，川贝母植物的入药部位是其生长在地下部分的鳞茎。我们利用分光光度法测定了生长三年的野生川贝母植株的鳞茎和根器官中的总生物碱含量发现，根中的总生物碱含量为0.071％，比鳞茎中的总生物碱含量0.068％还稍高。但目前在川贝母植物的组织培养方面，还未见有采用川贝母植物根为外植体的愈伤组织诱导培养方法的报道，分析原因，一方面是因为川贝母植物的根器官存在取材和保存方面的问题；另一方面则是因为在无菌培养过程中，植物根器官存在着消毒和快速脱分化的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤：
(1)外植体的选择和消毒处理：切取生长二年以上的川贝母植株上的根，先用浓度为0.02％～0.05％的升汞溶液冲洗干净，然后置于15～20℃的条件下阴干3～6小时，再在超净台上，用配制的升汞溶液消毒处理3～6min，所述配制的升汞溶液是按每100ml浓度为0.1％升汞溶液中滴加0.5～1.0ml浓度为0.3～0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的；
(2)愈伤组织的诱导培养：切取步骤(1)中已消毒的川贝母根尖0.5～2cm的长度，接入改良的MS+2-ip0.5～1.5mg·L-1+NAA0.3～1.0mg·L-1+头孢曲松钠200～500mg·L-1+香蕉汁100～300mg·L-1的愈伤组织诱导培养基中，在温度为10～18℃、每天光照4～10小时和光照强度为1500～2000lx的条件下进行培养，所述改良的MS为硝酸铵含量减半的MS基本培养基；
(3)愈伤组织的增殖培养：选取步骤(2)中培养的质地较紧密和颜色为白色的愈伤组织，切成0.3～1.0cm3的大小后转接入B5+2,4-D1.0～4.0mg·L-1+KT0.1～1.0mg·L-1+多效唑0.5～2.0mg·L-1+活性炭1.0～2.0mg·L-1的增殖培养基中，在温度为15～22℃、每天光照2～5小时和光照强度为300～600lx的条件下进行愈伤组织的增殖培养；
上述所有培养基的pH值为5.6～6.5、蔗糖35～45g·L-1、琼脂5.0～6.0g·L-1。
上述步骤(1)中所选择的根的直径为2～4mm。
上述步骤(2)中所述川贝母根尖以平放方式接入愈伤组织诱导培养基中。
本发明选取生长二年生以上的川贝母植株上的根为外植体，经有效消毒处理后，培育出有效成分含量高的愈伤组织，并完成了愈伤组织的快速增殖培养，该方法不仅为利用生物技术大规模生产川贝母有效成分提供了一种新途径，也可在一定程度上解决川贝母药材资源短缺的问题，同时也可对野生川贝母资源起到一定的保护作用。
具体实施方式
实施例1
(1)外植体的选择和消毒处理：切取生长二年以上的川贝母植株上直径为2mm的根，先用浓度为0.02％的升汞液将根表面冲洗干净，然后置于15℃的条件下阴干3小时，再放在超净台上，用按每100ml浓度为0.1％的升汞溶液中滴加0.5ml浓度为0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒处理3min，最后用无菌水洗3次；
(2)愈伤组织的诱导培养：切取步骤(1)中已消毒的川贝母根尖0.5cm的长度，以平放方式接入硝酸铵含量减半的改良MS+2-ip0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+头孢曲松钠200mg·L-1+香蕉汁100mg·L-1的愈伤组织诱导培养基中，在温度10℃、每天光照4小时和光照强度为1500lx的条件下培养30天，统计其愈伤组织的诱导率为67.49％，外植体的染菌率19.59％；
(3)愈伤组织的增殖培养：选取步骤(2)中培养的质地较紧密和颜色为白色的愈伤组织，切成0.3cm3大小后转接入B5+2,4-D1.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+多效唑0.5mg·L-1+活性炭1.0mg·L-1的增殖培养基中，在温度15℃、每天光照2小时和光照强度为300lx的条件下培养30天，其愈伤组织的增殖倍数为2.04倍，且增殖的愈伤组织生长健康、无褐化和玻璃化现象产生；
上述所有培养基的pH值为6.0、蔗糖40g·L-1、琼脂5.5g·L-1。
实施例2
(1)外植体选择和消毒处理：切取生长二年以上的川贝母植株上直径为4mm的根，先用浓度为0.03％的升汞液将根表面冲洗干净，然后放在18℃的条件下阴干4小时，再放在超净台上，用按每100ml浓度为0.1％的升汞溶液中滴加0.7ml浓度为0.4％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒处理5min，最后用无菌水洗5次；
(2)愈伤组织的诱导培养：切取步骤(1)中已消毒的川贝母根尖1.5cm的长度，以平放方式接入硝酸铵含量减半的改良MS+2-ip1.0mg·L-1+NAA0.6mg·L-1+头孢曲松钠300mg·L-1+香蕉汁200mg·L-1的愈伤组织诱导培养基中，在温度15℃、每天光照6小时和光照强度为1800lx的条件下培养30天，统计其愈伤组织的诱导率为85.41％，外植体的染菌率为0％；
(3)愈伤组织的增殖培养：选取步骤(2)中培养的质地较紧密和颜色为白色的愈伤组织，切成1.0cm3的大小后转接入B5+2,4-D3.0mg·L-1+KT0.5mg·L-1+多效唑1.0mg·L-1+活性炭1.5mg·L-1的培养基中，在温度18℃、每天光照3小时和光照强度为400lx的条件下培养30天，其愈伤组织的增殖倍数为3.26倍，且增殖的愈伤组织生长健康、无褐化和玻璃化现象产生；
上述所有培养基的pH值为6.0、蔗糖40g·L-1、琼脂5.5g·L-1。
实施例3
(1)外植体的选择和消毒处理：切取生长二年以上的川贝母植株上直径为4mm的根，先用浓度为0.05％的升汞液将根表面冲洗干净，然后放在20℃的条件下阴干6小时，再放在超净台上，用按每100ml浓度为0.1％的升汞溶液中滴加1ml浓度为0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒处理6min，最后用无菌水洗5次；
(2)愈伤组织的诱导培养：切取步骤(1)中已消毒的川贝母根尖2cm的长度，以平放方式接入硝酸氨含量减半的改良MS+2-ip1.5mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+头孢曲松钠500mg·L-1+香蕉汁300mg·L-1的愈伤组织诱导培养基中，在温度18℃、每天光照10小时和光照强度为2000lx的条件下培养30天，统计其愈伤组织的诱导率为84.82％，外植体的染菌率为0％；
(3)愈伤组织的增殖培养：选取步骤(2)中培养的质地较紧密和颜色为白色的愈伤组织，切成1.0cm3的大小后转接入B5+2,4-D4.0mg·L-1+KT1.0mg·L-1+多效唑2.0mg·L-1+活性炭2.0mg·L-1的培养基中，在温度22℃、每天光照5小时和光照强度为600lx的条件下培养30天，其愈伤组织的增殖倍数为3.09倍；增殖的愈伤组织无褐化，但有10.34％的愈伤组织有轻微的玻璃化现象产生；
上述所有培养基的pH值为6.0、蔗糖40g·L-1、琼脂5.5g·L-1。
实施例4
将实施例2步骤(1)中选取的川贝母根的直径改为2mm，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率78.62％，外植体的染菌率为0％。
实施例5
将实施例2步骤(1)中所述“用按每100ml浓度为0.1％的升汞溶液中滴加0.7ml浓度为0.4％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒处理5min”改为“用按每100ml浓度为0.1％的升汞溶液中滴加1.0ml浓度为0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的升汞溶液消毒处理6min”，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率80.42％，外植体的染菌率也为0％。
实施例6
将实施例2步骤(1)中所述“在每100ml的0.1％的升汞溶液中滴加0.7ml浓度为0.4％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液进行消毒处理5min”改为“在每100ml的0.1％的升汞溶液中滴加0.5ml浓度为0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液进行消毒处理3min”其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率82.42％，外植体的染菌率也为17.59％。
实施例7
将实施例2步骤(2)中所切取的川贝母根尖的长度改为0.5cm，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率70.12％，外植体的染菌率为0％；
实施例8
在实施例2步骤(2)中，将切取的川贝母根尖以竖直插入的方式接入培养基中，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率50.38％。
实施例9
将实施例2步骤(2)中愈伤组织诱导培养基改为改良MS+2-ip0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+头孢曲松钠200mg·L-1+香蕉汁100mg·L-1，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率80.72％。
实施例10
将实施例2步骤(3)中愈伤组织改切成0.5cm3的大小，其它步骤同实施例2，增殖培养30天，其愈伤组织的增殖倍数为2.38倍。
实施例11
将实施例2步骤(3)中愈伤组织的增殖培养基改为B5+2,4-D1.0mg·L-1+KT1.0mg·L-1+多效唑0.5mg·L-1+活性炭1.0mg·L-1，其它步骤同实施例2，增殖培养30天，其愈伤组织的增殖倍数为2.15倍。
实施例12
将实施例2步骤(3)中愈伤组织的增殖培养条件改为：在温度15℃，每天光照2小时和光照强度为光照600lx的条件下培养30天，其它步骤同实施例2，其愈伤组织的增殖倍数为2.98倍。
比较实施例1
在实施例2步骤(1)中，改选为生长一年的川贝母植株上直径为1.3mm以下的根，其它步骤同实施例2，培养30天后，其愈伤组织的诱导率为20.45％。
比较实施例2
在实施例2的步骤(1)中，取消把川贝母根尖放在18℃的遮光条件下阴干4小时这一环节，其它步骤同实施例2，外植体的染菌率为27.62％。
比较实施例3
在实施例2步骤(1)中，取消用升汞冲洗、以及取消在升汞溶液中滴加聚乙二醇辛基苯基醚，其它步骤同实施例2，培养30天后，外植体的染菌率为40.69％。
比较实施例4
将实施例2步骤(2)中愈伤组织的诱导培养改为MS+2-ip0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率为48.34％。
比较实施例5
将实施例2步骤(2)中愈伤组织的诱导培养条件该为：温度30℃，每天光照14小时，光照强度为3000lx，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的诱导率为53.32％。
比较实施例6
在实施例2步骤(3)中，改选质地较疏松和颜色为无色的愈伤组织进行增殖培养，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的增殖倍数1.72倍，且增殖的愈伤组织出现了较严重的玻璃化现象。
比较实施例7
将实施例2步骤(3)中的培养基该为B5+2,4-D0.5mg·L-1+6BA3.0mg·L-1，其它步骤同实施例2，培养30天后，愈伤组织的增殖倍数为1.96倍。

Claims (3)

1.一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)外植体的选择和消毒处理：切取生长二年以上的川贝母植株上的根，先用浓度为0.02％～0.05％的升汞溶液冲洗干净，然后置于15～20℃的条件下阴干3～6小时，再在超净台上，用配制的升汞溶液消毒处理3～6min，所述配制的升汞溶液是按每100ml浓度为0.1％升汞溶液中滴加0.5～1.0ml浓度为0.3～0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液配制的；
(2)愈伤组织的诱导培养：切取步骤(1)中已消毒的川贝母根尖0.5～2cm的长度，接入改良的MS+2-ip0.5～1.5mg·L-1+NAA0.3～1.0mg·L-1+头孢曲松钠200～500mg·L-1+香蕉汁100～300mg·L-1的愈伤组织诱导培养基中，在温度为10～18℃、每天光照4～10小时和光照强度为1500～2000lx的条件下进行培养，所述改良的MS为硝酸铵含量减半的MS基本培养基；
(3)愈伤组织的增殖培养：选取步骤(2)中培养的质地较紧密和颜色为白色的愈伤组织，切成0.3～1.0cm3的大小后转接入B5+2,4-D1.0～4.0mg·L-1+KT0.1～1.0mg·L-1+多效唑0.5～2.0mg·L-1+活性炭1.0～2.0mg·L-1的增殖培养基中，在温度为15～22℃、每天光照2～5小时和光照强度为300～600lx的条件下进行愈伤组织的增殖培养；
上述所有培养基的pH值为5.6～6.5、蔗糖35～45g·L-1、琼脂5.0～6.0g·L-1。
2.根据权利要求1所述的一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤(1)中所选择的根的直径为2～4mm。
3.根据权利要求1所述的一种以川贝母根为外植体的川贝母愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述川贝母根尖以平放方式接入愈伤组织诱导培养基中。
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