CN102577965A - 东方百合种球脱毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种东方百合种球脱毒方法，具体通过以下步骤完成：A、外植体生长点的剥取，B、热处理脱毒，C、外植体清洗消毒，D、生长点采集诱导培养，E、脱毒培养，F、病毒检测。该发明克服了现有技术存在的不足，综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的脱毒方法，解决了单独使用一种方法存在的不足，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。

Description

东方百合种球脱毒方法

技术领域

本发明属于在播种或种植前测试或处理种子的方法，具体涉及一种百合种球脱毒的方法。

背景技术

东方百合是百合杂种类中花朵最大而又最美丽的一大类，能散发出怡人的香味，故又称之为香水百合，深受人们的喜爱，是世界上广泛栽培的一大类百合杂种系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖，但长期的无性繁殖使病毒在体内积累，引发各种病毒病，严重影响种球和切花的产品品质，近年来，随着我国百合引种数量和种植面积的迅速增加，以及不规范的种球自繁，病毒病开始在我国各百合种植区发生流行，病毒病一般发病率在40～50%，二代种球带毒率有的达到90%以上，严重地制约了我国百合产业的提质增效。

目前，国内外有关百合的脱毒处理主要是单独采用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒及相互间的组合脱毒，这些方法单独使用时效率低，脱毒效果差，其普遍采用较好的是茎尖培养脱毒法，其常规的步骤是；通过植物顶端分生组织切取0.2～0.3mm茎尖，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织分化产生鳞茎芽，长成小植株得到脱毒苗。例如，专利号为200410079513.2的中国专利公开了一种“东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法”，是采用茎尖作为外植体，经灭菌，诱导培养后获得东方百合脱毒鳞茎；该脱毒组织培养法存在的问题是:切取很小的茎尖分生组织，在添加6-BA l.0～2.0 mg／L和NAA 0.2～0.5mg／L的MS基本培养基上培养20～25d，茎尖会同时形成愈伤组织和不定芽，但从愈伤组织分化的不定芽易发生遗传变异；且未对病毒进行进一步的检测和监控，难于了解脱毒情况。

也有如专利号为200910091972.5的中国专利公开了“一种百合种球病毒的脱除方法”，是采用暗培养，对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒，茎尖的脱毒方式为茎尖热处理结合化学药剂脱毒，变温处理种球球芯3～5周，温度范围为25～38℃，同时用病毒唑脱毒，浓度为5～7mg/ml，茎尖大小为0.4～1.2mm。该方法是对组培苗进行脱毒，组培苗需在无菌条件下获取，获取环境要求严格。

发明内容

本发明目的是提供一种综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的东方百合种球脱毒方法，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。

本发明通过以下技术方案实现：东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤：

A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20～40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45～55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20～25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭45～55%的水分；在温度为21～23℃，湿度为70～80%，光照强度1500～2000Lx，光照时间8～12h/d的条件下，经过5～7天后，芽长到5～6cm时进行热处理脱毒。

B、热处理脱毒：将温度控制在35～38℃之间，湿度为70～85%，光照强度1500Lx，光照时间8～12h/d的环境条件下，经过7～15天培养，芽长高并绽开成莲座状。

C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8～15秒；④ 吐温80无菌水浸泡2～3分钟；⑤再用无菌水洗5～7遍至无泡沫。

D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3～0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21～23℃，光照强度1500～3000Lx，光照时间8～12h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2～3cm的叶丛。

其中，诱导培养基为：1／2MS+BA2.5～5mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。

E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为21～23℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～3000Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗。

脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。

其中，病毒唑的添加方法如下： 

a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液。

b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。

c.将高温灭菌后的培养基：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L，冷至35～40℃时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。

F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。

优选的，步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。

步骤D是采集长度为0.3～0.4 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。

有益效果

①本发明采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法，有效解决了单独使用一种方法存在的不足，缩短了培养周期，减少病毒交叉感染，植株成活率高，脱毒率明显提高，百合脱毒率达到80%以上，脱毒率较只采用高温处理提高了25～70%。

②本发明的脱毒方法，采用了35～38℃的高温，在该高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖，该期间生产的嫩梢带病毒较少，且该温度能保证植株的成活率。

③本发明脱毒培养基内添加病毒唑的方法能使脱毒更彻底。

④热处理后剥取0.3～0.5 mm的茎尖生长点进行培养，此操作简单，易于操作，脱毒效果好。

具体实施例

实施例1: 东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤：

A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭45%的水分；在温度为21℃，湿度为70%，光照强度1500Lx，光照时间8h/d的条件下，经过5～7天后，芽长到5cm时进行热处理脱毒。

B、热处理脱毒：将温度控制在35℃之间，湿度为70%，光照强度1500Lx，光照时间8h/d的环境条件下，经过7～15天培养，芽长高并绽开成莲座状。

C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8秒；④ 吐温80无菌水浸泡2分钟；⑤再用无菌水洗5遍至无泡沫。

D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21℃，光照强度1500Lx，光照时间8h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2cm的叶丛。

E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为21℃，光照时间为8h/d，光照强度为2000Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗。

F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。

实施例2：东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤：

A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为30%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为50%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种22个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭50%的水分；在温度为22℃，湿度为75%，光照强度1800Lx，光照时间10h/d的条件下，经过5～7天后，芽长到5.5cm时进行热处理脱毒。

B、热处理脱毒：将温度控制在36℃之间，湿度为80%，光照强度1500Lx，光照时间10h/d的环境条件下，经过7～15天培养，芽长高并绽开成莲座状。

C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡11秒；④ 吐温80无菌水浸泡3分钟；⑤再用无菌水洗6遍至无泡沫。

D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.4 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度22℃，光照强度2000Lx，光照时间10h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径3cm的叶丛。

其中，诱导培养基为：1／2MS+BA 4mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。

E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为22℃，光照时间为10h/d，光照强度为2500Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗。

F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。

实施例3: 东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤:

A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭55%的水分；在温度为23℃，湿度为80%，光照强度2000Lx，光照时间12h/d的条件下，经过5～7天后，芽长到6cm时进行热处理脱毒。

B、热处理脱毒：将温度控制在38℃之间，湿度为85%，光照强度1500Lx，光照时间12h/d的环境条件下，经过7～15天培养，芽长高并绽开成莲座状。

C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡14秒；④ 吐温80无菌水浸泡2分钟；⑤再用无菌水洗7遍至无泡沫。

D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度23℃，光照强度3000Lx，光照时间12h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2cm的叶丛。

其中，诱导培养基为：1／2MS+BA 4mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。

E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为23℃，光照时间为12h/d，光照强度为3000Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗。

脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。

其中，病毒唑的添加方法如下： 

a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液。

b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。

c.将高温灭菌后的培养基：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L，冷至40℃时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。

F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。

Claims (9)

1.东方百合种球脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20～40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45～55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的基质中，每箱下种20～25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持基质45～55%的水分；在温度为21～23℃，湿度为70～80%，光照强度1500～2000Lx，光照时间8～12h/d的条件下，经过5～7天后，芽长到5～6cm时进行热处理脱毒；

B、热处理脱毒：将温度控制在35～38℃之间，湿度为70～85%，光照强度1500Lx，光照时间8～12h/d的环境条件下，经过7～15天培养，芽长高并绽开成莲座状；

C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8～15秒；④ 吐温80无菌水浸泡2～3分钟；⑤再用无菌水洗5～7遍至无泡沫；

D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3～0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21～23℃，光照强度1500～3000Lx，光照时间8～12h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2～3cm的叶丛；

E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为21～23℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～3000Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗；

F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。

2.根据权利要求1所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。

3.根据权利要求1所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D是采集长度为0.3～0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。

4.根据权利要求2所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D是采集长度为0.3～0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D中的诱导培养基为： 1／2MS+BA2.5～5mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中的脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。

7.根据权利要求5所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中的脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。

8.根据权利要求6所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，

步骤E中病毒唑的添加方法如下： 

a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液；

b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液；

c.将高温灭菌后的培养基：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L，冷至35～40℃时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。

9.根据权利要求7所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，

步骤E中病毒唑的添加方法如下： 

a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液；

b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液；

c.将高温灭菌后的培养基：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L，冷至35～40℃时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。