CN102577965B - 东方百合种球脱毒方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种东方百合种球脱毒方法,具体通过以下步骤完成:A、外植体生长点的剥取,B、热处理脱毒,C、外植体清洗消毒,D、生长点采集诱导培养,E、脱毒培养,F、病毒检测。该发明克服了现有技术存在的不足,综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的脱毒方法,解决了单独使用一种方法存在的不足,该方法能有效减少病毒交叉感染的机会,脱毒率高,成活率高,能有效缩短种球培养周期。
Description
技术领域
本发明属于在播种或种植前测试或处理种子的方法,具体涉及一种百合种球脱毒的方法。
背景技术
东方百合是百合杂种类中花朵最大而又最美丽的一大类,能散发出怡人的香味,故又称之为香水百合,深受人们的喜爱,是世界上广泛栽培的一大类百合杂种系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖,但长期的无性繁殖使病毒在体内积累,引发各种病毒病,严重影响种球和切花的产品品质,近年来,随着我国百合引种数量和种植面积的迅速增加,以及不规范的种球自繁,病毒病开始在我国各百合种植区发生流行,病毒病一般发病率在40~50%,二代种球带毒率有的达到90%以上,严重地制约了我国百合产业的提质增效。
目前,国内外有关百合的脱毒处理主要是单独采用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒及相互间的组合脱毒,这些方法单独使用时效率低,脱毒效果差,其普遍采用较好的是茎尖培养脱毒法,其常规的步骤是;通过植物顶端分生组织切取0.2~0.3mm茎尖,诱导愈伤组织,然后从愈伤组织分化产生鳞茎芽,长成小植株得到脱毒苗。例如,专利号为200410079513.2的中国专利公开了一种“东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法”,是采用茎尖作为外植体,经灭菌,诱导培养后获得东方百合脱毒鳞茎;该脱毒组织培养法存在的问题是:切取很小的茎尖分生组织,在添加6-BA l.0~2.0 mg/L和NAA 0.2~0.5mg/L的MS基本培养基上培养20~25d,茎尖会同时形成愈伤组织和不定芽,但从愈伤组织分化的不定芽易发生遗传变异;且未对病毒进行进一步的检测和监控,难于了解脱毒情况。
也有如专利号为200910091972.5的中国专利公开了“一种百合种球病毒的脱除方法”,是采用暗培养,对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒,茎尖的脱毒方式为茎尖热处理结合化学药剂脱毒,变温处理种球球芯3~5周,温度范围为25~38℃,同时用病毒唑脱毒,浓度为5~7mg/ml,茎尖大小为0.4~1.2mm。该方法是对组培苗进行脱毒,组培苗需在无菌条件下获取,获取环境要求严格。
发明内容
本发明目的是提供一种综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的东方百合种球脱毒方法,该方法能有效减少病毒交叉感染的机会,脱毒率高,成活率高,能有效缩短种球培养周期。
本发明通过以下技术方案实现:东方百合种球脱毒方法,包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球,用浓度为20~40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟;将消过毒的泥炭用水拌湿,使其含水量为45~55%,备用;再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中,每箱下种20~25个种球,浇定根水,然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面;按切花种植方法正常管理,保持泥炭45~55%的水分;在温度为21~23℃,湿度为70~80%,光照强度1500~2000Lx,光照时间8~12h/d的条件下,经过5~7天后,芽长到5~6cm时进行热处理脱毒。
B、热处理脱毒:将温度控制在35~38℃之间,湿度为70~85%,光照强度1500Lx,光照时间8~12h/d的环境条件下,经过7~15天培养,芽长高并绽开成莲座状。
C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后,剥去部分叶片,用中性肥皂水洗5分钟,用纱布包好,清水冲洗12小时;②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟;③再用浓度为75%的酒精浸泡8~15秒;④ 吐温80无菌水浸泡2~3分钟;⑤再用无菌水洗5~7遍至无泡沫。
D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.3~0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养,温度21~23℃,光照强度1500~3000Lx,光照时间8~12h/d,培养40~60天后,生长点膨大成直径2~3cm的叶丛。
其中,诱导培养基为:1/2MS+BA2.5~5mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。
E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.5cm小块,接种于脱毒培养基中,脱毒培养基为:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L,在温度为21~23℃,光照时间为8~12h/d,光照强度为2000~3000Lx的环境条件下,经过40~60天培养,形成带球的瓶苗。
其中,病毒唑的添加方法如下:
a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液。
b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛,用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。
c.将高温灭菌后的培养基:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L,冷至35~40℃时,吸取病毒唑母液,按5mg/L用量添加后摇匀,分装入无菌瓶中,待冷却凝固后用于药物脱毒接种。
F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测,经检测确认无任何病虫害现象,并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒病毒,即为百合脱毒种苗。
优选的,步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。
步骤D是采集长度为0.3~0.4 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。
有益效果
①本发明采用综合脱毒技术,即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法,有效解决了单独使用一种方法存在的不足,缩短了培养周期,减少病毒交叉感染,植株成活率高,脱毒率明显提高,百合脱毒率达到80%以上,脱毒率较只采用高温处理提高了25~70%。
②本发明的脱毒方法,采用了35~38℃的高温,在该高温下病毒出现钝化,其复制明显减弱或不再繁殖,该期间生产的嫩梢带病毒较少,且该温度能保证植株的成活率。
③本发明脱毒培养基内添加病毒唑的方法能使脱毒更彻底。
④热处理后剥取0.3~0.5 mm的茎尖生长点进行培养,此操作简单,易于操作,脱毒效果好。
具体实施例
实施例1: 东方百合种球脱毒方法,包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球,用浓度为20%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟;将消过毒的泥炭用水拌湿,使其含水量为45%,备用;再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中,每箱下种20个种球,浇定根水,然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面;按切花种植方法正常管理,保持泥炭45%的水分;在温度为21℃,湿度为70%,光照强度1500Lx,光照时间8h/d的条件下,经过5~7天后,芽长到5cm时进行热处理脱毒。
B、热处理脱毒:将温度控制在35℃之间,湿度为70%,光照强度1500Lx,光照时间8h/d的环境条件下,经过7~15天培养,芽长高并绽开成莲座状。
C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后,剥去部分叶片,用中性肥皂水洗5分钟,用纱布包好,清水冲洗12小时;②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟;③再用浓度为75%的酒精浸泡8秒;④ 吐温80无菌水浸泡2分钟;⑤再用无菌水洗5遍至无泡沫。
D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.3 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养,温度21℃,光照强度1500Lx,光照时间8h/d,培养40~60天后,生长点膨大成直径2cm的叶丛。
E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.5cm小块,接种于脱毒培养基中,在温度为21℃,光照时间为8h/d,光照强度为2000Lx的环境条件下,经过40~60天培养,形成带球的瓶苗。
F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测,经检测确认无任何病虫害现象,并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒,即为百合脱毒种苗。
实施例2:东方百合种球脱毒方法,包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球,用浓度为30%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟;将消过毒的泥炭用水拌湿,使其含水量为50%,备用;再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中,每箱下种22个种球,浇定根水,然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面;按切花种植方法正常管理,保持泥炭50%的水分;在温度为22℃,湿度为75%,光照强度1800Lx,光照时间10h/d的条件下,经过5~7天后,芽长到5.5cm时进行热处理脱毒。
B、热处理脱毒:将温度控制在36℃之间,湿度为80%,光照强度1500Lx,光照时间10h/d的环境条件下,经过7~15天培养,芽长高并绽开成莲座状。
C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后,剥去部分叶片,用中性肥皂水洗5分钟,用纱布包好,清水冲洗12小时;②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟;③再用浓度为75%的酒精浸泡11秒;④ 吐温80无菌水浸泡3分钟;⑤再用无菌水洗6遍至无泡沫。
D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.4 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养,温度22℃,光照强度2000Lx,光照时间10h/d,培养40~60天后,生长点膨大成直径3cm的叶丛。
其中,诱导培养基为:1/2MS+BA 4mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。
E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.5cm小块,接种于脱毒培养基中,在温度为22℃,光照时间为10h/d,光照强度为2500Lx的环境条件下,经过40~60天培养,形成带球的瓶苗。
F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测,经检测确认无任何病虫害现象,并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒,即为百合脱毒种苗。
实施例3: 东方百合种球脱毒方法,包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球,用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟;将消过毒的泥炭用水拌湿,使其含水量为55%,备用;再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中,每箱下种25个种球,浇定根水,然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面;按切花种植方法正常管理,保持泥炭55%的水分;在温度为23℃,湿度为80%,光照强度2000Lx,光照时间12h/d的条件下,经过5~7天后,芽长到6cm时进行热处理脱毒。
B、热处理脱毒:将温度控制在38℃之间,湿度为85%,光照强度1500Lx,光照时间12h/d的环境条件下,经过7~15天培养,芽长高并绽开成莲座状。
C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后,剥去部分叶片,用中性肥皂水洗5分钟,用纱布包好,清水冲洗12小时;②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟;③再用浓度为75%的酒精浸泡14秒;④ 吐温80无菌水浸泡2分钟;⑤再用无菌水洗7遍至无泡沫。
D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养,温度23℃,光照强度3000Lx,光照时间12h/d,培养40~60天后,生长点膨大成直径2cm的叶丛。
其中,诱导培养基为:1/2MS+BA 4mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。
E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.5cm小块,接种于脱毒培养基中,在温度为23℃,光照时间为12h/d,光照强度为3000Lx的环境条件下,经过40~60天培养,形成带球的瓶苗。
脱毒培养基为:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。
其中,病毒唑的添加方法如下:
a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液。
b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛,用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。
c.将高温灭菌后的培养基:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L,冷至40℃时,吸取病毒唑母液,按5mg/L用量添加后摇匀,分装入无菌瓶中,待冷却凝固后用于药物脱毒接种。
F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测,经检测确认无任何病虫害现象,并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒,即为百合脱毒种苗。
Claims (5)
1.东方百合种球脱毒方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球,用浓度为20~40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟;将消过毒的泥炭用水拌湿,使其含水量为45~55%,备用;再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的基质中,每箱下种20~25个种球,浇定根水,然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面;按切花种植方法正常管理,保持基质45~55%的水分;在温度为21~23℃,湿度为70~80%,光照强度1500~2000Lx,光照时间8~12h/d的条件下,经过5~7天后,芽长到5~6cm时进行热处理脱毒;
B、热处理脱毒:将温度控制在35~38℃之间,湿度为70~85%,光照强度1500Lx,光照时间8~12h/d的环境条件下,经过7~15天培养,芽长高并绽开成莲座状;
C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后,剥去部分叶片,用中性肥皂水洗5分钟,用纱布包好,清水冲洗12小时;②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟;③再用浓度为75%的酒精浸泡8~15秒;④ 吐温80无菌水浸泡2~3分钟;⑤再用无菌水洗5~7遍至无泡沫;
D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.3~0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养,温度21~23℃,光照强度1500~3000Lx,光照时间8~12h/d,培养40~60天后,生长点膨大成直径2~3cm的叶丛,所述诱导培养基为: 1/2MS+BA2.5~5mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L;
E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.5cm小块,接种于脱毒培养基中,脱毒培养基为:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L,在温度为21~23℃,光照时间为8~12h/d,光照强度为2000~3000Lx的环境条件下,经过40~60天培养,形成带球的瓶苗;
F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测,经检测确认无任何病虫害现象,并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒,即为百合脱毒种苗。
2.根据权利要求1所述的东方百合种球脱毒方法,其特征在于,步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。
3.根据权利要求1所述的东方百合种球脱毒方法,其特征在于,步骤D是采集长度为0.3~0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。
4.根据权利要求2所述的东方百合种球脱毒方法,其特征在于,步骤D是采集长度为0.3~0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法,其特征在于,
步骤E中病毒唑的添加方法如下:
a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液;
b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛,用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液;
c.将高温灭菌后的培养基:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L,冷至35~40℃时,吸取病毒唑母液,按5mg/L用量添加后摇匀,分装入无菌瓶中,待冷却凝固后用于药物脱毒接种。
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