CN110199876A - 一种苦苣菜组织培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苦苣菜组织培养的方法，涉及组织培养技术领域。本发明包括无菌苗获得，愈伤组织的诱导培养，愈伤组织的分化培养，生长芽生根培养，试管苗移栽、定植，本发明在愈伤组织的分化培养中的10种培养基上均附加琼脂7～10g/L‑1，白砂糖15～25g/L‑1，壳聚糖为0.5～2g/L‑1，黄瓜汁为100～300g/L‑1和活性炭为I～3g/L‑1，能够调节苦苣菜根、茎、叶的生长发育，显著提高叶片的叶绿素含量，提高可溶性蛋白质和可溶性糖的含量，使植株起苗快、长势旺、植株高且健壮、叶长且展开叶片多，能够加快苦苣菜的新陈代谢速度，因而具有壮苗促长的效果，能够在平均叶长以及芽平均伸长高度不受影响的前提下降低了培养基的制备成本，能够为植株提供养分、水分，并能起到透气的效用。

Description

一种苦苣菜组织培养的方法
技术领域
本发明属于组织培养技术领域，特别是涉及一种苦苣菜组织培养的方法。
背景技术
苦苣菜又叫苦菜、苦苣等，为菊科苦苣菜属一年生或2年生草本植物，生长于山坡、山谷林缘、林下或平地田间、空旷处、近水处，在中国的很多地区有分布，苦苣菜地上含苦苣菜苷等成分，全草入药，具有凉血止血、清热解毒等功效，对痢疾、口疮等多种疾病有疗效，其嫩茎叶是人们喜食的野菜，也是家养动物喜食的青饲料，近年来人们发现，把苦苣菜作为青饲料喂饲家养动物，能减少腹泻、肠炎等疾病，因苦苣菜具有多种用途，长期以来人们始终采摘苦苣菜作为药用、饲用或食用，使其野生资源遭到严重破坏，致使野生苦苣菜在大连地区成了濒危植物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苦苣菜组织培养的方法，通过在愈伤组织的分化培养中的10种培养基上均附加琼脂7～10g/L-1，白砂糖15～25g/L-1，壳聚糖为0.5～2g/L-1，黄瓜汁为100～300g/L-1和活性炭为I～3g/L-1，能够缩短苦苣菜组织的进程。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种苦苣菜组织培养的方法，包括以下步骤：
SS01无菌苗获得：从山林草地上的野生苦苣菜上采收籽粒饱满的苦苣菜种子，放到磨口广口瓶中，用蒸馏水洗涤4次，再用70％乙醇灭菌25s，迅速用无菌水洗涤2次，接着用0.05％二氯化汞灭菌15min，最后用无菌水振荡洗涤6次，获得无菌种子，将无菌种子接种到装有无菌炉灰渣的培养瓶中，瓶中炉灰渣是经过筛、洗涤、烘干，直径约0.2～0.3cm的颗粒状炉灰渣.将颗粒状炉灰清装瓶后，用1/2MS培养基完全浸透，并高温高压灭菌，接种时用镊子将无菌种子插入炉灰渣内约0.4cm，每个培养瓶中接种10粒种子，置于温度为25C的条件下进行暗培养，在多数种子开始发芽时，将培养瓶转到光照强度3200Lx、温度25摄氏度的条件下进行光照培养，培养30～35d即可获得生长出2～3片真叶的苦苣菜无菌苗；
SS02愈伤组织的诱导培养：将具有2～3片真叶的苦苣菜无菌苗的根部和上部剪掉，保留具有2片子叶和1片真叶的下胚轴，接种到培养基上，在共27种愈伤组织诱导培养的培养基上，每个培养接种40个下胚轴，重复2次，在25摄氏度条件下进行暗培养(无光照)和光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS03愈伤组织的分化培养：取苦苣菜下胚轴诱导培养的愈伤组织，在无菌条件下切成长0.3～0.5cm的愈伤组织块，接种到10种培养基，在25摄氏度条件下光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS04生长芽生根培养：将培养55～65d，长势旺盛的生长芽切下，接种到培养基上进行生根培养，每个培养接种40个生长芽，重复2次，在25摄氏度条件下光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS05试管苗移栽、定植：试管苗培养到29d时，将培养瓶的瓶塞去掉，在日光温室较强的光照下炼苗4～5d，待培养瓶内的固体培养基表面刚出现菌落时，用镊子把试管苗拔出，洗去附着在根部的培养基后，移栽到上层为约7cm厚鲁糠灰的日光温室苗床上，移裁后的前13d在苗床上面加小拱棚膜以保持湿度80％以上，温度在18～30摄氏度，小拱棚上面加遮阴网防止直射光照，将移裁成活的试管苗，一次性定植到山林旁。
进一步地，所述SS02中愈伤组织的诱导培养基包括如下组分：以MS+琼脂4.8g/L-1+蔗糖42g/L-1+KT 0.4mg/L-1+NAA 0.2mg/L-1为基本培养基，附加浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/L-1IAA、IBA和2，4-D的3种生长素。
进一步地，所述SS03中的10种培养基分别为：White+ZT0.6mg/L-1+NAA0.05mg/L-1；White+ZT0.6mg/L-1+NAA 0.1mg/L-1；White+ZT0.8mg/L-1+NAA 0.05mg/L-1；White+ZT0.8mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；White+ZT 1.0mg/L-1+NAA 0.15mg/L-1；1/2MS+ZT 0.6mg/L-1+NAA0.05mg/L-1；1/2MS+ZT0.6mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；1/2MS+ZT 0.8mg/L-1+NAA 0.05mg/L-1；1/2MS+ZT 0.8mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；1/2MS+mg/L-1+NAA 0.15mg/L-1。
进一步地，所述SS04中生长芽生根培养基包括如下组分：以LS、No和1/4MS为基本培养基，附加浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L-1的IAA、IBA和ABT2号的培养基。
进一步地，所述SS03中的10种培养基均附加琼脂7～10g/L-1，白砂糖15～25g/L-1，壳聚糖为0.5～2g/L-1，黄瓜汁为100～300g/L-1，活性炭为I～3g/L-1。
本发明具有以下有益效果：
本发明SS03中的10种培养基均附加琼脂7～10g/L-1，白砂糖15～25g/L-1，壳聚糖为0.5～2g/L-1，黄瓜汁为100～300g/L-1和活性炭为I～3g/L-1，壳聚糖是一种天然的植物蛋白质生长调节剂，对苦苣菜的生长有显著的促进作用，其能够调节苦苣菜根、茎、叶的生长发育，显著提高叶片的叶绿素含量，提高可溶性蛋白质和可溶性糖的含量，使植株起苗快、长势旺、植株高且健壮、叶长且展开叶片多；黄瓜汁能够有效提高苦苣菜小苗的健壮度，黄瓜汁中的黄瓜酶具有很强的生物活性，能够加快苦苣菜的新陈代谢速度，因而具有壮苗促长的效果；活性炭能够抑制苦苣菜褐化现象，提高成活率，促进植株生长，对提高成苗率以及提高大苗的百分比均有显著的作用；以白砂糖作为碳源，在平均叶长以及芽平均伸长高度不受影响的前提下降低了培养基的制备成本；而琼脂能够为植株提供养分、水分，并能起到透气的效用。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种苦苣菜组织培养的方法，包括以下步骤：
SS01无菌苗获得：从山林草地上的野生苦苣菜上采收籽粒饱满的苦苣菜种子，放到磨口广口瓶中，用蒸馏水洗涤4次，再用70％乙醇灭菌25s，迅速用无菌水洗涤2次，接着用0.05％二氯化汞灭菌15min，最后用无菌水振荡洗涤6次，获得无菌种子，将无菌种子接种到装有无菌炉灰渣的培养瓶中，瓶中炉灰渣是经过筛、洗涤、烘干，直径约0.2～0.3cm的颗粒状炉灰渣.将颗粒状炉灰清装瓶后，用1/2MS培养基完全浸透，并高温高压灭菌，接种时用镊子将无菌种子插入炉灰渣内约0.4cm，每个培养瓶中接种10粒种子，置于温度为25C的条件下进行暗培养，在多数种子开始发芽时，将培养瓶转到光照强度3200Lx、温度25摄氏度的条件下进行光照培养，培养30～35d即可获得生长出2～3片真叶的苦苣菜无菌苗；
SS02愈伤组织的诱导培养：将具有2～3片真叶的苦苣菜无菌苗的根部和上部剪掉，保留具有2片子叶和1片真叶的下胚轴，接种到培养基上，在共27种愈伤组织诱导培养的培养基上，每个培养接种40个下胚轴，重复2次，在25摄氏度条件下进行暗培养(无光照)和光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS03愈伤组织的分化培养：取苦苣菜下胚轴诱导培养的愈伤组织，在无菌条件下切成长0.3～0.5cm的愈伤组织块，接种到10种培养基，在25摄氏度条件下光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS04生长芽生根培养：将培养55～65d，长势旺盛的生长芽切下，接种到培养基上进行生根培养，每个培养接种40个生长芽，重复2次，在25摄氏度条件下光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS05试管苗移栽、定植：试管苗培养到29d时，将培养瓶的瓶塞去掉，在日光温室较强的光照下炼苗4～5d，待培养瓶内的固体培养基表面刚出现菌落时，用镊子把试管苗拔出，洗去附着在根部的培养基后，移栽到上层为约7cm厚鲁糠灰的日光温室苗床上，移裁后的前13d在苗床上面加小拱棚膜以保持湿度80％以上，温度在18～30摄氏度，小拱棚上面加遮阴网防止直射光照，将移裁成活的试管苗，一次性定植到山林旁。
其中，所述SS02中愈伤组织的诱导培养基包括如下组分：以MS+琼脂4.8g/L-1+蔗糖42g/L-1+KT 0.4mg/L-1+NAA 0.2mg/L-1为基本培养基，附加浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/L-1IAA、IBA和2，4-D的3种生长素。
其中，所述SS03中的10种培养基分别为：White+ZT0.6mg/L-1+NAA0.05mg/L-1；White+ZT0.6mg/L-1+NAA 0.1mg/L-1；White+ZT0.8mg/L-1+NAA0.05mg/L-1；White+ZT0.8mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；White+ZT 1.0mg/L-1+NAA0.15mg/L-1；1/2MS+ZT 0.6mg/L-1+NAA 0.05mg/L-1；1/2MS+ZT0.6mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；1/2MS+ZT 0.8mg/L-1+NAA0.05mg/L-1；1/2MS+ZT0.8mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；1/2MS+mg/L-1+NAA0.15mg/L-1。
其中，所述SS04中生长芽生根培养基包括如下组分：以LS、No和1/4MS为基本培养基，附加浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L-1的IAA、IBA和ABT2号的培养基。
其中，所述SS03中的10种培养基均附加琼脂7～10g/L-1，白砂糖15～25g/L-1，壳聚糖为0.5～2g/L-1，黄瓜汁为100～300g/L-1，活性炭为I～3g/L-1。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (5)

1.一种苦苣菜组织培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：
SS01 无菌苗获得：从山林草地上的野生苦苣菜上采收籽粒饱满的苦苣菜种子，放到磨口广口瓶中，用蒸馏水洗涤4次，再用70％乙醇灭菌25s，迅速用无菌水洗涤2次，接着用0.05％二氯化汞灭菌15min，最后用无菌水振荡洗涤6次，获得无菌种子，将无菌种子接种到装有无菌炉灰渣的培养瓶中，瓶中炉灰渣是经过筛、洗涤、烘干，直径约0.2～0.3cm的颗粒状炉灰渣.将颗粒状炉灰清装瓶后，用1/2MS培养基完全浸透，并高温高压灭菌，接种时用镊子将无菌种子插入炉灰渣内约0.4cm，每个培养瓶中接种10粒种子，置于温度为25C的条件下进行暗培养，在多数种子开始发芽时，将培养瓶转到光照强度3200Lx、温度25摄氏度的条件下进行光照培养，培养30～35d即可获得生长出2～3片真叶的苦苣菜无菌苗；
SS02 愈伤组织的诱导培养：将具有2～3片真叶的苦苣菜无菌苗的根部和上部剪掉，保留具有2片子叶和1片真叶的下胚轴，接种到培养基上，在共27种愈伤组织诱导培养的培养基上，每个培养接种40个下胚轴，重复2次，在25摄氏度条件下进行暗培养(无光照)和光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS03 愈伤组织的分化培养：取苦苣菜下胚轴诱导培养的愈伤组织，在无菌条件下切成长0.3～0.5cm的愈伤组织块，接种到10种培养基，在25摄氏度条件下光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS04 生长芽生根培养：将培养55～65d，长势旺盛的生长芽切下，接种到培养基上进行生根培养，每个培养接种40个生长芽，重复2次，在25摄氏度条件下光照培养(每天12h光照，光照强度3200Lx)；
SS05 试管苗移栽、定植：试管苗培养到29d时，将培养瓶的瓶塞去掉，在日光温室较强的光照下炼苗4～5d，待培养瓶内的固体培养基表面刚出现菌落时，用镊子把试管苗拔出，洗去附着在根部的培养基后，移栽到上层为约7cm厚鲁糠灰的日光温室苗床上，移裁后的前13d在苗床上面加小拱棚膜以保持湿度80％以上，温度在18～30摄氏度，小拱棚上面加遮阴网防止直射光照，将移裁成活的试管苗，一次性定植到山林旁。
2.根据权利要求1所述的一种苦苣菜组织培养的方法，其特征在于，所述SS02中愈伤组织的诱导培养基包括如下组分：以MS+琼脂4.8g/L-1+蔗糖42g/L-1+KT 0.4mg/L-1+NAA0.2mg/L-1为基本培养基，附加浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/L- 1IAA、IBA和2，4-D的3种生长素。
3.根据权利要求1所述的一种苦苣菜组织培养的方法，其特征在于，所述SS03中的10种培养基分别为：White+ZT0.6mg/L-1+NAA0.05mg/L-1；White+ZT0.6mg/L-1+NAA 0.1mg/L-1；White+ZT0.8mg/L-1+NAA 0.05mg/L-1；White+ZT0.8mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；White+ZT 1.0mg/L-1+NAA 0.15mg/L-1；1/2MS+ZT 0.6mg/L-1+NAA 0.05mg/L-1；1/2MS+ZT0.6mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；1/2MS+ZT 0.8mg/L-1+NAA 0.05mg/L-1；1/2MS+ZT 0.8mg/L-1+NAA0.1mg/L-1；1/2MS+mg/L-1+NAA 0.15mg/L-1。
4.根据权利要求1所述的一种苦苣菜组织培养的方法，其特征在于，所述SS04中生长芽生根培养基包括如下组分：以LS、No和1/4MS为基本培养基，附加浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L-1的IAA、IBA和ABT2号的培养基。
5.根据权利要求3所述的一种苦苣菜组织培养的方法，其特征在于，所述SS03中的10种培养基均附加琼脂7～10g/L-1，白砂糖15～25g/L-1，壳聚糖为0.5～2g/L-1，黄瓜汁为100～300g/L-1，活性炭为I～3g/L-1。
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