CN116584393A - 一种银杏的组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银杏的组培繁殖方法，属于植物组织培养技术领域，包括以下步骤：步骤S1、抗褐化培养基的配制；步骤S2、银杏茎段灭菌处理；步骤S3、银杏愈伤组织及其诱导分化的培养；步骤S4、银杏幼苗的移栽。本发明通过用消毒剂A和消毒剂B代替升汞对银杏组织进行灭菌，保证灭菌效果的同时大大降低了安全隐患，其次通过在生长调节剂中引入生长素、细胞分裂素、诱导剂、分化剂和AgNO3，促进了银杏组织愈伤以及诱导分化，最后在培养过程中加入褐变抑制剂，通过引入抗氧化剂和多酚氧化酶抑制剂，再加入植物生长调节剂，大大降低了银杏茎段组织的褐化程度，提高了银杏的移栽成活率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种银杏的组培繁殖方法。
背景技术
利用植物的一部分，如茎尖等，在适宜的条件下培养，使其发育成具有完整根茎叶的植株，称之为组织培养，或称微体繁殖，组织培养主要有茎尖培养和幼胚培养两大类。
银杏(Glnkgo biloba L.)具有较高观赏、食用等价值，其在生长过程中会产生多种特有的次生代谢化合物，如银杏黄酮和银杏内酯等，是我国独存的叶果材兼优的珍稀名贵树种，现仅存一科一属一种，素有裸子植物“活化石”之称，被广泛应用于园林景观绿化及城市行道树中，具有较高的经济、生态及文化价值。但由于银杏为雌雄异株植物，实生苗开花结果时间较长，常规育种效率低、周期长，因此利用植物组织培养技术开展银杏优良品种的繁育，是苗木生产过程中最行之有效的技术之一。但银杏的组织培养仍面临很多难点，如污染严重、褐化率高等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种银杏的组培繁殖方法，以解决背景技术中存在的隐形组织培养过程中存在的污染严重以及褐化率高的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种银杏的组培繁殖方法，包括以下步骤：
步骤S1、抗褐化培养基的配制：向MS培养基(不含蔗糖和琼脂)中加入蔗糖、琼脂、植物生长调节剂和褐变抑制剂混合均匀，配制完成后装于培养瓶中，在高温高压灭菌锅中121℃、0.15MP条件下灭菌25min，备用；
步骤S2、银杏茎段灭菌处理：将银杏茎段放置于已灭菌的培养瓶中，先用消毒剂A浸泡5-30min，后再用消毒剂B浸泡5-15min，轻轻搅动培养瓶，促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底，将消毒液倒出后立即倒入事先准备好的无菌水，漂洗4-5次，最大程度减少消毒剂对银杏茎段组织的损害；
步骤S3、银杏愈伤组织及其诱导分化的培养：将灭菌处理后的银杏茎段放入抗褐化培养基中，于20-22℃、光照强度2000-2200lx、湿度70-80％、光照10-12h/d的条件下光照28-30天，得到不定芽和不定根；
步骤S4、银杏幼苗的移栽：将得到的生根银杏幼苗从培养瓶中取出并用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石按照3:2:1比例混合构成的混合基质中，置于营养钵内培养。
优选的，步骤S1中所述蔗糖、琼脂、植物生长调节剂和褐变抑制剂的用量比为4-5：0.8-0.9：0.606-0.656：0.049-0.059。
优选的，步骤S1中所述植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素、诱导剂、分化剂和AgNO3按照用量比为3-3.2：2-2.2：500-520：100-120：1-1.2混合得到，其中，生长素为L6-BA，细胞分裂素为NAA，诱导剂为Gln，分化剂为壳聚糖。
优选的，步骤S1中所述褐变抑制剂为NH4NO3、KH2PO4、NH4Cl、Na2MoO4˙2H2O、H3BO3、MnSO4˙4H2O、VC和Na2S2O3按照质量比为5.5-5.7：0.56-0.6：0.1-0.12：0.0125-0.015：0.24-0.25：0.223-0.23：0.1-0.12：0.05-0.1混合得到，其中较高N,K元素含量对于银杏愈伤组织的诱导有利，而微量元素Mo、B和Mn可抑制银杏组织褐变，VC可以作为抗氧化剂，而Na2S2O3可以抑制多酚氧化酶PPO的活性。
优选的，步骤S2中所述银杏外植体为三月下旬至五月中旬抽出的当年生梅核类银杏的上茎段和中茎段的任意一种，三月下旬至五月中旬抽出的当年生梅核类银杏枝条具有最高的诱变潜力，且由于具有一定的位置效应，上段和中段诱导效果较好。
优选的，步骤S2中所述银杏茎段事先置于自来水龙头下流水冲洗1-2h，以除去材料表面的污染物。
优选的，步骤S2中所述消毒剂A为浓度为2％的市售次氯酸钠，消毒剂B为乙醇和双氧水以1：0.1-0.2混合制得，其中乙醇的浓度为70-75％，双氧水的浓度为10-12％。
本发明的有益效果：
1.本发明选取三月下旬至五月中旬抽出的当年生梅核类银杏枝条来进行组织培养，由于其具有最高的诱变潜力，且由于具有一定的位置效应，上段、中段诱导效果较茎段外植体茎尖和下段部分的诱导率较高；
2.本发明采取消毒剂A和消毒剂B组合取代升汞对银杏茎段进行灭菌处理，由于次氯酸钠能分解出具有杀菌作用的氯气，灭菌后易于除去，不留残余，杀菌力强，对植物材料无害，而浓度为75％的乙醇具有较强的穿透力和杀菌力，能够顺利地渗入到细菌体内，吸收细菌蛋白的水分使其脱水变性凝固而失去功能，使细菌蛋白质变性，以达到消毒杀菌的目的，在乙醇溶液中加入少量的过氧化氢，常温下随时可分解还原成O2，期间会有氧原子分离出来，氧原子具有极强的氧化和分解能力，能穿透细菌的细胞膜，与其发生不可逆的反应，杀死细菌，在消毒完成后分解为氧气和水，减少了污染；
3.本发明通过配制抗褐变培养基时加入褐变抑制剂，较高N,K元素含量的化合物对于银杏愈伤组织的诱导有利，而微量元素Mo、B和Mn可抑制银杏组织褐变，VC可以作为抗氧化剂，而Na2S2O3可以抑制多酚氧化酶PPO的活性，有效减少了银杏组织培养过程中的褐变。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种植物生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
将3份L6-BA、2份NAA、500份Gln、100份壳聚糖和1份AgNO3混合均匀，得到植物生长调节剂。
实施例2
一种植物生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
将3.1份L6-BA、2.1份NAA、510份Gln、110份壳聚糖和1.1份AgNO3混合均匀，得到植物生长调节剂。
实施例3
一种植物生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
将3.2份L6-BA、2.2份NAA、520份Gln、120份壳聚糖和1.2份AgNO3混合均匀，得到植物生长调节剂。
实施例4
一种褐变抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
将5.5份NH4NO3、0.56份KH2PO4、0.1份NH4Cl、0.0125份Na2MoO4˙2H2O、0.24份H3BO3、0.223份MnSO4˙4H2O、0.1份VC、0.05份Na2S2O3混合均匀，得到褐变抑制剂。
实施例5
一种褐变抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
将5.6份NH4NO3、0.58份KH2PO4、0.11份NH4Cl、0.0137份Na2MoO4˙2H2O、0.245份H3BO3、0.226份MnSO4˙4H2O、0.11份VC、0.075份Na2S2O3混合均匀，得到褐变抑制剂。
实施例6
一种褐变抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
将5.7份NH4NO3、0.6份KH2PO4、0.12份NH4Cl、0.015份Na2MoO4˙2H2O、0.25份H3BO3、0.23份MnSO4˙4H2O、0.12份VC、0.1份Na2S2O3混合均匀，得到褐变抑制剂。
实施例7
一种银杏的组培繁殖方法，包括以下步骤：
步骤S1、抗褐化培养基的配制：向MS培养基(不含蔗糖和琼脂)中加入400mg蔗糖、80mg琼脂、60.6mg实施例1中所制备的植物生长调节剂和4.9mg实施例4中所制备的褐变抑制剂混合均匀，配制完成后装于培养瓶中，在高温高压灭菌锅中120℃、0.14MP条件下灭菌24min，备用；
步骤S2、银杏茎段灭菌处理：将银杏茎段放置于已灭菌的培养瓶中，先用2％的市售次氯酸钠浸泡5min，后再用70％的乙醇和10％的过氧化氢混合液浸泡5min，轻轻搅动培养瓶，将消毒液倒出后立即倒入事先准备好的无菌水，漂洗4次；
步骤S3、银杏愈伤组织及其诱导分化的培养：将灭菌处理后的银杏茎段放入抗褐化培养基中，于20℃、光照强度2000lx、湿度70％、光照10h/d的条件下光照28天，得到不定芽和不定根；
步骤S4、银杏幼苗的移栽：将得到的生根银杏幼苗从培养瓶中取出并用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石按照3:2:1比例混合构成的混合基质中，置于营养钵内培养。
实施例8
步骤S1、抗褐化培养基的配制：向MS培养基(不含蔗糖和琼脂)中加入450mg蔗糖、85mg琼脂、63.1mg实施例2中所制备的植物生长调节剂和5.4mg实施例5中所制备的褐变抑制剂混合均匀，配制完成后装于培养瓶中，在高温高压灭菌锅中121℃、0.15MP条件下灭菌25min，备用。
步骤S2、银杏茎段灭菌处理：将银杏茎段放置于已灭菌的培养瓶中，先用2％的市售次氯酸钠浸泡18min，后再用72.5％的乙醇和11％的过氧化氢混合液浸泡10min，轻轻搅动培养瓶，将消毒液倒出后立即倒入事先准备好的无菌水，漂洗4次；
步骤S3、银杏愈伤组织及其诱导分化的培养：将灭菌处理后的银杏茎段放入抗褐化培养基中，于21℃、光照强度2100lx、相对湿度75％、光照11h/d的条件下光照29天，得到不定芽和不定根；
步骤S4、银杏幼苗的移栽：将得到的生根银杏幼苗从培养瓶中取出并用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石按照3:2:1比例混合构成的混合基质中，置于营养钵内培养。
实施例9
步骤S1、抗褐化培养基的配制：向MS培养基(不含蔗糖和琼脂)中加入500mg蔗糖、90mg琼脂、65.6mg实施例3中所制备的植物生长调节剂和5.9mg实施例6中所制备的褐变抑制剂混合均匀，配制完成后装于培养瓶中，在高温高压灭菌锅中122℃、0.16MP条件下灭菌26min，备用。
步骤S2、银杏茎段灭菌处理：将银杏茎段放置于已灭菌的培养瓶中，先用2％的市售次氯酸钠浸泡30min，后再用75％的乙醇和12％的过氧化氢混合液浸泡15min，轻轻搅动培养瓶，将消毒液倒出后立即倒入事先准备好的无菌水，漂洗5次；
步骤S3、银杏愈伤组织及其诱导分化的培养：将灭菌处理后的银杏茎段放入抗褐化培养基中，于22℃、光照强度2200lx、湿度80％、光照12h/d的条件下光照30天，得到不定芽和不定根；
步骤S4、银杏幼苗的移栽：将得到的生根银杏幼苗从培养瓶中取出并用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石按照3:2:1比例混合构成的混合基质中，置于营养钵内培养。
对比例1
本对比例与实施例7相比未在银杏的组培繁殖过程中的制备过程中添加褐变抑制剂，其余步骤和参数均相同，本对比例不再重复赘述。
对比例2
本对比例与实施例8相比仅将消毒剂A和消毒剂B换成升汞，其余步骤和参数均相同，本对比例不再重复赘述。
对实施例7-实施例9和对比例1-对比例2中的实验结果进行统计，结果如表1所示：
表1
| 项目 | 实施例7 | 实施例8 | 实施例9 | 对比例1 | 对比例2 |
| 开始愈伤时间/d | 7 | 7 | 8 | 19 | 20 |
| 愈伤组织平均直径/cm | 5.0 | 5.5 | 5.2 | 2.7 | 2.4 |
| 移栽成活率/％ | 93.2 | 94.1 | 92.9 | 60.3 | 60.8 |
由表1可以看出，由于对比例1在对银杏组培繁殖的过程中未添加褐变抑制剂，使得银杏组织生长过程中多酚氧化酶参与发生褐化现象，而实施例7-实施例9中加入了褐变抑制剂，使得多酚氧化酶失活因此组织正常愈伤并分化成活，而对比例2中用升汞代替次氯酸钠、乙醇和过氧化氢对银杏组织进行灭菌，灭菌后难以去除组织表面残留的升汞，同时对人体也存在着极大的安全隐患，因此本发明中采取消毒剂A和消毒剂B结合，同时在培养过程中加入褐变抑制剂，大大提高了银杏的移栽成活率。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种银杏的组培繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1、抗褐化培养基的配制：向MS培养基中加入蔗糖、琼脂、植物生长调节剂和褐变抑制剂混合均匀，配制完成后装于培养瓶中，在高温高压灭菌锅中灭菌，备用；
步骤S2、银杏茎段灭菌处理：将银杏茎段放置于已灭菌的培养瓶中，先用消毒剂A浸泡5-30min，再用消毒剂B浸泡5-15min，再将消毒剂倒出后立即倒入事先准备好的无菌水，漂洗4-5次；
步骤S3、银杏愈伤组织及其诱导分化的培养：将灭菌处理后的银杏茎段放入抗褐化培养基中，于20-22℃、光照强度2000-2200lx、湿度70-80％、光照10-12h/d的条件下光照28-30天，得到不定芽和不定根；
步骤S4、银杏幼苗的移栽：将得到的生根银杏幼苗从培养瓶中取出并用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石按照3:2:1比例混合构成的混合基质中，置于营养钵内培养。
2.根据权利要求1所述的一种银杏的组培繁殖方法，其特征在于：步骤S1中所述蔗糖、琼脂、植物生长调节剂和褐变抑制剂的质量比为4-5：0.8-0.9：0.606-0.656：0.049-0.059。
3.根据权利要求1所述的一种银杏的组培繁殖方法，其特征在于：步骤S1中所述植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素、诱导剂、分化剂和AgNO3按照用量比为3-3.2：2-2.2：500-520：100-120：1-1.2混合得到，其中，生长素为L6-BA，细胞分裂素为NAA，诱导剂为Gln，分化剂为壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的一种银杏的组培繁殖方法，其特征在于：步骤S1中所述褐变抑制剂为NH4NO3、KH2PO4、NH4Cl、Na2MoO4˙2H2O、H3BO3、MnSO4˙4H2O、VC和Na2S2O3按照质量比为5.5-5.7：0.56-0.6：0.1-0.12：0.0125-0.015：0.24-0.25：0.223-0.23：0.1-0.12：0.05-0.1混合得到。
5.根据权利要求1所述的一种银杏的组培繁殖方法，其特征在于：步骤S2中所述银杏外植体为三月下旬至五月中旬抽出的当年生梅核类银杏的上茎段和中茎段的任意一种，且银杏茎段事先置于自来水龙头下流水冲洗1-2h。
6.根据权利要求1所述的一种银杏的组培繁殖方法，其特征在于：步骤S2中所述消毒剂A为浓度为2％的市售次氯酸钠，消毒剂B为乙醇和双氧水以1：0.1-0.2混合制得，其中乙醇的浓度为70-75％，双氧水的浓度为10-12％。
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- 2023-06-15 CN CN202310707768.1A patent/CN116584393A/zh active Pending
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