CN105532451A - 一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诱导再生技术领域，尤其涉及一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法。它包括无菌苗的获取、不定芽的诱导分化、不定芽的增殖培养、不定芽的生根培养以及幼苗移栽等步骤。不定芽的诱导分化期，选取培养30±2天的红花百里香无菌苗进行不定芽诱导培养，其诱导率最高可达94％，并且不定芽的生长状况良好。将红花百里香不定芽接种到增殖培养基中，其增殖系数最高达到39.90±1.72，不定芽的茎较粗、颜色泛绿。不定芽的生根培养及幼苗移栽，在第15天开始萌动生长出小根，30天平均生根数达到8.0，生根率为100％，将小苗移栽到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养，成活率为90％。

Description

一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法

技术领域

本发明属于诱导再生技术领域，尤其涉及一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法。

背景技术

红花百里香(ThymusserpyllumL.)属于唇形科百里香属，茎叶有香味，其茎株耐干旱、免修剪，作为园林绿化植物，其应用前景广阔。用其植株提取的百里香精油，能够有效的抑制霉菌和微生物的生长，并且能够缓解神经紧张感，在食品、化工领域均有很大用途。百里香精油是最强劲的抗菌剂之一，具有抗菌、消炎止痛、抗肿瘤、抗氧化、防止血栓形成及减缓身体器官组织衰老等重要的药用价值，可用于预防和治疗人类的疾病，并具有强烈的抗真菌活性和高效防腐性，对昆虫包括蚊子也具有祛除的功效。另外，百里香提取物还具有化感作用，有望成为新型的生物除草剂。总之，百里香精油一直是精油中的精品，在医药、食品加工、化妆品、精细化工及日常生活中被广泛应用。百里香精油潜在的应用价值：百里香精油对霉菌有良好的抑制作用，可以作为湿度较大地区人们家居之用。研究表明低浓度的百里香精油和百里酚就能够对发霉的墙壁进行消毒，并能够持久的抑制潮湿居所内的真菌生长(Klaric,Kosalecetal.2007)。在地中海沿岸国家，尤其是希腊和埃及等国人民喜欢使用百里香作为香辛调料。百里香精油可以刺激白细胞增殖，提升人体免疫系统(Elhabazi,Dickoetal.2006)，在治疗人免疫缺陷如癌症、白血病和AIDS方面有巨大的应用潜力。百里香加入香薰炉中使用，百里香可强化肺脏，对支气管炎很有帮助对呼吸系统感染者也特别有益，并可舒缓压力，消除神经性疼痛；百里香精油的主要成份——百里酚具有抗血小板凝集的功能，可以作为抗血栓和血管硬化的药物(Okazaki,Kawazoeetal.2002)。百里香还能强化神经，活化脑细胞，能提高记忆力和注意力。也能提振低落的情绪、筋疲力竭的感觉、以及挫败的沮丧感。目前，虽然关于百里香属植物的组织培养和快速繁殖技术研究有一些，其种类主要集中于普通百里香、东北百里香，有关于红花百里香(ThymusserpyllumL.)的组培技术未见报道。

发明内容

针对上述技术缺陷，本发明提供了一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，包括如下步骤：

S1.无菌苗的获取:取红花百里香种子包裹在纱布中，放入培育瓶，先用酒精浸泡消毒，再用无菌水冲洗后放入次氯酸钠溶液浸泡3±1min，最后用无菌水再次冲洗,消毒后的种子接种到1/2MS培养基得红花百里香无菌苗；

S2.不定芽的诱导分化:选取培养30±2天的红花百里香无菌苗，将其切成3±0.5cm且带有腋芽的茎段，接种到MS培养基中，进行不定芽诱导培养，28±2天后,茎段周围已经生成不定芽；

S3.不定芽的增殖培养:红花百里香不定芽生长到2±0.2cm时，将不定芽切分为每丛3-4个芽，转接到调整的MS培养基进行不定芽增殖培养；

S4.不定芽的生根培养及幼苗移栽：在红花百里香不定芽长到4cm以上时，将其切成3±0.2cm左右的茎段，接种到不定芽生根MS培养基上，诱导生根，在第15±1天开始萌动生长出小根，30±2天生根数达到8±1，当根长到3cm以上时进行移栽。

进一步：在上述红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，所述MS培养基分为大量元素、微量元素、铁盐和有机溶液四种母液的组合，如表1所述。在S1中的1/2MS培养基，在表1的基础上，大量元素减半其余元素不变的MS培养基。所述MS培养基还包括在母液中增加3±0.3％蔗糖和0.8±0.05％琼脂粉，调节pH＝5.8±0.5；MS培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌20±1min，培养温度为25±2℃，光照度2000-2500lx，光照周期12±1h/d。

再进一步：在上述红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，S1酒精浓度为70％-75％，次氯酸钠溶液的活性氯含量为10％±1％。

S2的MS培养基中，还加入细胞分裂激素6－BA和植物生长素萘乙酸NAA，加入后细胞分裂激素6－BA浓度是0.1mg/L-0.6mg/L，植物生长素萘乙酸NAA浓度是0.1mg/L-0.3mg/L，且细胞分裂激素6－BA和萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入；优选的细胞分裂激素6－BA浓度是0.1mg/L，植物激素生长素萘乙酸NAA浓度是0.3mg/L。

S3调整的MS培养基是指MS基本配方中大量元素(1、3/4、1/2、1/4、0)和微量元素(1、3/4、1/2、1/4、0)配比如表2所示，MS培养基是一种基本培养基，为了配制和使用方便，本领域技术人员把这种培养基的19中成分又分为4大类，即铁盐和有机溶液两种母液取用量不变，大量元素和微量元素取用量分别设置3/4、1/2、1/4、0，如表2的所示。优选的S3调整的MS培养基，还加入细胞分裂激素6－BA和植物生长素萘乙酸NAA，加入后细胞分裂激素6－BA浓度是0.1mg/L，植物生长素萘乙酸NAA浓度是0.3mg/L，且细胞分裂激素6－BA和萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入。

S4不定芽生根MS培养基，还加入植物生长素萘乙酸NAA，加入后萘乙酸NAA浓度小于或等于1.5mg/L，且萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入，优选的植物生长素萘乙酸NAA的浓度是1.0mg/L。

S4移栽前先将培育瓶瓶盖打开，保持湿润放置2d，取出小苗，用自来水冲去附着在根上的培养基，将小苗移栽到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养。

本发明中，6-BA：6-苄基腺嘌呤6-Benzylaminopurine；NAA：萘乙酸Naphthylaceticacid；MS：Murashige和Skoog培养基

与现有技术相比，本发明红花百里香(ThymusserpyllumL.)再生体系的建立，在不定芽的诱导分化期，培养30±2天的红花百里香无菌苗进行不定芽诱导培养，其诱导率最高可达94％，并且不定芽的生长状况良好。将红花百里香不定芽接种到增殖培养基中，其增殖系数最高达到39.90±1.72，不定芽的茎较粗、颜色泛绿。不定芽的生根培养及幼苗移栽，在第15天开始萌动生长出小根，30天平均生根数达到8.0±1，生根率为100％，将小苗移栽到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养，成活率为90％。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

1.无菌苗的获取

取300粒饱满的红花百里香种子包裹在纱布中，放入三角瓶，先用75％酒精浸泡30s消毒，用无菌水冲洗3遍，再用活性氯含量为10％的次氯酸钠溶液浸泡3min，用无菌水冲洗5遍；消毒后的种子接种到1/2MS培养基。

2.不定芽的诱导分化

选取培养30天左右、生长健壮、型态相当的红花百里香无菌苗，将其切成3cm左右、带有腋芽的茎段，接种到含有不同浓度6-BA(0.1、0.2、0.4、0.6)mg/L和NAA(0.1、0.2、0.3)mg/L的MS培养基中，每瓶5个茎段，每个处理10瓶，进行不定芽诱导培养，通过对比筛选出红花百里香的最佳不定芽诱导培养基。

一周后接种的茎段切口开始膨胀生长，10天左右切口处产生绿色愈伤组织,茎段表面开始产生突起；接种15天后腋芽表面的突起继续生长,诱导生成不定芽，4周后茎段周围已经生成许多不定芽。结果表明，MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.3mg/L培养基不定芽的诱导率最高，可达94％，并且不定芽的生长状况良好。

3.不定芽的增殖培养

当分化出的红花百里香不定芽生长到2cm左右时，将不定芽切分为每丛3-4个芽，转接到调整的MS培养基中，调整的MS培养基指MS基本配方中大量元素(1、3/4、1/2、1/4、0)和微量元素(1、3/4、1/2、1/4、0)配比如表2所示，添加上一实验筛选出来的最佳浓度的激素，进行不定芽的增殖培养，每瓶0.2g，每个处理3瓶，培养6周后，统计不定芽的鲜重。通过对比筛选出红花百里香的最佳不定芽增殖培养基。

将红花百里香不定芽接种到增殖培养基中，培养6周后，统计其鲜重、增殖系数及生长状况。结果表明，大量元素比例为1、微量元素比例为1/2时，即培养基A3+6-BA0.1mg/L+NAA0.3mg/L的增殖系数最高达到39.90±1.72不定芽的茎较粗、颜色泛绿，这个配比组合较适宜红花百里香不定芽的增殖生长。

4.不定芽的生根培养及幼苗移栽

在红花百里香不定芽长到4cm以上时，将其切成3cm左右的茎段，接种到含有不同浓度NAA(0、0.5、1.0、1.5mg/L的不定芽生根培养基上，诱导生根。MS+NAA1.0mg/L的培养基，在第15天开始萌动生长出小根，30天平均生根数达到8.0，生根率为100％。

当根长到3cm以上时进行移栽。移栽前先将组培瓶瓶盖打开，保持湿润放置2d，然后用镊子小心取出小苗，用自来水冲去附着在根上的培养基，后将小苗移栽到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养，成活率为90％。

表1：MS培养基成分母液种类

表2：培养基中大量元素与微量元素用量配比设置

Claims (10)

1.一种红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.无菌苗的获取:取红花百里香种子包裹在纱布中，放入培育瓶，先用酒精浸泡消毒，再用无菌水冲洗后放入次氯酸钠溶液浸泡3±1min，最后用无菌水再次冲洗,消毒后的种子接种到1/2MS培养基得红花百里香无菌苗；

S2.不定芽的诱导分化:选取培养30±2天的红花百里香无菌苗，将其切成3±0.5cm且带有腋芽的茎段，接种到MS培养基中，进行不定芽诱导培养，28±2天后,茎段周围已经生成不定芽；

S3.不定芽的增殖培养:红花百里香不定芽生长到2±0.2cm时，将不定芽切分为每丛3-4个芽，转接到调整的MS培养基进行不定芽增殖培养；

S4.不定芽的生根培养及幼苗移栽：在红花百里香不定芽长到4cm以上时，将其切成3±0.2cm左右的茎段，接种到不定芽生根MS培养基上，诱导生根，在第15±1天开始萌动生长出小根，30±2天生根数达到8±1，当根长到3cm以上时进行移栽。

2.根据权利要求1所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：所述MS培养基分为大量元素、微量元素、铁盐和有机溶液四种母液的组合，如表1所述。

3.根据权利要求1或2所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S1酒精浓度为70％-75％，次氯酸钠溶液的活性氯含量为10％±1％。

4.根据权利要求1或2所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S2的MS培养基中，还加入细胞分裂激素6－BA和植物生长素萘乙酸NAA，加入后细胞分裂激素6－BA浓度是0.1mg/L-0.6mg/L，植物生长素萘乙酸NAA浓度是0.1mg/L-0.3mg/L，且细胞分裂激素6－BA和萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入。

5.根据权利要求4所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S2的MS培养基中，细胞分裂激素6－BA浓度是0.1mg/L，植物激素生长素萘乙酸NAA浓度是0.3mg/L。

6.根据权利要求2所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S3调整的MS培养基是指MS培养基中大量元素和微量元素配比如表2所示。

7.根据权利要求6所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S3调整的MS培养基，还加入细胞分裂激素6－BA和植物生长素萘乙酸NAA，加入后细胞分裂激素6－BA浓度是0.1mg/L，植物生长素萘乙酸NAA浓度是0.3mg/L，且细胞分裂激素6－BA和萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入。

8.根据权利要求1或2所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S4不定芽生根MS培养基，还加入植物生长素萘乙酸NAA，加入后萘乙酸NAA浓度小于或等于1.5mg/L，且萘乙酸NAA需要在MS培养基灭菌前加入。

9.根据权利要求8所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S4不定芽生根MS培养基中植物生长素萘乙酸NAA的浓度是1.0mg/L。

10.根据权利要求1或2所述的红花百里香无菌苗诱导再生植株的方法，其特征在于：S4移栽前先将培育瓶瓶盖打开，保持湿润放置2d，取出小苗，用自来水冲去附着在根上的培养基，将小苗移栽到已灭菌的培养基质中，浸透水后放入人工温室培养。