CN113068618B - 一种异形玉叶金花组培快繁培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异形玉叶金花组培快繁培养基及培养方法，属于植物繁殖技术领域。本发明采用异形玉叶金花的嫩茎作为外植体，外植体消毒后通过诱导培养基产生大量的愈伤组织，愈伤组织转入继代培养基中继代3～4次后就会分化产生芽，待植株生长到2～3cm时，分成单株转接入增殖培养基中，培养30d后将诱导产生大量的丛生芽，再经过生根培养基养成独立完整的植株。本发明提供的培养基配方可诱导分化异形玉叶金花产生大量的植株，解决异形玉叶金花正面临濒危的困境。
Description
技术领域
本发明涉及植物繁殖技术领域，具体涉及一种异形玉叶金花组培快繁培养基及培养方法。
背景技术
异形玉叶金花为茜草科玉叶金花属的攀援灌木，因本种萼檐的5枚裂片全部都扩大成白色瓣状，结构非常奇特，而得名“异形玉叶金花”。异形玉叶金花还具有独特的药用价值，其清热解毒、消炎镇痛作用明显，经济和科研价值潜力巨大。该种四季常绿，姿态优雅，花型美观，装饰性强，非常适宜于园林造景、花坛点缀、庭院美化和家庭盆植，是深受人们喜爱的观赏植物。
异形玉叶金花已被列为国家Ⅰ级重点保护植物，濒危物种，对环境条件较为苛刻，种子自然更新能力较差，且易受虫害，野生种群数量极其稀少。经查阅资料确认，异形玉叶金花在贵州分布区的植株总数不超过60株。因其野生种群数量极其稀少，已濒临灭绝，目前鲜有异形玉叶金花相关的研究报道，仅有的研究报道主要集中于局部地区野生种群调查、分布区域统计和生境描述。研究结论也颇为相似，即野生异形玉叶金花生存状况堪忧，保护形势极为严峻，甚至有人在调查之后推断异形玉叶金花在局部地区已经灭绝。因此，开展珍稀濒危植物异形玉叶金花组织培养快繁技术研究对保护生物多样性，缓解物种灭绝速率，维持生态系统健康和平衡意义重大。
虽然已经公开了很多异形玉叶金花组培的方法，但利用这些方法进行组织培养的过程中往往分化率和成活率均较低，而如何有效快速的提高异形玉叶金花组培的诱导分化率及成活率，进而提高异形玉叶金花的繁殖数量，解决其面临灭绝的困境并达到大量生产应用的目的成为本领域技术人员亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种异形玉叶金花组培快繁培养基及培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过提高异形玉叶金花组织培养的繁殖数量及成活率，实现异形玉叶金花的大量种植，解决其濒临灭绝的问题并提高其经济和科研价值。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明的技术方案之一：一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，包括诱导培养基、继代培养基、增殖培养基、生根培养基；其中，
所述诱导培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤0.05mg/L～0.15mg/L+萘乙酸0.01mg/L～0.1mg/L，pH值5.6～5.8；
所述继代培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤3mg/L～5mg/L+激动素0.15mg/L～0.35mg/L+萘乙酸0.01mg/L～0.03mg/L，pH值5.6～5.8；
所述增殖培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤3mg/L～5mg/L+激动素0.15mg/L～0.35mg/L+吲哚乙酸0.01mg/L～0.03mg/L，pH值5.6～5.8；
所述生根培养基包括：1/2MS+吲哚丁酸0.1mg/L～0.2mg/L+活性炭0.5g/L～1.5g/L，pH值5.6～5.8。
进一步地，所述诱导培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.05mg/L，pH值5.7。
进一步地，所述继代培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L+萘乙酸0.02mg/L，pH值5.7。
进一步地，所述增殖培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L+吲哚乙酸0.02mg/L，pH值5.7。
进一步地，所述生根培养基包括：1/2MS+吲哚丁酸0.15mg/L+活性炭1g/L，pH值5.7。
进一步地，所述诱导培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.05mg/L，pH值5.7；所述继代培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L+萘乙酸0.02mg/L，pH值5.7；所述增殖培养基包括：MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L+吲哚乙酸0.02mg/L，pH值5.7；所述生根培养基包括：1/2MS+吲哚丁酸0.15mg/L+活性炭1g/L，pH值5.7。
本发明的技术方案之二：一种异形玉叶金花组培快繁培养方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述的异形玉叶金花组培快繁培养基进行培养，具体包括以下步骤：以异形玉叶金花的茎为外植体，在诱导培养基中诱导培养产生愈伤组织，所述愈伤组织在所述继代培养基中继代培养产生不定芽，所述不定芽在所述增殖培养基中增殖培养产生丛生芽，所述丛生芽在所述生根培养基中生根培养形成异形玉叶金花幼苗。
进一步地，所述的外植体在诱导培养前进行前处理，具体包括以下步骤：流水冲洗4h，紫外杀菌30min，75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，0.01％升汞浸泡10min，无菌水清洗，切成2～4mm的茎段。
进一步地，所述诱导培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，培养时间15d；所述的继代培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，继代3～4次，培养时间50d。
进一步地，所述增殖培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，培养时间15d；所述生根培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，培养时间50d。
本发明公开了以下技术效果：
本发明先采用诱导培养基对异形玉叶金花组织进行培养，培养基中的6-苄氨基嘌呤可以有效的加快植物细胞延长及细胞分裂，萘乙酸可以促进细胞分裂与扩大，二者结合使细胞分裂加快，且细胞在6-苄氨基嘌呤的作用下加长的同时可以在萘乙酸的作用下扩大，避免了细胞分裂过程中过长或过大的现象，本发明的培养基组合有效的提高了愈伤组织的形成率，使得到的愈伤组织中的植物细胞具有较强的结构功能及生理功能。
本发明的继代培养基含有MS、6-苄氨基嘌呤、激动素、萘乙酸等成分，继代培养基在诱导培养基的基础上增加了6-苄氨基嘌呤的用量，降低了萘乙酸的用量并加入了激动素，在6-苄氨基嘌呤促进植物细胞快速分裂延长的同时，萘乙酸促进植物细胞扩大，而激动素可以促进细胞生长，并可以诱导愈伤组织长芽，在植物细胞不断分裂的同时，促进芽的萌发，本发明的培养基组合有效的提高了愈伤组织不定芽的诱导率和芽的数量。
本发明的增殖培养基中含有6-苄氨基嘌呤、激动素、吲哚乙酸，与继代培养基相比，将其中具有促进愈伤组织长芽的萘乙酸换成了吲哚乙酸。在继代培养基中培养后，愈伤组织形成了一定的芽，而低浓度的吲哚乙酸进一步促进愈伤组织芽的生长，促进异形玉叶金花生长出更多的丛生芽，有效的提高了异形玉叶金花愈伤组织芽、不定芽的丛生芽数量，从而有效的提高了异形玉叶金花愈伤组织芽的数量，从而提高幼苗的培育数量。
本发明的生根培养基含有吲哚丁酸、活性炭，吲哚丁酸能促进细胞分裂与细胞生长，诱导愈伤组织形成不定根。同时本发明在生根培养基还加入了活性炭，有效的促进了不定根的形成率，不定根的长度，达到了使愈伤组织形成大量不定根的目的，并克服了组织培养过程中加入活性炭对培养材料产生的选择性吸附的副作用，为愈伤组织生根培养提供了更好的暗环境，吸附了培养过程中产生的对愈伤组织具有抑制性作用的物质，达到了使愈伤组织快速生根的目的，同时有效地避免了愈伤组织褐化的现象。
通过本发明的诱导培养基有效的提高了愈伤组织的形成率，并结合继代培养基和增殖培养基的使用，有效的提高了愈伤组织的出芽数量，进一步通过生根培养基的使用，使愈伤组织可以快速生根，所生根系粗壮且较多较长，通过以上培养基的组合对异形玉叶金花进行组织培养，有效的提高了异形玉叶金花的组织培养数量，并有效的提高了异形玉叶金花幼苗移栽成活率，达到了大量繁殖异形玉叶金花的目的。
通过本发明的培养方法及培养基的配制有效地提高了异形玉叶金花的繁殖率及成活率，有效地解决了异形玉叶金花濒临灭绝的问题，同时通过大量繁殖可以达到将其应用到医药领域的目的，可以为科学研究提供更好的基础，也可以有效的提高经济价值。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)培养基配制：
诱导培养基：在每1升MS培养基中加入0.05mg 6-苄氨基嘌呤和0.01mg萘乙酸，调节pH值为5.7。
继代培养基：在每1升MS培养基中加入3mg 6-苄氨基嘌呤、0.15mg激动素和0.01mg萘乙酸，调节pH值为5.7。
增殖培养基：在每1升MS培养基中加入3mg 6-苄氨基嘌呤、0.15mg激动素和0.01mg吲哚乙酸，调节pH值为5.7。
生根培养基：在每1升1/2MS培养基中加入0.1mg吲哚丁酸、0.5g活性炭，调节pH值为5.7。
(2)外植体的消毒：采集异形玉叶金花的嫩茎作为外植体，用流水冲洗4h后，放入超净工作台紫外杀菌30min，再用75％乙醇浸泡茎段30s后，无菌水冲洗1次，最后用0.01％升汞浸泡10min，在此期间，不断摇动容器，处理完后用无菌水清洗5次，切成2mm的茎段备用。
(3)愈伤组织诱导培养：将切好的茎段接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h，培养15d，可得异形玉叶金花愈伤组织。
(4)继代培养：将步骤(3)中的异形玉叶金花愈伤转接入继代培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，异形玉叶金花愈伤组织在不断膨大，继代4次，培养50d后，可得异形玉叶金花不定芽。
(5)增殖培养：将步骤(4)中的异形玉叶金花不定芽分割成独立芽转接入增殖培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，培养15d，可得大量的异形玉叶金花丛生芽。
(6)生根培养：待步骤(5)中的异形玉叶金花丛生芽长至高2～3cm时分割成单株转接入生根培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，培养50d，培育出异形玉叶金花幼苗。
实施例2
(1)培养基配置：
诱导培养基：在每1升MS培养基中加入0.1mg 6-苄氨基嘌呤和0.05mg萘乙酸，调节pH值为5.7。
继代培养基：在每1升MS培养基中加入4mg 6-苄氨基嘌呤、0.25mg激动素和0.02mg萘乙酸，调节pH值为5.7。
增殖培养基：在每1升MS培养基中加入4mg 6-苄氨基嘌呤、0.25mg激动素和0.02mg吲哚乙酸，调节pH值为5.7。
生根培养基：在每1升1/2MS培养基中加入0.15mg吲哚丁酸、1g活性炭，调节pH值为5.7。
(2)外植体的消毒：采集异形玉叶金花的嫩茎作为外植体，用流水冲洗4h后，放入超净工作台紫外杀菌30min，再用75％乙醇浸泡茎段30s后，无菌水冲洗1次，最后用0.01％升汞浸泡10min，在此期间，不断摇动容器，处理完后用无菌水清洗5次，切成2mm的茎段备用。
(3)愈伤组织诱导培养：将切好的茎段接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h，培养15d，可得异形玉叶金花愈伤组织。
(4)继代培养：将步骤(3)中的异形玉叶金花愈伤转接入继代培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，异形玉叶金花愈伤组织在不断膨大，继代4次，培养50d后，可得异形玉叶金花不定芽。
(5)增殖培养：将步骤(4)中的异形玉叶金花不定芽分割成独立芽转接入增殖培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，培养15d，可得大量的异形玉叶金花丛生芽。
(6)生根培养：待步骤(5)中的异形玉叶金花丛生芽长至高2～3cm时分割成单株转接入生根培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，培养50d，培育出异形玉叶金花幼苗。
实施例3
(1)培养基配置：
诱导培养基：在每1升MS培养基中加入0.15mg 6-苄氨基嘌呤和0.1mg萘乙酸，调节pH值为5.7。
继代培养基：在每1升MS培养基中加入5mg 6-苄氨基嘌呤、0.35mg激动素和0.03mg萘乙酸，调节pH值为5.7。
增殖培养基：在每1升MS培养基中加入5mg 6-苄氨基嘌呤、0.35mg激动素和0.03mg吲哚乙酸，调节pH值为5.7。
生根培养基：在每1升1/2MS培养基中加入0.2mg吲哚丁酸、1.5g活性炭，调节pH值为5.7。
(2)外植体的消毒：采集异形玉叶金花的嫩茎作为外植体，用流水冲洗4h后，放入超净工作台紫外杀菌30min，再用75％乙醇浸泡茎段30s后，无菌水冲洗1次，最后用0.01％升汞浸泡10min，在此期间，不断摇动容器，处理完后用无菌水清洗5次，切成2mm的茎段备用。
(3)愈伤组织诱导培养：将切好的茎段接种在诱导培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h，培养15d，可得异形玉叶金花愈伤组织。
(4)继代培养：将步骤(3)中的异形玉叶金花愈伤转接入继代培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，异形玉叶金花愈伤组织在不断膨大，继代4次，培养50d后，可得异形玉叶金花不定芽。
(5)增殖培养：将步骤(4)中的异形玉叶金花不定芽分割成独立芽转接入增殖培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，培养15d，可得大量的异形玉叶金花丛生芽。
(6)生根培养：待步骤(5)中的异形玉叶金花丛生芽长至高2～3cm时分割成单株转接入生根培养基内，在温度为25±1℃，光照强度为1500Lx，每天光照12h的条件下，培养50d，培育出异形玉叶金花幼苗。
实施例4
同实施例2，区别在于，省略增殖培养基以及步骤(5)的增殖培养过程。
实施例5
同实施例2，生根培养基的不含有活性炭。
对比例1
同实施例2，区别在于步骤(1)中的诱导培养基为：在每1升MS培养基中加入0.2mg6-苄氨基嘌呤和1.5mg 2，4-D，调节pH值为5.7。
统计实施例1～5和对比例1中异形玉叶金花的愈伤组织形成率、不定芽诱导率、丛生芽诱导率及不定根诱导率结果见表1。
表1异形玉叶金花的组织培养效果
效果例1
将实施例1～5和对比例1的异形玉叶金花幼苗移栽至基质土中培养，测定存活率，结果见表2。
表2异形玉叶金花幼苗移栽后的成活率
| 实施例 | 幼苗成活率(％) |
| 实施例1 | 62 |
| 实施例2 | 93 |
| 实施例3 | 70 |
| 实施例4 | 0 |
| 实施例5 | 83 |
| 对比例1 | 0 |
实验数据表明，当异形玉叶金花诱导培养基为在每1升MS培养基中加入0.1mg 6-苄氨基嘌呤和0.05mg萘乙酸，pH值为5.7；继代培养基为在每1升MS培养基中加入4mg 6-苄氨基嘌呤、0.25mg激动素和0.02mg萘乙酸，pH值为5.7；增殖培养基为在每1升MS培养基中加入4mg 6-苄氨基嘌呤、0.25mg激动素和0.02mg吲哚乙酸，pH值为5.7；生根培养基为在每1升1/2MS培养基中加入0.15mg吲哚丁酸、1g活性炭，pH值为5.7时，异形玉叶金花幼苗移栽的存活率最高。
本发明提供的异形玉叶金花组培快繁方法，采用异形玉叶金花嫩茎作为外植体，外植体通过消毒后经愈伤诱导培养、继代培养、增殖培养和生根培养产生了大量独立完整的植株。本发明提供的培养基配方可使异形玉叶金花诱导分化，产生大量的植株，解决异形玉叶金花正面临濒危的困境。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，包括诱导培养基、继代培养基、增殖培养基、生根培养基；其中，
所述诱导培养基由MS+6-苄氨基嘌呤0.05mg/L~0.15mg/L+萘乙酸0.01mg/L~0.1mg/L组成，pH值5.6~5.8；
所述继代培养基由MS+6-苄氨基嘌呤3mg/L~5mg/L+激动素0.15mg/L~0.35mg/L+萘乙酸0.01mg/L~0.03mg/L组成，pH值5.6~5.8；
所述增殖培养基由MS+6-苄氨基嘌呤3mg/L~5mg/L+激动素0.15mg/L~0.35mg/L+吲哚乙酸0.01mg/L~0.03mg/L组成，pH值5.6~5.8；
所述生根培养基由1/2MS+吲哚丁酸0.1mg/L~0.2mg/L+活性炭0.5g/L~1.5g/L组成，pH值5.6~5.8。
2.根据权利要求1所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，所述诱导培养基由MS+6-苄氨基嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.05mg/L组成，pH值5.7。
3.根据权利要求1所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，所述继代培养基由MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L +萘乙酸0.02mg/L组成，pH值5.7。
4.根据权利要求1所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，所述增殖培养基由MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L +吲哚乙酸0.02mg/L组成，pH值5.7。
5.根据权利要求1所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，所述生根培养基由1/2MS+吲哚丁酸0.15mg/L+活性炭1g/L组成，pH值5.7。
6.根据权利要求1所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养基，其特征在于，所述诱导培养基由MS+6-苄氨基嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.05mg/L组成，pH值5.7；所述继代培养基由MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L+萘乙酸0.02mg/L组成，pH值5.7；所述增殖培养基由MS+6-苄氨基嘌呤4mg/L+激动素0.25mg/L+吲哚乙酸0.02mg/L组成，pH值5.7；所述生根培养基由1/2MS+吲哚丁酸0.15mg/L+活性炭1g/L组成，pH值5.7。
7.一种异形玉叶金花组培快繁培养方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述的异形玉叶金花组培快繁培养基进行培养，具体包括以下步骤：以异形玉叶金花的茎为外植体，在诱导培养基中诱导培养产生愈伤组织，所述愈伤组织在所述继代培养基中继代培养产生不定芽，所述不定芽在所述增殖培养基中增殖培养产生丛生芽，所述丛生芽在所述生根培养基中生根培养形成异形玉叶金花幼苗。
8.根据权利要求7所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养方法，其特征在于，所述的外植体在诱导培养前进行前处理，具体包括以下步骤：流水冲洗4h，紫外杀菌30min，75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，0.01%升汞浸泡10min，无菌水清洗，切成2～4mm的茎段。
9.根据权利要求7所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养方法，其特征在于，所述诱导培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，培养时间15d；所述的继代培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，继代3~4次，培养时间50d。
10.根据权利要求7所述的一种异形玉叶金花组培快繁培养方法，其特征在于，所述增殖培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，培养时间15d；所述生根培养条件包括：温度25±1℃，光照强度1500Lx，光照时间12h/天，培养时间50d。
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| CN202110534937.7A CN113068618B (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种异形玉叶金花组培快繁培养基及培养方法 |
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