KR20140024766A - 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법 - Google Patents

상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법에 관한 것으로, 그 구성은, 상록성 진달래 식물체로부터 세포, 조직 또는 기관 중 하나를 채취하고, 상기 세포, 조직 또는 기간을, 비타민을 제거하고 생장조절제를 투입한 앤더슨(Anderson's) 배지에 치상하여 상기 식물체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 식물체 재분화가 촉진되어 완전한 식물체로 배양되는 것을 특징으로 한다.

Description

상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법{A Method for Mass Propagation of Rhododendron Keiskei var. hypoglaucum by Plant Tissue Culture}
본 발명은 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배양배지를 개량하여 상록성 진달래를 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
상록성 진달래(Rhododendron Keiskei var. hypoglaucum)는 한국의 서남해안 도서지역에 자생하는 멸종 위기에 처한 상록수로서 분화용 및 정원과 조경용으로 각광을 받을 만한 희귀식물이다. 잎의 길이는 8~20 cm, 너비는 2~5 cm의 크기로 가장자리는 밋밋하며 뒤로 말린다. 꽃은 6~7월에 피고 10~20개씩 가지 끝에 총상꽃차례로 달린다. 화관은 깔때기 모양으로 흰색 또는 연한 노란색이고 안쪽 윗면에 녹색 반점이 있으며 5갈래로 갈라진다.
고부가가치의 다양한 종류의 희귀종을 보존하고, 관상가치가 높은 새로운 종을 대량으로 증식하기 위하여 삽목이나 직파 번식법을 도입하고자 노력하였으나 목본성인 상록수 진달래의 경우 일반적으로 생장속도가 매우 느리며 개화소요 기간이 2~3년 정도 필요한 특징이 있기 때문에 기존의 방법으로는 번식이 매우 어려운 토속식물이다.
또한 약용식물과 관상식물로서 두 가지의 가치가 모두 높은 상록수 진달래의 미세번식에 대한 선행연구는 거의 없는 실정이다.
그러나 상록성 진달래는 알려진 효능에 비해 각 품종별 특성과 차이점 및 함유 성분에 따른 다양한 기능성을 완전히 활용하지 못한 채 방치되고 있는 유용식물이다. 더욱이 분포지가 협소하여 채집과 대량 채취가 힘들다는 문제점이 있다. 따라서, 계절적, 지리적 영향을 벗어나 새로운 기술을 통한 대량생산이 요구되고 있다.
식물은 많은 수의 세포들이 모여서 조직을 구성하고, 여러 조직들이 모여서 기관을 형성하며, 형태와 기능이 각기 다른 여러 기관들이 모여서 유기적으로 통제된 식물체를 형성하는데, 식물의 조직배양은 이러한 식물체로부터 기관, 조직 및 세포를 적출 분리하여 기내에서 영양분이 함유되어 있는 배지에 무균적으로 배양함으로써 캘러스(callus)나 단세포의 집단을 유도하거나 완전한 기능을 가진 식물체로 재생시키는 기술을 말하며, 일명 식물의 ' 기내배양 ' 이라고 불리기도 한다.
조직배양에 사용되는 재료로는 식물의 잎, 줄기, 뿔리, 엽병, 화경, 자엽 및 인편 등의 각종 기관이나 조직, 종자의 일부분인 배와 배유, 소포자 및 원형질체 등이 있으며, 식물의 배양형태는 식물재료의 분화정도에 따라 일반적으로 다음과 같이 크게 세 가지로 구분할 수 있다. 즉, 첫째로는 배나 종자 등과 같이 특별한 유기적 구조를 가진 기관화된 식물재료를 배양하는 경우가 있고, 둘째로는 캘러스처럼 탈분화되어 비기관화된 재료를 배양하는 경우가 있으며, 셋째로는 이들의 중간적인 형태로 분리된 기관이나 조직을 배양하게 되면 세포가 탈분회되어 캘러스를 형성하고, 형성된 캘러스는 재분화하여 뿌리나 줄기와 같은 기관 또는 완전한 개체로 발달하는 경우가 있다.
이와 같이 식물의 조직배양은 배양조건에 따라 식물체로부터 적출한 조직이나 세포로부터 캘러스하고 하는 부정형의 세포괴를 만들게 할 수도 있고 새로운 기관이나 식물체를 재생시킬 수도 있다.
나아가 오늘날 식물의 조직배양 기술은 식물의 생리 생화학적 조절기구 및 유전자 발현 기작을 밝히고, 생물 공학적 기법을 이용한 유용물질의 대량생산을 위한 좋은 도구가 되고 있으며, 관목류나 임목 및 화훼류의 경우, 조직배양을 이용한 대량번식을 통해 분주나 삽목으로 얻기 힘든 무병의 동일한 식물체를 생산하기도 한다.
그러나, 앞서 기술한 바와 같이 각종 유용한 생리활성 물질을 가지고 있는 상록성 진달래를 대량생산하기 위한 방법으로 아직까지 조직배양 기술을 이용한 예가 없었다.
따라서, 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 상록성 진달래를 대량생산하기 위해 식물의 조직에서 바로 기관 형성을 유도하고 재분화 시간을 단축할 수 있는 조직배양 기술을 통한 상록성 진달래의 대량생산 방법을 제공하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명인 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법의 구성은, 상록성진달래 식물체로부터 세포, 조직 또는 기관 중 하나를 채취하고, 상기 세포, 조직 또는 기간을, 비타민을 제거하고 생장조절제를 투입한 앤더슨(Anderson's) 배지에 치상하여 상기 식물체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 식물체 재분화가 촉진되어 완전한 식물체로 배양되는 것을 특징으로 한다.
상기 생장조절제는, 1.5 내지 2.5mg/L 2-iP, 0.1 내지 1.0mg/L IAA, 0.5 내지 1.5mg/L GA3를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
그리고, 본 발명인 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법의 다른 실시예는, 멸균처리한 상록성 진달래 식물으로부터 절편을 분리하는 제 1단계와, 상기 분리된 절편을 비타민은 제거되고 수크로스(sucrose)와 아가(agar)가 포함되어 있는 앤더슨 배지에서 배양하는 제 2단계와, 상기 배양된 신초를 비타민은 제거되고, 1.5 내지 2.5mg/L 2-iP, 0.1 내지 1.0mg/L IAA, 0.5 내지 1.5mg/L GA3를 포함하여 구성되는 앤더슨 배지에 계대 배양하는 제 3단계와, 상기 제 3단계에서 신초가 2 내지 3cm 가 되면, 0.5 내지 4.0mg/L의 IBA가 포함되는 앤더슨 배지에 발근을 유도하는 제 4단계와, 상기 발근된 신초를 토양에서 순화시키는 제 5단계를 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명인 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법에서는 다음과 같은 효과가 있다.
비타민을 제거한 앤더슨 배지에 영양성분을 첨가하고 백색광을 조사하여 상록성 진달래를 재분화시켜 본 발명에 의한 상록성 진달래를 대량으로 증식시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 의한 상록성 진달래의 조직배양에 따른 2주간 마디배양 시 오염이 발생한 모습을 보인 도면
도 2는 본 발명에 의한 상록성 진달래의 조직배양에 따른 4주간 2-iP가 첨가된 Anderson's 배지에서 마디 절편체 배양된 모습을 보인 도면
도 3은 본 발명에 의한 상록성 진달래의 조직배양에 따른 2.0 mg/L 2-iP, 0.5 mg/L IAA, 1.0 mg/L GA3가 첨가된 Anderson's 배지에서 신초 재분화의 모습을 보인 도면
도 4는 도 3의 조직배양의 6주 경과후 모습을 보인 도면
도 5는 도 3의 조직배양의 발근 모습을 보인 도면
도 6은 도 3의 조직배양의 순화 모습을 보인 도면
이하 본 발명에 의한 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법을 상세하게 설명한다.
본 발명에 의한 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법은, 상록성진달래 식물체에서 채취된 절편체를 생장조절제를 투입한 앤더슨(Anderson's) 배지에 치상하여 유도할 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 상록성진달래 식물체로부터 세포, 조직 또는 기관 중 하나를 채취하고, 상기 세포, 조직 또는 기간을, 생장조절제를 투입한 앤더슨(Anderson's) 배지에 치상하여 상기 식물체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 식물체 재분화가 촉진되어 완전한 식물체로 배양된다.
본 발명에 사용되는 배지는 여러가지 배지가 사용될 수 있으며, 예를 들면 앤더슨 배지가 사용될 수 있다. 상기 앤더슨 배지는 진달래과 식물의 조직배양에 일반적으로 이용되는 배지이다.
상기 배지에는, 상기 생장조절제로 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 0.5 내지 4.0mg/L 더 포함될 수 있다.
또한, 상기 배지에는, 생장조절제로, 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 0.5 내지 4.0mg/L 외에 0.1 내지 0.5mg/L 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA)와 0.5mg/L 지베레릭 애시드(gibberellic acid, GA3)이 더 포함되어 구성될 수 있다.
그리고, 상기 배지에는 비타민을 제거한 것을 적용할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 조직배양에 의한 상록성 진달래의 대량 증식방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.
제 1단계; 살균단계
상록성 진달래의 신초를 채취한 절편체를 살균처리 한 후, 식물의 고체배지에 파종하여 발아시킨 다음, 발아된 유식물체로부터 세포, 조직 또는 기관 중 하나를 채취한다.
그리고, 상기 채취된 절편을 30분동안 증류수에 세척한다. 상기 절편을 70% 에탄올 용액에 60초 동안 세척하고, 5% 차아염소산나트륨에 15분 동안 세척한다. 그리고, 이를 증류수에 4번 정도 세척한다.
제 2단계; 배양단계
상기 절편을 배지에 치상한다. 상기 배지는 다음과 같은 조건으로 제조될 수 있다. 상기 배지는 0.1N 수산화나트륨(NaOH) 또는 0.1N 염산(HCl)을 사용하여 pH를 5.0으로 조절한다. 그리고, 상기 배지는 오토클레이브에서 121℃에서 15분 동안 멸균한다. 상기 배지는 앤더슨 배지(Anderson's mediun)에 3%(w/v) 수크로스(sucrose)와, 0.8%(w/v) 아가(agar)를 포함할 수 있다. 상기 배지에는 일반적인 배지와 달리 비타민을 임의로 제거한 것을 적용할 수 있다.
상기 절편체가 치상된 상기 배지는 24 내지 26℃에서 16시간의 광주기로 백색광을 조사하여 배양한다.
제 3단계: 계대 배양단계
그리고, 상기 배지에서 발아를 유도하여 생장시킨 신초들은 다음과 같은 배지를 이용하여 계대 배양을 할 수 있다.
상기 계대 배양을 위한 배지는 상술한 배지와 마찬가지로 앤더슨 배지에 다음과 같은 생장조절제가 더 포함될 수 있다. 상기 생장조절제로 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 0.5 내지 4.0mg/L 더 포함될 수 있다.
또는 상기 배지에는 생장조절제로, 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 0.5 내지 4.0mg/L 외에 0.1 내지 0.5mg/L 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA)와 0.5mg/L 지베레릭 애시드(gibberellic acid, GA3)이 더 포함되어 구성될 수 있다.
물론, 상기 배지에서도 앤더슨 배이에 비타민을 제거한 것을 적용한다.
표 1에서는 상기 생장조절제가 신초증식에 영향을 주는 것을 확인한 것으로, 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0mg/L 로 변화될 때, 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 단독으로 존재할 때와, 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA)가 0.1, 0.5 mg/L로 변화될 때의 상관관계와, 지베레릭 애시드(gibberellic acid, GA3)가 0.5mg/L 이 더 포함될 때의 변화를 나타낸 것이다.
농도(mg/L) 신초유도(%)
 신초의 수
2-iP IAA GA3
0 0 0 0 0
0.5 0 0 43.6h 1.6e
1.0 0 0 49.4g 2.0e
2.0 0 0 63.0e 3.6d
4.0 0 0 57.0f 3.4d
1.0 0.1 0 76.4d 6.7c
2.0 0.1 0 83.0c 9.8b
1.0 0.5 0 87.4b 8.6b
2.0 0.5 0 92.4b 12.3a
2.0 0.5 1.0 92.4b 16.0a
( 생장조절제의 농도 변화가 신초유도에 주는 영향 )
표 1에 나타난 바와 같이, 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 단독으로 존재할 때, 0.5mg/L 이상이면 신초유도에 영향을 주는 것을 알 수 있으며, 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP)이 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA)와 함께 존재할 때는 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA)이 0.1 내지 0.5mg/L 일 때 더욱 영향을 주는 것을 알 수 있다.
그리고, 지베레릭 애시드(gibberellic acid, GA3)는 1.0mg/L일 때 신초의 수에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
제 4단계: 발근 및 증식단계
상기 채취편이 신초로 유도되고 2 내지 3cm 정도 신장되면, 0.5 내지 4.0mg/L의 인돌뷰트릭애시드(IdoleButyric Acid, IBA)가 포함되어 있는 1배 또는 1/2배 앤더슨 배지로 옮겨 심고 발근을 유도한다.
표 2에서는 인돌뷰트릭애시드(IdoleButyric Acid, IBA)가 발근에 영향을 주는 것을 확인 하기 위한 것으로, 인돌뷰트릭애시드(IdoleButyric Acid, IBA)가 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0mg/L로 변화할 때의 발근유도율과 신초당 발근의 수의 변화를 나타낸 것이다.
IBA(mg/L) 발근유도 신초 당 발근의 수
0 63.8b 2.3c
0.5 100a 7.6a
1.0 100a 5.0b
2.0 100a 칼러스와 뿌리
4.0 100a 칼러스와 뿌리
( IBA 농도 변화가 발근유도에 주는 영향 )
표 2를 통하여 0.5 내지 4.0mg/L의 인돌뷰트릭애시드(IdoleButyric Acid, IBA)가 포함되어 있는 배지에서 발근유도에 영향이 큰 것을 확인할 수 있다.
제 5단계: 순화단계
그리고, 발근이 이루어지면, 증류수로 세척 후 분에 옮겨 심고, 격일로 1/4배의 MS 배지에 관개되도록 한다.
본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

Claims (3)

  1. 상록성 진달래 식물체로부터 세포, 조직 또는 기관 중 하나를 채취하고, 상기 세포, 조직 또는 기간을, 비타민을 제거하고 생장조절제를 투입한 앤더슨(Anderson's) 배지에 치상하여 상기 식물체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 식물체 재분화가 촉진되어 완전한 식물체로 배양되는 것을 특징으로 하는 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 생장조절제는,
    1.5 내지 2.5mg/L 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP), 0.1 내지 1.0mg/L 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA), 0.5 내지 1.5mg/L 지베레릭 애시드(gibberellic acid, GA3)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법.
  3. 멸균처리한 상록성 진달래 식물으로부터 절편을 분리하는 제 1단계;
    상기 분리된 절편을 비타민은 제거되고 수크로스(sucrose)와 아가(agar)가 포함되어 있는 앤더슨 배지에서 배양하는 제 2단계;
    상기 배양된 신초를 비타민은 제거되고, 1.5 내지 2.5mg/L 2-이소펜틸 아데닌(2-isopentyl adnine, 2-iP), 0.1 내지 1.0mg/L 인돌-3-아세틱 애시드(indole-3-acetic acid, IAA), 0.5 내지 1.5mg/L 지베레릭 애시드(gibberellic acid, GA3)를 포함하여 구성되는 앤더슨 배지에 계대 배양하는 제 3단계;
    상기 제 3단계에서 신초가 2 내지 3cm 가 되면, 0.5 내지 4.0mg/L의 인돌뷰트릭애시드(IdoleButyric Acid, IBA)가 포함되는 앤더슨 배지에 발근을 유도하는 제 4단계;
    상기 발근된 신초를 토양에서 순화시키는 제 5단계를 포함하여 구성되는 상록성 진달래의 조직배양에 의한 대량 증식방법.

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