CN109122314B

CN109122314B - 一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒及方法

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Publication number: CN109122314B
Application number: CN201810893060.9A
Authority: CN
Inventors: 梁韩枝; 马国华; 曾宋君; 吴坤林; 郑枫; 张新华; 熊玉萍; 任海; 简曙光; 张城; 杨松
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2018-08-07
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2038-08-07
Also published as: CN109122314A

Abstract

本发明公开了一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒及方法。本发明的草海桐离体快速繁殖的培养基套盒，包括草海桐丛生芽诱导培养基、体细胞胚和不定芽诱导培养基、体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基、草海桐生根诱导培养基和用作草海桐组培苗移栽基质的河沙；并且还建立了利用该套盒的高效的草海桐组培苗快繁技术体系。为保护、开发和利用草海桐资源提供基础并填补草海桐在组织培养快繁技术方面的空白。

Description

一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒及方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒及方法。

背景技术

草海桐(Scaevola taccada)为草海桐科(Goodeniaceae)草海桐属(Scaevola)直立或铺散灌木的半红树植物。全科有11个属，400个种，几乎全部起源以及现存物种大都集中在澳大利亚，仅草海桐属广布于全世界。草海桐属有130个种，分布在澳大利亚以外的仅有40个种，大多零散地分布在热带海岛地区。我国南部沿海有2个种，分别是草海桐和海南草海桐(Scaevola hainanensis Hance)，主要分布于台湾、福建、广东、广西和海南等地开阔的海边沙地或海岸的峭壁上。草海桐作为热带以及亚热带海岸灌木群落的优势种，可在不同盐浓度的环境中通过调整自身在时间以及空间上的生理学的反应以保持较强二氧化碳平衡，从而表现出显著的耐盐碱性，被广泛种植于沿海滩涂中作为防护林的重要组成部分起到防风固沙的作用。草海桐的花色艳丽，花期较长，枝型优美，具有较高的园艺观赏价值，草海桐等草海桐属植物在澳大利亚等国家已经成为主要的观赏性园艺植物。在美国以及欧洲，草海桐属植物常常被用来编制成手提花篮，或者种植于阳台窗沿以及花园中作为观赏绿植。草海桐还具有较高的药用价值。草海桐叶片可以助消化、祛风、抗肿瘤、抗炎症，果实可以用于避孕，根可以治疗腹泻；其叶片和树皮煮出的汁可以治疗刀伤，动物咬伤，白内障，鳞状皮肤，癣、胃病、改善眼部红肿疼痛等功能。

目前，草海桐的主要繁殖方式是种子繁殖与扦插繁殖，未见有通过植物组织培养手段进行来实现其繁殖的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒及方法。本发明以草海桐嫩茎段为试验材料，通过研究不同浓度、种类的植物生长调节剂及其组合对草海桐茎段无菌体系的建立及其丛生芽诱导的影响、草海桐叶片诱导体细胞胚胎发生与不定芽的诱导、体细胞胚与不定芽的增殖及其伸长以及不定芽生根的影响，建立了高效的草海桐组培苗快繁技术体系。为保护、开发和利用草海桐资源提供基础并填补草海桐在组织培养快繁技术方面的空白。

为实现上述目的，本发明提供了一种草海桐丛生芽诱导培养基，其为MS培养基添加1.0～2.0mg/L BA、0.1～0.3mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

优选，所述的草海桐丛生芽诱导培养基，其为MS培养基添加2.0mg/L BA、0.1mg/LNAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

本发明还提供了一种草海桐体细胞胚和不定芽诱导培养基，其为MS培养基添加1.5～3.0mg/L BA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

优选，所述的草海桐体细胞胚和不定芽诱导培养基，其为MS培养基添加3.0mg/LBA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

本发明还提供了一种草海桐体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基，其为MS培养基添加0.75mg/L BA、0.25mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；或为MS培养基添加1.0mg/L BA、0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

本发明还提供了一种草海桐生根诱导培养基，其为1/2MS培养基添加2.5～3.5mg/L IBA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；或为1/2MS培养基添加1.0mg/LIBA、1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

为实现上述目的，本发明还提供一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒，包括：所述的草海桐丛生芽诱导培养基、体细胞胚和不定芽诱导培养基、体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基和草海桐生根诱导培养基。

优选，所述的草海桐离体快速繁殖的培养基套盒还包括用作草海桐组培苗移栽基质的河沙。

本发明所述的培养基套盒中，各培养基互相配合，各培养基中的植物生长素种类及含量很好地配合了草海桐植株的具体生长需要，显著提高了草海桐的繁殖倍率、生根率以及移栽成活率。

为实现上述目的，本发明还提供一种草海桐离体快速繁殖方法，其包括以下步骤：

(1)取草海桐健康枝条的茎段，剪去多余的叶片，取长1.5～3cm并带有2个侧芽的茎段为外植体；

(2)在无菌条件下，将外植体消毒后接种于所述的丛生芽诱导培养基上培养，获得无菌丛生芽；

(3)取无菌芽的叶接种于所述的体细胞胚和不定芽诱导培养基上培养，获得体细胞胚与不定芽；

(4)将体细胞胚与不定芽分别接种于所述的体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基上培养，获得体细胞胚再生芽和伸长的不定芽；

(5)将体细胞胚再生芽和伸长的不定芽接种于所述的生根诱导培养基上培养生根，获得草海桐组培苗；

(6)取出草海桐组培苗，将其根部的培养基清洗干净，移栽于所述的组培苗移栽基质上。

优选，所述的方法中，步骤(1)～(5)中的培养条件均为：25±1℃、光照时间12h光照/12h黑暗、光照强度1500～2000lx。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

1、用于无菌体系建立的丛生芽诱导培养基中，采用带腋芽的茎段为外植体，接种于丛生芽诱导培养基上，诱导了茎段腋芽的萌发与大量丛生芽的形成，从而建立了草海桐的无菌体系。

2、用于体细胞胚与不定芽诱导的体细胞胚和不定芽诱导培养基中，切取形成的无菌丛生芽体的嫩叶为外植体，以MS基本培养基，添加不同质量浓度的2,4-D、BA、TDZ以及0.25～0.75mg/L BA与0.1～0.75mg/L NAA配合使用，以体细胞胚或不定芽诱导率、平均体细胞胚数、平均不定芽数以及平均体细胞胚与不定芽总数为指标，筛选了适宜的体细胞胚与不定芽诱导配方，首次发现了草海桐叶片同时形成体细胞胚与不定芽的现象。以30d为培养周期，体细胞胚或不定芽诱导率、平均体细胞胚数、平均不定芽数以及平均体细胞胚与不定芽总数分别可达98.3％、33.4、8.8与48.1。所形成的体细胞胚与不定芽长势良好。

3、体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基中，切取发生体细胞胚与不定芽叶片为外植体，以MS为基本培养基，添加0.1～1.5mg/L NAA、0.1～1.5mg/L BA、0.1～1.5mg/L KT以及0.1～1.0mg/L BA与0.1～1.0mg/L NAA组合，以体细胞胚与不定芽增殖系数，平均株高为指标，筛选了草海桐体细胞胚与不定芽增殖及其伸长的适宜配方。以40d为培养周期，体细胞胚与不定芽增殖系数，平均株高最高分别可达3.4与5.0cm，所得芽体长势良好。

4、将所得的伸长且生长健壮的芽体为外植体，以1/2MS为基本培养基，接种于含有0.1～3.5mg/L IBA、NAA、IAA以及0.1～1.0mg/L IBA与0.2～1.0mg/L NAA组合的培养基内进行生根培养，以生根率与平均生根数为指标，以30d为培养周期，生根率与平均生根数分别可达99.0％与20.6。所得组培苗根细长密集，植株长势良好。

5、将所得的草海桐组培苗，经过炼苗处理后，移栽到不同的基质中。具体基质为：按照3/4黄泥+1/4泥炭土、100％河沙、1/2河沙+1/2珊瑚沙、3/6泥炭土+2/6蛭石+1/6珍珠岩、1/3泥炭土+1/3蛭石+1/3珍珠岩、100％珊瑚沙的比例进行混合。以15d与45d的移栽成活率，15d～45d的叶片积累量，株高增加量为指标，筛选最适合草海桐组培苗移栽的基质。最优的移栽基质为100％河沙，所获得的15d与45d的移栽成活率，15d～45d的叶片积累量，株高增加量分别为91.6％、82.7％、3.6片与3.6cm。

6、本发明首次发现了草海桐叶片既可以同时产生体细胞胚，亦可同时形成不定芽，并建立了草海桐体细胞胚与不定芽途径的组织培养快繁体系，高效地产生了具有基因一致性，可保持母株优良性状的组培苗，并解决了扦插繁殖以及种子繁殖的繁殖倍率低，受时间周期限制以及环境限制等问题，为草海桐的种质保存以及大规模的工厂化生产提供技术支撑。

附图说明

图1是草海桐丛生芽；

图2是草海桐叶片体细胞胚发生；

图3是叶片诱导不定芽；

图4是体细胞胚萌发形成的芽；

图5是体细胞胚萌发与不定芽伸长；

图6是生根的草海桐组培苗；

图7是组培苗移栽不同基质效果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

在本文中，英文缩略词的含义如下：

KT：激动素

ZT：玉米素

BA：6-苄基氨基嘌呤；

TDZ：噻苯隆；

NAA：萘乙酸；

2,4-D：2,4-苯氧乙酸

IBA：吲哚丁酸；

IAA：吲哚乙酸；

术语：

术语“离体”是指为了各种研究目的而把生物体的一部分摘出和游离于生物体外的状态。

术语“外植体”是指在继代培养时，移入新的培养基的培养的组织切段。

1/2MS培养基是指把MS培养基中的大量元素的量减少到原来的1/2所制备的培养基。

在本发明实施例中，MS培养基的成分如表1所示：

表1 MS培养基组分

如无特殊说明，本发明实施例中促进草海桐离体快速繁殖的方法中所涉及的培养基及基质分别按照下述方法进行制备：

(1)配制1L MS培养基：准确称取表1中所述的各种化合物，加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，用NaOH调pH至5.8～6.0，最后定容到1L。

(2)配制用于无菌体系建立与丛生芽诱导的培养基：在步骤(1)所制备的MS培养基的基础上还添加0～2.5mg/L BA、KT、ZT、TDZ、NAA、1.0～2.0mg/L BA+0.1～0.3mg/L NAA、1.0mg/L BA+0.1mg/L TDZ、1.0mg/L KT+0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

(3)配制用于不定芽诱导与体细胞胚发生的培养基：在步骤(1)所制备的MS培养基的基础上还添加有0.0～1.0mg/L 2,4-D、0.1～3.0mg/L BA、0.5～3.0mg/L TDZ、0.25～0.7mg/L BA+0.1～0.25mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

(4)配制用于体细胞胚与不定芽增殖及其伸长的培养基：在步骤(1)所制备的MS培养基的基础上还添加0.0～1.5mg/L BA、NAA、KT、0.1～1.0mg/L BA+0.1～1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

(5)配制用于生根诱导的培养基：在1/2MS培养基的基础上还添加有0.0～3.5mg/LNAA、IBA、IAA、1.0mg/L IBA+0.2～1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

(6)草海桐组培苗移栽基质：按照3/4黄泥+1/4泥炭土、100％河沙、1/2河沙+1/2珊瑚沙、3/6泥炭土+2/6蛭石+1/6珍珠岩、1/3泥炭土+1/3蛭石+1/3珍珠岩、100％珊瑚沙的比例进行混合。

如无特殊说明，以上所述的组织培养条件均为：25±1℃、光照时间12h光照/12h黑暗、光照强度1500～2000lx。

实施例1

一、草海桐无菌体系的建立及其丛生芽的诱导

试验设置仅1～26组，所述用于无菌体系建立的培养基1为：以MS培养基为基本培养基，还添加0～2.5mg/L BA、KT、ZT、TDZ或NAA、1.0～2.0mg/L BA+0.1～0.3mg/L NAA、1.0mg/L BA+0.1mg/L TDZ、1.0mg/L KT+0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

取草海桐带芽茎段进行草海桐无菌体系建立与丛生芽的诱导试验，具体步骤如下：

(1)外植体的选择：取草海桐健康枝条的茎段，剪去多余的叶片，取长1.5～3cm并带有2个侧芽的茎段为外植体

(2)表面消毒：在超净工作台上将外植体放入质量分数0.1％升汞浸泡消毒8min，无菌水漂洗7次，晾干表面水分。

(3)接种：在无菌滤纸上切除茎段两端后，接种于培养基1上，培养30d后观察不同培养基内植株的生长情况。

具体结果如下：

表2不同的植物生长调节剂及其组合对草海桐丛生芽诱导及其无菌繁殖体系建立的影响

由表2可知：不同种类的植物生长调节剂对草海桐诱导具有不同的影响。高浓度(1.0～2.0mg/L)的BA与TDZ或者NAA配合使用时，具有最高的芽增殖系数，显著高于其它处理组。在单独添加BA时，芽增殖系数随着BA的浓度上升而增加，当浓度大于1.0mg/L时差异不显著。KT与ZT对不定芽的增殖诱导效率仅次于BA，但与NAA的差异不显著。草海桐的芽增殖系数随着TDZ的浓度上升而降低。值得注意的是，在添加细胞分裂素的培养基上培养的草海桐丛生芽叶片呈现出一定的玻璃化现象，且随着细胞分裂素浓度的增加，这种玻璃化现象愈加严重。相反的，在添加NAA或者NAA与BA配合使用时，所获得的丛生芽叶片翠绿，舒展，长势良好，并在丛生芽的基部伴有部分生根的现象。因此，综合芽增殖系数与长势，较优的草海桐丛生芽诱导培养基为：MS培养基添加1.0～2.0mg/L BA、0.1～0.3mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。最佳的草海桐丛生芽诱导培养基为：MS培养基添加2.0mg/L BA、0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；利用该培养基诱导的草海桐丛生芽如图1所示。

二、不同种类、浓度的植物生长调节剂对草海桐叶片体细胞胚发生与不定芽诱导的影响

试验设置1～17组，均以MS为基本培养基。用于草海桐叶片上的体细胞胚和不定芽的诱导培养基2：以MS培养基为基础培养基，还添加有0.0～1.0mg/L 2,4-D、0.1～3.0mg/LBA、0.5～3.0mg/L TDZ、0.25～0.7mg/L BA+0.1～0.25mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；

具体步骤如下：

(1)取步骤一中的无菌丛生芽中嫩绿的叶片。

(2)将所取得的嫩叶，在无菌条件下用刀切成1cm²大小，然后分别将这些叶片接种于试验组1～17的培养基内，每个瓶接种6片叶片，每个试验组10瓶。

(3)培养30d后观察记录其生长情况以及统计体细胞胚或不定芽诱导率、平均每片叶片上的体细胞胚数、平均不定芽数以及平均体细胞胚与不定芽数总数。

(4)间隔15d后重复该试验两次。

细胞胚或不定芽诱导率＝(出现细胞胚或不定芽诱导的叶片总数/接种时的叶片总数)×100％；

平均体胚数＝体细胞胚的总数/出现体细胞胚的叶片总数；

平均不定芽数＝不定芽总数/出现不定芽的叶片总数；

平均体细胞胚与不定芽数总数＝平均体细胞胚数+平均不定芽数

采用上述方法进行草海桐的叶片诱导体细胞胚或不定芽，所得到的结果如表3：

表3不同的植物生长调节剂及其组合对草海桐叶片体细胞胚的发生与不定芽诱导的影响

由表3可知：草海桐叶片在不含任何植物生长调节剂的空白培养基(CK)上培养30d无体细胞胚或者不定芽的形成，且大部分叶片无明显变化，部分叶片逐渐褐化甚至死亡；在添加2，4-D的培养基上的培养30d后会形成大量黄色的愈伤组织，但无任何体细胞胚或者不定芽的形成。嫩叶在含有不同浓度BA、TDZ以及BA与NAA配合的培养基上培养10d左右，其叶片表面开始膨大。当培养时间延长至20d时可见其表面形成明显的小突起。在培养30d后统计发现，草海桐叶片在添加细胞分裂素的培养基上培养可同时诱导体细胞胚和不定芽。不同浓度及其种类的细胞分裂素对体细胞胚与不定芽的诱导效果具有显著差异。在相同种类的植物生长调节剂的条件下，浓度的不同也会引起体细胞胚与不定芽诱导平均数量的差异。在低浓度(小于0.5mg/L)BA条件下，在同一片叶片上所诱导形成的不定芽数量要多于体细胞胚的数量，即不定芽占优势.；在BA的浓度大于1.0mg/L或者在活性较强的细胞分裂素，如TDZ的条件下，所诱导体细胞胚数多于不定芽数，即体细胞胚占绝大优势。在添加有TDZ培养基上培养的叶片虽然也能诱导体细胞胚与不定芽，但是所诱导的体细胞胚与不定芽均呈较严重的愈伤化并呈现畸形的体细胞胚与不定芽。因此BA对不定芽和体细胞胚的诱导效果最好，在3.0mg/L BA时具有最高诱导率与平均突起数(不定芽数与体细胞胚数的总称，下同)，分别可达98.3％与48.1个。另外，当不同浓度的BA与不同浓度的NAA配合使用时，对体细胞胚或者不定芽诱导情况与单独添加相同浓度BA的处理组差异不显著。

较优的草海桐体细胞胚和不定芽诱导培养基为：MS培养基添加1.5～3.0mg/L BA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。最优的草海桐体细胞胚和不定芽诱导培养基为：MS培养基添加3.0mg/L BA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；利用该培养基诱导的体细胞胚和不定芽分别如图2和图3所示。

三、不同浓度、种类的植物生长调节剂对草海桐体细胞胚与不定芽增殖及其伸长的影响

试验设置1～15试验组，1～15试验组的均以MS为基本培养基，在不同的试验组中还添加0.0～1.5mg/L BA、NAA、KT、0.1～1.0mg/L BA+0.1～1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；

具体步骤如下：

(1)取步骤二的体细胞胚和不定芽的混合块。

(2)在无菌条件下用刀切成大小相同的小块并分别接种于试验组1～15的培养基内，每个瓶子接种3块，每个试验组接种10瓶。

(3)培养30d后观察记录其生长情况以及统计体细胞胚与不定芽增殖系数、平均株高。

(4)间隔15d后重复该试验两次。

体细胞胚与不定芽增殖系数＝30d后的体细胞胚与不定芽总数/接种时体细胞胚与不定芽的总数；

平均株高＝30d后的体细胞胚与不定芽的总株高/30d后的体细胞胚与不定芽总数。

采用上述方法进行草海桐茎段诱导的不定芽发生，所得到的结果如表4所示。

表4不同的植物生长调节剂对草海桐体细胞胚与不定芽增殖及其伸长的影响

序号	植物生长调节(mg/L)	体细胞胚与不定芽增殖系数	平均芽长(cm)
				1	CK	0.5±0.0fg	2.3±0.2d
2	BA0.1	1.2±0.8d	2.1±0.2d
				3	BA1.0	3.3±0.2a	1.3±0.2e
4	BA1.5	3.4±0.1a	1.5±0.1e
				5	NAA0.1	0.6±0.0g	3.4±0.1b
6	NAA1.0	0.4±0.0efg	5.0±0.1a
				7	NAA1.5	0.4±0.1g	5.1±0.3a
8	KT0.1	1.2±0.1d	2.4±0.2d
				9	KT 1.0	1.6±0.1c	2.7±0.1d
10	KT 1.5	1.6±0.1c	2.6±0.2d
				11	BA0.1+NAA1.0	0.9±0.1def	3.6±0.2bc
12	BA0.25+NAA0.75	0.9±0.0de	4.2±0.3b
				13	BA0.5+NAA0.5	1.1±0.1d	4.1±0.1b
14	BA0.75+NAA0.25	2.7±0.1b	3.7±0.3bc
				15	BA1.0+NAA0.1	2.8±0.2b	3.7±0.2bc

由表4可知：在单独添加植物生长调节剂的处理中发现，细胞分裂素对体细胞胚或者不定芽的增殖有积极影响，其增殖倍率随着细胞分裂素浓度的上升而增加，其中BA的作用效率大于KT。在添加1.0～1.5mg/L BA培养基中培养的增殖倍率最高，可达3.4。在不含任何植物生长调节剂的空白培养基(CK)或者添加NAA的培养基中，不但没有增殖反而出现了部分不定芽黄化死亡的现象。在BA与NAA配合使用时，当BA的浓度不低于NAA，体细胞胚与不定芽可增殖。相反地，当BA的浓度低于NAA时，数量反而比接种时的下降。

对于体细胞胚的生长发育和不定芽的伸长效果而言，在单独添加NAA的培养基对体细胞胚的生长发育和不定芽的伸长诱导效果最好，平均株高随着NAA浓度的升高而增加，当浓度达1.0～1.5mg/L时不定芽的平均株高最长，可达5.1cm。BA与NAA配合使用时的对体细胞胚的生长发育和不定芽的伸长诱导效果次之，而单独添加细胞分裂素，特别是添加高浓度BA的培养基上培养的平均株高较低。另外，还观察发现，在空白培养基或者添加了NAA的培养基上培养的不定芽会出现生根现象，生根的程度与NAA浓度呈正相关性。

综合考虑体细胞胚与不定芽的增殖与平均株高等因素，最优的草海桐体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基为：MS培养基添加0.75mg/L BA、0.25mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；或MS培养基添加1.0mg/L BA、0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；体细胞胚萌发形成的芽如图4所示，体细胞胚萌发与不定芽伸长如图5所示。

四、不同的植物生长调节剂及其组合对草海桐芽体生根诱导影响

试验设置1～19组。1～19试验组的均以1/2MS为基本培养基，在不同的试验组中或分别还添加了0.0～3.5mg/L NAA、IBA、IAA、1.0mg/L IBA+0.2～1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；

具体试验步骤如下：

(1)从步骤三中，将体细胞再生形成的芽体或诱导伸长的不定芽从芽块中切离下来。

(2)分别在无菌条件下微扦插于试验组1～19中进行不定芽生根诱导。

(3)每个瓶接种芽6个，每个处理10瓶。培养40d后观察并统计其生根率，生根系数及其长势。

(4)间隔15d后重复该试验两次。

生根率＝(40d后生根的芽体数/接种的芽体数)×100％。生根系数＝40d后的生根总条数/生根的芽体数。

表5不同的植物生长调节剂及其组合对草海桐芽体生根的影响

由表5可知：将草海桐的芽体接种于相应的生根培养基中，培养10～15d后即可明显观察到生根现象，培养30d后进行生根情况的统计。由表5可知，相对于不添加任何植物生长调节剂的空白对照组(CK)而言，草海桐芽体在添加不同浓度的IBA、NAA、IAA以及IBA与NAA组合的培养基里均具有较高的生根率，其生根率可达到81.6～99.0％，但在不同浓度的条件下，不同处理的生根率呈显著差异。在添加0.1-3.5mg/L NAA或IAA的生根培养基中，生根率随着其浓度的升高而增加，当浓度达到0.5mg/L以上时，则差异不显著。在IBA的不同浓度中，生根率差异不显著，且当1.0mg/L IBA与1.0mg/L或者0.2mg/L的NAA配合时，其生根率较单独使用IBA时无明显差异。

低浓度的IBA(0.1mg/L)、以及0.1～0.5mg/L NAA或IAA所诱导生根系数与不添加任何植物生长调节剂的空白培养基(CK)的生根系数无显著差异，均为8.4～11.3；高浓度的IBA、NAA以及IAA均可诱导较高的生根系数，且生根系数随着植物生长调节剂的浓度上升而增加。在相同的浓度条件下，IBA诱导的生根系数显著高于NAA或者IAA所诱导的。在单独添加2.5～3.5mg/L IBA或者1.0mg/L IBA与0.2mg/L NAA配合使用时的生根系数最高，可达23.0。另外，高浓度的NAA(1.0～3.5mg/L)可诱导根形成不同程度的愈伤组织。

因此，最优的草海桐生根诱导培养基为：1/2MS培养基添加2.5～3.5mg/L IBA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；或者1/2MS培养基添加1.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；生根的草海桐组培苗如图6所示。

五、不同基质对草海桐组培苗移栽的影响

试验设置试验组1～6组。在试验组1～6中，用于移栽的基质分别为：3/4黄泥+1/4泥炭土、100％河沙、1/2河沙+1/2珊瑚沙、3/6泥炭土+2/6蛭石+1/6珍珠岩、1/3泥炭土+1/3蛭石+1/3珍珠岩、100％珊瑚沙的比例进行混合。组培苗移栽不同基质效果如图7所示。

具体实验步骤如下：

(1)分别取步骤4中获得的生长状况良好的组培苗。

(2)在组培苗长到3～4cm高后，打开其所在的培养瓶瓶盖，炼苗3～5d，使幼苗初步适应外界的环境。

(3)用自来水洗去其根系附着的固体培养基，然后分别移栽到试验组1～6的基质中，每个处理移栽100株。

(4)浇足定根水，每天的早晚采用喷雾的方法保持土壤湿润。

(5)分别在15d和45d后分别统计草海桐组培苗的移栽成活率、叶片数与株高，并计算15d至45d这30d内草海桐叶片的增加数与平均株高增加量。

移栽成活率＝(成活的组培苗数/移栽时苗的数量)×100％。

平均叶片增加量＝45d时的平均叶片的总量-15d时平均叶片的总量；

株高增加量＝45d时的平均株高-15d时的平均株高。

具体如表6所示：

表6不同基质对组培苗的移栽成活率与生物量积累的影响

由表6可知：将生根良好的组培苗移栽到不同的基质中，移栽15d统计发现在1/2河沙+1/2珊瑚沙的基质或者100％河沙的基质中成活率最高，可达92.2％。在3/6泥炭土+2/6蛭石+1/6珍珠岩混合基质、1/3泥炭土+1/3蛭石+1/3珍珠岩的基质以及100％珊瑚沙中次之，在1/3泥炭土+1/3蛭石+1/3珍珠岩混合基质中移栽成活率最低。在移栽45d统计发现：在1/2河沙+1/2珊瑚沙混合的基质的成活率最高，为91.7％。而在移栽15d时具有最高成活率的100％河沙的基质上的组培苗现在成活率为82.7％，次于河沙与珊瑚沙混合基质的。在含有泥炭土的基质中的移栽成活率较低，且在育苗的过程中会部分组培苗会出现腐烂死亡的现象。

通过在移栽15d至45d期间内的平均叶片增加量与平均株高增加量的统计发现：在3/4黄泥+1/4泥炭土的混合基质中，草海桐组培苗的叶片增加量与平均株高增长量最多，而100％河沙的次之，3/6泥炭土+2/6蛭石+1/6珍珠岩混合基质、1/2河沙+1/2珊瑚沙的基质、100％珊瑚沙以及1/3泥炭土+1/3蛭石+1/3珍珠岩的基质中最低。综合考虑移栽成活率以及平均叶片增加量与平均株高增加量等因素，草海桐组培苗最适的移栽基质应为100％河沙。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种草海桐离体快速繁殖的培养基套盒，其特征在于，包括：

(1)草海桐丛生芽诱导培养基，其为MS培养基添加1.0～2.0mg/L BA、0.1～0.3mg/LNAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；

(2)体细胞胚和不定芽诱导培养基，其为MS培养基添加1.5～3.0mg/L BA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；

(3)体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基，其为MS培养基添加0.75mg/L BA、0.25mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；或为MS培养基添加1.0mg/L BA、0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；

(4)生根诱导培养基，其为1/2MS培养基添加2.5～3.5mg/LIBA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0；或为1/2MS培养基添加1.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

2.根据权利要求1所述的培养基套盒，其特征在于，其还包括用作草海桐组培苗移栽基质的河沙。

3.根据权利要求1所述的培养基套盒，其特征在于，所述的草海桐丛生芽诱导培养基，其为MS培养基添加2.0mg/L BA、0.1mg/L NAA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

4.根据权利要求1所述的培养基套盒，其特征在于，所述的草海桐体细胞胚和不定芽诱导培养基，其为MS培养基添加3.0mg/L BA、25～35g/L蔗糖和6.5～7.5g/L琼脂，pH5.8～6.0。

5.一种草海桐离体快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)在无菌条件下，将外植体消毒后接种于权利要求1所述的丛生芽诱导培养基上培养，获得无菌丛生芽；

(3)取无菌芽的叶接种于权利要求1所述的体细胞胚和不定芽诱导培养基上培养，获得体细胞胚与不定芽；

(4)将体细胞胚与不定芽分别接种于权利要求1所述的体细胞胚与不定芽的增殖和伸长培养基上培养，获得体细胞胚再生芽和伸长的不定芽；

(5)将体细胞胚再生芽和伸长的不定芽接种于权利要求1所述的生根诱导培养基上培养生根，获得草海桐组培苗；

(6)取出草海桐组培苗，将其根部的培养基清洗干净，移栽于河沙上。

6.根据权利要求5所述的草海桐离体快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤(1)～(5)中的培养条件为：25±1℃、光照时间12h光照/12h黑暗、光照强度1500～2000lx。