CN111316911A - 基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法 - Google Patents
基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其步骤包括:优良单株选择、外植体选取及准备、诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽,本发明中通过对外植体的合理选取、诱导培养基和诱导培养条件的控制、增殖培养基和增殖培养条件的控制、生根培养基和生根培养条件的控制,培养得到草海桐种苗,该方法能够在短期内提供大量与母本性状一致的优良草海桐种苗,这解决了现有技术中扦插繁殖和种子繁殖的繁殖率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于植物繁育技术领域,具体涉及一种基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法。
背景技术
草海桐(scaevola sericea)又称羊角树、水草仔、细叶水草,属于草海桐科多年生常绿亚灌木植物。草海桐性喜高温、潮湿和阳光充足的环境,耐盐性佳、抗强风、耐旱、耐寒,抗污染及病虫危害能力强,生长速度快,因此可作为海岛与海岸带防风固沙植被的备选树种。另外,经过研发发现草海桐还含有多种次生代谢产物,具有重要的药用价值,可治疗白内障、胃病、鳞状皮肤癣、刀伤及动物咬伤,并有改善眼部疼痛的功能。
由于人类对生态环境和自然资源保护意识的不够使该种植物的自然资源十分有限。目前草海桐的主要繁殖方式是种子繁殖和扦插繁殖,但是草海桐由于种子不好收集,发芽率低导致繁殖率低,同时由于种子遗传的不稳定难使后代保有原有品种的优良性状,而扦插繁殖受到草海桐母株来源的限制,繁殖效率低,难以进行规模化生产。随着生物技术的发展,一种专门用于植物种苗快速繁殖的组织培养技术开始出现,组织培养技术具有繁殖快、周期短、且能在短期内提供大量与母本性状一致的优良种苗用于生产的特点,因而有望成为提供草海桐种源的新方法,然而目前关于草海桐的组织培养尚未有成熟的报道。
因此,亟需提供一种基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,该方法具有繁殖快、周期短、且能在短期内提供大量与母本性状一致的优良草海桐种苗的优点。
为实现以上目的,本发明提供了一种基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,包括如下步骤:
(1)优良单株选择,从草海桐中选择高抗盐碱、株型茁壮漂亮的植株作为优良单株;
(2)外植体选取及准备,从优良单株上选取幼嫩的叶片作为外植体,将选取的外植体依次进行清洗、消毒后吸干水分,备用;
(3)诱导培养,将消毒好的外植体接入到诱导培养基中培养得到愈伤组织,诱导培养基为MS培养基中添加0.3-0.7mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得;
(4)增殖培养,将诱导培养获得的愈伤组织接入到芽分化培养基中培养得到再生苗,芽分化培养基为MS培养基中添加0.8-1.2mg/L6BA、0.1-0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得;
(5)生根培养,将增殖培养得到的再生苗转到生根培养基中后获得生根再生苗,生根培养基为1/2MS培养基中添加0.2-0.8mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得;
(6)炼苗移栽,将生根再生苗放置在大棚里炼苗后,移栽到营养土与耶糠体积比为1:1的移栽基质中生长,即得草海桐种苗。
与现有技术相比,本发明以优良单株的幼嫩叶为外植体,通过外植体的消毒准备、诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程建立了快速繁育草海桐种苗的方法,该方法能够在短期内提供大量与母本性状一致的优良草海桐种苗,这解决了现有技术中扦插繁殖和种子繁殖的繁殖率低的问题,同时繁育出遗传背景一致的草海桐种苗,还解决了现有技术中种子繁育杂合后代的问题,又能为草海桐的遗传转化提供基础,同时该方法繁殖快、周期短、成本低,这为草海桐良种繁育与推广应用提供了技术保障。
较佳地,本发明的步骤(2)中进行清洗、消毒的方法进一步包括如下步骤:
(21)将选取的外植体用洗洁精清洗干净;
(22)将清洗干净的外植体用流水冲洗10-15min;
(23)用75%酒精消毒30-40s,再用2%次氯酸钠消毒10-12min,最后用无菌水冲洗3-4次。
优选地,本发明的诱导培养基为MS培养基中添加0.5mg/L2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得。
优选地,本发明的芽分化培养基为MS培养基中添加1mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得。
优选地,本发明的生根培养基为1/2MS培养基中添加0.5mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得。
较佳地,本发明的诱导培养基、芽分化培养基及生根培养基的pH均为5.8。
具体地,本发明的步骤(3)中诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养0-20d,光照培养20-50d,光照强度2500Lux。
具体地,本发明的步骤(4)中增殖培养的条件为:时间20-30d,温度28℃,光照强度3000Lux。
具体地,本发明的步骤(5)中生根培养的条件:时间25-30d,温度28℃,光照强度3000Lux。
较佳地,本发明的步骤(6)中生根再生苗的炼苗时间为5-7d。
附图说明
图1为本发明选择的草海桐优良单株的实物图。
图2为本实施例1的愈伤组织的实物图。
图3为本实施例1的再生苗的实物图。
图4为本实施例1的生根再生苗的实物图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案及有益效果,下面将结合具体实施例对本发明做进一步地说明,下述实施例是对本发明做的进一步解释说明,不应当作为对本发明的限制。需要说明的是,以下试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得,下述方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1
本发明的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其步骤包括:
(1)优良单株选择
从草海桐中选择高抗盐碱、株型茁壮漂亮的植株作为优良单株;
(2)外植体选取及准备
从优良单株上选取幼嫩的叶片作为外植体,用洗洁精清洗干净,流水冲洗15min,75%酒精消毒40s,2%次氯酸钠消毒10min,无菌水冲洗4次,用滤纸吸干水分,备用;
(3)诱导培养
将消毒好的外植体接入到诱导培养基中培养得到愈伤组织,诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养0d,光照培养50d,光照强度2500Lux;诱导培养基为MS培养基中添加0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,诱导培养基的pH为5.8;
(4)增殖培养
将诱导培养获得的愈伤组织接入到芽分化培养基中培养得到再生苗,增殖培养的条件为:时间20d,温度28℃,光照强度3000Lux;芽分化培养基为MS培养基中添加1.0mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,芽分化培养基的pH为5.8;
(5)生根培养
将增殖培养得到的再生苗转到生根培养基中培养30d后获得生根再生苗,生根培养的条件:时间30d,温度28℃,光照强度3000Lux;生根培养基为1/2MS培养基中添加0.5mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得,生根培养基的pH为5.8;
(6)炼苗移栽
将生根再生苗放置在大棚里炼苗5d后,移栽到营养土与耶糠体积比为1:1的移栽基质中生长,即得草海桐种苗。
实施例2
本发明的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其步骤包括:
(1)优良单株选择
从草海桐中选择高抗盐碱、株型茁壮漂亮的植株作为优良单株;
(2)外植体选取及准备
从优良单株上选取幼嫩的叶片作为外植体,用洗洁精清洗干净,流水冲洗12min,75%酒精消毒30s,2%次氯酸钠消毒12min,无菌水冲洗4次,用滤纸吸干水分,备用;
(3)诱导培养
将消毒好的外植体接入到诱导培养基中培养得到愈伤组织,诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养0d,光照培养50d,光照强度2500Lux;诱导培养基为MS培养基中添加0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,诱导培养基的pH为5.8;
(4)增殖培养
将诱导培养获得的愈伤组织接入到芽分化培养基中培养得到再生苗,增殖培养的条件为:时间20d,温度28℃,光照强度3000Lux;芽分化培养基为MS培养基中添加1.0mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,芽分化培养基的pH为5.8;
(5)生根培养
将增殖培养得到的再生苗转到生根培养基中培养30d后获得生根再生苗,生根培养的条件:时间30d,温度28℃,光照强度3000Lux;生根培养基为1/2MS培养基中添加0.5mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得,生根培养基的pH为5.8;
(6)炼苗移栽
将生根再生苗放置在大棚里炼苗5d后,移栽到营养土与耶糠体积比为1:1的移栽基质中生长,即得草海桐种苗。
实施例3
本发明的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其步骤包括:
(1)优良单株选择
从草海桐中选择高抗盐碱、株型茁壮漂亮的植株作为优良单株,
(2)外植体选取及准备
从优良单株上选取幼嫩的叶片作为外植体,用洗洁精清洗干净,流水冲洗10min,75%酒精消毒35s,2%次氯酸钠消毒11min,无菌水冲洗3次,用滤纸吸干水分,备用;
(3)诱导培养
将消毒好的外植体接入到诱导培养基中培养得到愈伤组织,诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养0d,光照培养50d,光照强度2500Lux;诱导培养基为MS培养基中添加0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,诱导培养基的pH为5.8;
(4)增殖培养
将诱导培养获得的愈伤组织接入到芽分化培养基中培养得到再生苗,增殖培养的条件为:时间20d,温度28℃,光照强度3000Lux;芽分化培养基为MS培养基中添加1.0mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,芽分化培养基的pH为5.8;
(5)生根培养
将增殖培养得到的再生苗转到生根培养基中培养30d后获得生根再生苗,生根培养的条件:时间30d,温度28℃,光照强度3000Lux;生根培养基为1/2MS培养基中添加0.5mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得,生根培养基的pH为5.8;
(6)炼苗移栽
将生根再生苗放置在大棚里炼苗5d后,移栽到营养土与耶糠体积比为1:1的移栽基质中生长,即得草海桐种苗。
实施例4
步骤(3)中诱导培养基为MS培养基中添加0.3mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,其余步骤均与实施例1相同。
实施例5
步骤(3)中诱导培养基为MS培养基中添加0.7mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,其余步骤均与实施例1相同。
实施例6
步骤(4)中芽分化培养基为MS培养基中添加0.8mg/L6BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,其余步骤均与实施例1相同。
实施例7
步骤(4)中芽分化培养基为MS培养基中添加1.2mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,其余步骤均与实施例1相同。
实施例8
步骤(5)中生根培养基为1/2MS培养基中添加0.2mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得,其余步骤均与实施例1相同。
实施例9
步骤(5)中生根培养基为1/2MS培养基中添加0.8mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得,其余步骤均与实施例1相同。
实施例10
步骤(6)中生根再生苗在大棚中的炼苗时间为7d,其余步骤均与实施例1相同。
实施例11
步骤(3)中诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养10d,光照培养25d,光照强度2500Lux,其余步骤均与实施例1相同。
实施例12
步骤(3)中诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养20d,光照培养20d,光照强度2500Lux,其余步骤均与实施例1相同。
实施例13
步骤(4)中增殖培养的条件为:时间30d,温度28℃,光照强度3000Lux,其余步骤均与实施例1相同。
实施例14
步骤(5)中生根培养的条件:时间25d,温度28℃,光照强度3000Lux,其余步骤均与实施例1相同。
本发明的所有实施例中挑选的优良单株的株型茁壮漂亮且具有高抗盐碱性,具体实物图如图1所示,选择具有优良耐寒碱的优良植株作为母体是成功繁育草海桐种苗的必要条件之一。在本发明的实施例1中,选取图1所示的优良单株上幼嫩的叶片作为外植体,进行消毒准备,然后利用诱导培养基对外植体进行诱导培养得到如图2所示的愈伤组织,接着利用芽分化培养基对愈伤组织进行增殖培养得到如图3所示的再生苗,然后再利用生根培养基对再生苗进行生根培养得到如图4所示的生根再生苗、最后再将生根再生苗进行炼苗移栽即可得到大量与优良单株遗传背景一致的草海桐种苗,这解决了现有技术中扦插繁殖和种子繁殖的繁殖率低的问题,同时繁育出遗传背景一致的草海桐种苗还解决了现有技术中种子繁育杂合后代的问题,又能为草海桐的遗传转化提供了基础,同时该方法繁殖快、周期短、成本低,这为草海桐良种繁育与推广应用提供了技术保障。
对实施例1-14的外植体的诱导培养、增殖培养、生根培养过程进行观察,并对诱导率、增殖倍数和生根率进行统计,统计结果如下表1所示。
表1实施例1-14的外植体的诱导率、增殖倍数和生根率统计结果表
诱导率 | 增殖倍数 | 生根率 | |
实施例1 | 98% | 5.88 | 99% |
实施例2 | 98% | 5.84 | 98% |
实施例3 | 98% | 5.86 | 98% |
实施例4 | 91% | 4.23 | 91% |
实施例5 | 92% | 4.12 | 90% |
实施例6 | 99% | 4.45 | 93% |
实施例7 | 98% | 4.57 | 92% |
实施例8 | 98% | 5.85 | 95% |
实施例9 | 98% | 5.91 | 93% |
实施例10 | 98% | 5.88 | 99% |
实施例11 | 98% | 5.85 | 99% |
实施例12 | 98% | 5.89 | 98% |
实施例13 | 98% | 5.87 | 98% |
实施例14 | 98% | 5.86 | 99% |
对比实施例1、实施例4-5,实施例1的外植体的诱导率高于实施例4-5,原因是实施例1的诱导培养基中生长素2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的含量最容易诱导外植体形成愈伤组织,2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的含量过高或过低均不利于愈伤组织的形成,因此本发明中诱导培养基优选地为MS培养基中添加0.5mg/L2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得。
对比实施例1、实施例6-7,实施例1的外植体的增殖倍数高于实施例6-7,原因是实施例1中芽分化培养基为MS培养基中添加1mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得,其6BA(6-苄氨基嘌呤)与NAA(萘乙酸)之比过高或过低均会抑制愈伤组织的增殖,因此本发明的芽分化培养基优选地为MS培养基中添加1mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得。
对比实施例1、实施例8-9,实施例1的外植体的生根率高于实施例8-9,原因是实施例1的生根培养基中NAA(萘乙酸)的含量最利于促进再生苗生根,NAA(萘乙酸)的含量过高或过低均不利于再生苗的生根,因此本发明的生根培养基优选地为1/2MS培养基中添加0.5mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明做了详细的说明,但本发明并不局限于以上揭示的实施例,而应当涵盖各种根据本发明的本质进行的修改、等效组合。
Claims (10)
1.一种基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)优良单株选择,从草海桐中选择高抗盐碱、株型茁壮漂亮的植株作为优良单株;
(2)外植体选取及准备,从优良单株上选取幼嫩的叶片作为外植体,将选取的外植体依次进行清洗、消毒后吸干水分,备用;
(3)诱导培养,将消毒好的外植体接入到诱导培养基中培养得到愈伤组织,所述诱导培养基为MS培养基中添加0.3-0.7mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得;
(4)增殖培养,将诱导培养获得的愈伤组织接入到芽分化培养基中培养得到再生苗,所述芽分化培养基为MS培养基中添加0.8-1.2mg/L6BA、0.1-0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得;
(5)生根培养,将增殖培养得到的再生苗转到生根培养基中后获得生根再生苗,所述生根培养基为1/2MS培养基中添加0.2-0.8mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得;
(6)炼苗移栽,将生根再生苗放置在大棚里炼苗后,移栽到营养土与耶糠体积比为1:1的移栽基质中生长,即得草海桐种苗。
2.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述步骤(2)中进行清洗、消毒的方法进一步包括如下步骤:
(21)将选取的外植体用洗洁精清洗干净;
(22)将清洗干净的外植体用流水冲洗10-15min;
(23)用75%酒精消毒30-40s,再用2%次氯酸钠消毒10-12min,最后用无菌水冲洗3-4次。
3.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述诱导培养基为MS培养基中添加0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得。
4.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述芽分化培养基为MS培养基中添加1.0mg/L6BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖及7g/L琼脂所得。
5.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述生根培养基为1/2MS培养基中添加0.5mg/LNAA、10g/L蔗糖、1g/L花宝2号及7g/L琼脂所得。
6.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述诱导培养基、芽分化培养基及生根培养基的pH均为5.8。
7.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述步骤(3)中诱导培养的条件为:温度25℃,暗培养0-20d,光照培养20-50d,光照强度2500Lux。
8.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述步骤(4)中增殖培养的条件为:时间20-30d,温度28℃,光照强度3000Lux。
9.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述步骤(5)中生根培养的条件:时间25-30d,温度28℃,光照强度3000Lux。
10.如权利要求1所述的基于组织培养技术繁育草海桐种苗的方法,其特征在于,所述步骤(6)中生根再生苗在大棚中的炼苗时间为5-7d。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200623 |
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