CN105393919B - 黑老虎的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌外植体；B、外植体的诱导；C、愈伤组织的防褐化处理；D、愈伤组织的分化；E、继代增殖培养；F、壮苗培养；G、生根培养；H、炼苗与移栽。本发明的组培方法将黑老虎外植体褐化率控制在7％以下，生根率达到95％，成苗率达到97％以上。
Description
技术领域
本发明涉及黑老虎的培育领域。更具体地说，本发明涉及一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
黑老虎为木兰科植物厚叶五味子Kadsura coccinea(Lem)A.C.Smith。又叫钻朗风、大钻、冷饭团等，生于山谷、疏林中。具有镇痛、镇静、消炎的作用，中医临床用于治疗风湿骨痛、跌打肿痛、胃痛、急性肠炎、疝气、产后腹痛、痛经等症疗效显著，多次被国家列为中药保护品种。黑老虎为多年生木质常绿藤本植物，茎蔓茂盛，叶片终年翠绿，遮阴效果好，适合套种阴生药材，其幼果青绿色，成熟时颜色深红，极具观赏性，因此颇受世人青睐。一直以来，黑老虎药材完全依赖野生资源，以采挖全株为代价，植物的繁殖主要以实生繁殖为主，由于植株结实性差，野生动物爱吃其果实，因此种子存有量少且出芽率低，导致其繁殖速度十分缓慢，更有甚者，民间灭绝式采挖，已造成国内外野生资源濒危。目前有关黑老虎的组织培养报道较少，特别是尚未有采用叶片作为外植体培养的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，以黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片为外植体，通过多次防褐化处理的操作使外植体的褐化率控制在7％以下，并通过在生根培养基中加入促生根营养液将黑老虎外植体的生根率达到95％，以及通过适时定量喷施促生长营养液使成苗率达到97％以上。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌外植体；
B、外植体的诱导：用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，接种到诱导培养基中，在培养温度为24-26℃，黑暗条件下培养7d，然后在光照强度1500Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下诱导培养21d，获得第一愈伤组织，其中诱导培养基中的配方为：MS、TDZ 1.0-1.5mg/L、2,4-D 1.0-3.0mg/L、NAA 0.1-1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整诱导培养基的pH值为5.8；
C、愈伤组织的防褐化处理：将第一愈伤组织转接到防褐化培养基中，在培养温度为20-25℃，黑暗条件下培养7天，得第二愈伤组织，其中防褐化培养基的配方为：MS、6-BA0.1-0.5mg/L、硝酸银1.0-8.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整防褐化培养基的pH值为5.8；
D、愈伤组织的分化：将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块，接种到分化培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天，获得丛生芽苗，其中分化培养基的配方为：MS、6-BA 1.0-2.0mg/L、IBA 0.5-1.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整分化培养基的pH值为5.8；
E、继代增殖培养：将丛生芽苗置于增殖培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养30天得到增殖苗，其中增殖培养基的配方为：MS、KT 0.1-0.5mg/L、6-BA 0.5-1.5mg/L、NAA0.2-1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整增殖培养基的pH值为5.8；
F、壮苗培养：将增殖苗置于壮苗培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天得到健壮苗，其中壮苗培养基的配方为：MS、粉状活性炭0.5-1.5g/L、6-BA 0.1-0.5mg/L、IBA0.1-0.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整壮苗培养基的pH值为5.8；
G、生根培养：将健壮苗置于生根培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天得到带根幼苗，其中生根培养基包括：1/2MS、粉状活性炭0.1-0.5g/L、IBA0.5-1.5mg/L和NAA0.5-1.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整生根培养基的pH值为5.8；
H、炼苗与移栽。
优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，炼苗与移栽具体是指将带根幼苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为25-27℃下，放置7天，然后打开瓶盖，炼苗3-4天，取出，洗净根部培养基，移栽到由腐殖土、蛭石和椰糠按体积比为3:1:1混合组成的基质中，移栽后7-10天覆盖塑料薄膜，再覆盖一层报纸，控制遮光率为60％-70％，空气湿度85％-90％。
优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在外植体诱导培养之前，将外植体置于浸泡液中，在4℃黑暗条件下超声波处理4-5h，超声功率为300W，所述浸泡液的配方为：维生素C 1.2-1.6g/L、芸香苷0.5-0.7g/L、聚乙烯吡咯烷酮0.7-0.9g/L、活性炭1.2-1.4g/L、咖啡碱0.1-0.3g/L、木犀草素1.6-1.8g/L和石决明粉100-120mg/L。
优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在步骤B中用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块之前，以及步骤D中将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块接种到分化培养基前，将刀片两侧涂抹0.5-1mm厚的凝胶剂，所述凝胶剂由以重量份计的如下原料制成：魔芋精粉10-12份、蜂蜜4-5份、杨梅素0.15-0.18份、迷迭香酸0.36-0.42份、竹醋液1.3-1.5份、木耳多糖4-8份和磁化水100份。
优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述生根培养基中还包括3-5mL/L的促生根营养液，所述促生根营养液的配方为：玉米素50-70mg/L、无水乙醇30mL/L、磷酸二氢铵200-220mg/L、小檗碱2-4mg/L和芦荟汁液10-14g/L。
优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，带根幼苗移栽后的第10天起，每间隔7-9天喷施促生长营养液1次，共计5次，每次喷施量为每1株带根幼苗喷施50-80mL，所述促生长营养液由以重量份计的如下原料组成：取48-58重量份的圣女果破碎榨汁得圣女果汁，将3-5重量份的筋骨草干燥粉碎后加入到圣女果汁中，加入20-34重量份的蔗糖，混匀后密闭于10-15℃下放置7-10天，取出，加入其重量的5倍的磁化水磨浆，得第一混合物，按照第一混合物、竹醋液和磁化水以质量比为20-25:3:200加入竹醋液和磁化水，混匀后即得所述促生长营养液。
优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述消毒处理在指将黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片用1％洗洁精水溶液浸泡5-10min，线状自来水冲洗10-15min，无菌水润洗一次，再用添加了2-3滴吐温-20的150mL质量分数为0.1％的升汞浸泡6-8min，无菌水冲洗3-5次，得无菌外植体。
本发明至少包括以下有益效果：
1)本发明的组培方法简单、根质量好，易于移栽成活，采用叶片为外植体，不仅取材方便，而且节约了茎段避免了整株采集，有利于黑老虎资源的保护，也能满足市场对黑老虎药材的需求；
2)繁殖速度快，培育周期短，不受季节限制，可实现工厂化育苗，且组织培养育苗的种苗遗传稳定性好；
3)采用防褐化培养基处理，降低了外植体的褐化率，另外，外植体诱导培养之前，将外植体置于浸泡液中超声处理，利用维生素C、芸香苷为抗氧化剂，聚乙烯吡咯烷酮、活性炭为抗吸收剂抗褐化处理，咖啡碱有助于减轻伤口处的褐化程度，木犀草素和石决明粉具有抑制多种病菌以及增强外植体的免疫功能的作用。
组织培养的pH在4.0-5.0外植体排出的褐化物较多，本发明的发明人发现哎不影响外植体生长的情况下培养基的pH设定在5.8时，褐化率最低；
外植体消毒一般采用酒精结合升汞处理，但是酒精消毒会增加褐化率，并且消毒时间越长，褐化率越高，本发明将消毒和灭菌分为2步，一个为升汞浸泡，另一个为结合具有防褐化作用的浸泡液进一步杀菌处理，提高了外植体在诱导培养之前的菌污染率；
4)将刀片两侧涂抹0.5-1mm厚的凝胶剂，对切割过程中的黑老虎组织进行防褐化保护，其中凝胶剂中的魔芋精粉具有抑菌和保水的作用，蜂蜜能促进褪黑激素的生成，杨梅素和迷迭香酸具有抗氧化作用和清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化的作用，迷迭香酸还具有抑菌作用，竹醋液具有抑菌和促进组织细胞生长，促进其他物质渗透被细胞吸收的作用，木耳多糖具有提高细胞组织免疫力和保护组织损伤的作用，磁化水具有抑菌、促进组织发育、生根、茁壮生长的作用；
5)生根培养基中还包括促生根营养液，其能有效提高外植体的生根率和成苗率，玉米素为植物激素，促进外植体生根、发芽，磷酸二氢铵补充磷素，促进外植体生根量增多，小檗碱抗菌谱广，可以防止外植体在生根生长过程中遭受病菌侵染而致使成苗率降低，芦荟汁液为芦荟的汁液，具有保湿、杀菌，提高细胞组织生命力的作用；
6)幼苗移栽后定量适时的喷施促生长营养液，可以促进幼苗根系生长，茎杆粗壮，有利于加快幼苗出圃的速度，缩短培育时间，其中，圣女果含有谷胱甘肽和番茄红素，还富含维生素A、维生素C、维生素B1、维生素B2以及胡萝卜素和钙、磷、钾、镁、铁、锌、铜和碘等多种元素，还含有蛋白质、糖类、有机酸、纤维素，具有抑制细菌、促进生长、增强幼苗生命力的作用，筋骨草粉碎后加入到圣女果中一起蜜制，促进圣女果中有益成分的溶出，并对促进幼苗生长具有协同作用；竹醋液具有促进根和幼苗生长的作用，还具有一定的抗菌性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌外植体；
B、外植体的诱导：用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，接种到诱导培养基中，在培养温度为24℃，黑暗条件下培养7d，然后在光照强度1500Lux，光照时间为10小时/天的条件下诱导培养21d，获得第一愈伤组织，其中诱导培养基中的配方为：MS、TDZ 1.0mg/L、2,4-D 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整诱导培养基的pH值为5.8；
C、愈伤组织的防褐化处理：将第一愈伤组织转接到防褐化培养基中，在培养温度为20℃，黑暗条件下培养7天，得第二愈伤组织，其中防褐化培养基的配方为：MS、6-BA0.1mg/L、硝酸银1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整防褐化培养基的pH值为5.8；
D、愈伤组织的分化：将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块，接种到分化培养基中，在培养温度为24℃，光照强度1500Lux，光照时间为10小时/天的条件下培养21天，获得丛生芽苗，其中分化培养基的配方为：MS、6-BA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整分化培养基的pH值为5.8；
E、继代增殖培养：将丛生芽苗置于增殖培养基中，在培养温度24℃，光照强度2000Lux，光照时间为10小时/天的条件下培养30天得到增殖苗，其中增殖培养基的配方为：MS、KT 0.1mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA0.2mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整增殖培养基的pH值为5.8；
F、壮苗培养：将增殖苗置于壮苗培养基中，在培养温度24℃，光照强度2000Lux，光照时间为10小时/天的条件下培养21天得到健壮苗，其中壮苗培养基的配方为：MS、粉状活性炭0.5g/L、6-BA 0.1mg/L、IBA0.1mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整壮苗培养基的pH值为5.8；
G、生根培养：将健壮苗置于生根培养基中，在培养温度24℃，光照强度2000Lux，光照时间为10小时/天的条件下培养21天得到带根幼苗，其中生根培养基包括：1/2MS、粉状活性炭0.1g/L、IBA0.5mg/L和NAA0.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整生根培养基的pH值为5.8；
H、炼苗与移栽：具体是指将带根幼苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为25℃下，放置7天，然后打开瓶盖，炼苗3天，取出，洗净根部培养基，移栽到由腐殖土、蛭石和椰糠按体积比为3:1:1混合组成的基质中，移栽后7天覆盖塑料薄膜，再覆盖一层报纸，控制遮光率为60％，空气湿度85％。
其中，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述消毒处理在指将黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片用1％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗10min，无菌水润洗一次，再用添加了2滴吐温-20的150mL质量分数为0.1％的升汞浸泡6min，无菌水冲洗3次，得无菌外植体。
实施例2：
一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌外植体；
B、外植体的诱导：用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.5cm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，接种到诱导培养基中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养7d，然后在光照强度1500Lux，光照时间为11小时/天的条件下诱导培养21d，获得第一愈伤组织，其中诱导培养基中的配方为：MS、TDZ 1.25mg/L、2,4-D2.0mg/L、NAA 0.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整诱导培养基的pH值为5.8；
C、愈伤组织的防褐化处理：将第一愈伤组织转接到防褐化培养基中，在培养温度为23℃，黑暗条件下培养7天，得第二愈伤组织，其中防褐化培养基的配方为：MS、6-BA0.3mg/L、硝酸银4.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整防褐化培养基的pH值为5.8；
D、愈伤组织的分化：将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块，接种到分化培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500Lux，光照时间为11小时/天的条件下培养21天，获得丛生芽苗，其中分化培养基的配方为：MS、6-BA 1.5mg/L、IBA 1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整分化培养基的pH值为5.8；
E、继代增殖培养：将丛生芽苗置于增殖培养基中，在培养温度25℃，光照强度2000Lux，光照时间为11小时/天的条件下培养30天得到增殖苗，其中增殖培养基的配方为：MS、KT 0.3mg/L、6-BA 1.0mg/L、NAA0.6mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整增殖培养基的pH值为5.8；
F、壮苗培养：将增殖苗置于壮苗培养基中，在培养温度25℃，光照强度2000Lux，光照时间为11小时/天的条件下培养21天得到健壮苗，其中壮苗培养基的配方为：MS、粉状活性炭1.0g/L、6-BA 0.3mg/L、IBA0.3mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整壮苗培养基的pH值为5.8；
G、生根培养：将健壮苗置于生根培养基中，在培养温度25℃，光照强度2000Lux，光照时间为11小时/天的条件下培养21天得到带根幼苗，其中生根培养基包括：1/2MS、粉状活性炭0.3g/L、IBA1.0mg/L和NAA1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整生根培养基的pH值为5.8；
H、炼苗与移栽：具体是指将带根幼苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为26℃下，放置7天，然后打开瓶盖，炼苗4天，取出，洗净根部培养基，移栽到由腐殖土、蛭石和椰糠按体积比为3:1:1混合组成的基质中，移栽后8天覆盖塑料薄膜，再覆盖一层报纸，控制遮光率为65％，空气湿度88％。
其中，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述消毒处理在指将黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片用1％洗洁精水溶液浸泡7min，线状自来水冲洗12min，无菌水润洗一次，再用添加了2滴吐温-20的150mL质量分数为0.1％的升汞浸泡7min，无菌水冲洗4次，得无菌外植体。
实施例3：
一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌外植体；
B、外植体的诱导：用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成2.0cm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，接种到诱导培养基中，在培养温度为26℃，黑暗条件下培养7d，然后在光照强度1500Lux，光照时间为12小时/天的条件下诱导培养21d，获得第一愈伤组织，其中诱导培养基中的配方为：MS、TDZ 1.5mg/L、2,4-D 3.0mg/L、NAA 1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整诱导培养基的pH值为5.8；
C、愈伤组织的防褐化处理：将第一愈伤组织转接到防褐化培养基中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养7天，得第二愈伤组织，其中防褐化培养基的配方为：MS、6-BA0.5mg/L、硝酸银8.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整防褐化培养基的pH值为5.8；
D、愈伤组织的分化：将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块，接种到分化培养基中，在培养温度为26℃，光照强度1500Lux，光照时间为12小时/天的条件下培养21天，获得丛生芽苗，其中分化培养基的配方为：MS、6-BA 2.0mg/L、IBA 1.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整分化培养基的pH值为5.8；
E、继代增殖培养：将丛生芽苗置于增殖培养基中，在培养温度26℃，光照强度2000Lux，光照时间为12小时/天的条件下培养30天得到增殖苗，其中增殖培养基的配方为：MS、KT 0.5mg/L、6-BA 1.5mg/L、NAA1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整增殖培养基的pH值为5.8；
F、壮苗培养：将增殖苗置于壮苗培养基中，在培养温度26℃，光照强度2000Lux，光照时间为12小时/天的条件下培养21天得到健壮苗，其中壮苗培养基的配方为：MS、粉状活性炭1.5g/L、6-BA 0.5mg/L、IBA0.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整壮苗培养基的pH值为5.8；
G、生根培养：将健壮苗置于生根培养基中，在培养温度26℃，光照强度2000Lux，光照时间为12小时/天的条件下培养21天得到带根幼苗，其中生根培养基包括：1/2MS、粉状活性炭0.5g/L、IBA1.5mg/L和NAA1.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整生根培养基的pH值为5.8；
H、炼苗与移栽：具体是指将带根幼苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为27℃下，放置7天，然后打开瓶盖，炼苗4天，取出，洗净根部培养基，移栽到由腐殖土、蛭石和椰糠按体积比为3:1:1混合组成的基质中，移栽后10天覆盖塑料薄膜，再覆盖一层报纸，控制遮光率为70％，空气湿度90％。
其中，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述消毒处理在指将黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片用1％洗洁精水溶液浸泡10min，线状自来水冲洗15min，无菌水润洗一次，再用添加了3滴吐温-20的150mL质量分数为0.1％的升汞浸泡8min，无菌水冲洗5次，得无菌外植体。
实施例4：
在实施例2的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在外植体诱导培养之前，将外植体置于浸泡液中，在4℃黑暗条件下超声波处理4h，超声功率为300W，所述浸泡液的配方为：维生素C 1.2g/L、芸香苷0.5g/L、聚乙烯吡咯烷酮0.7g/L、活性炭1.2g/L、咖啡碱0.1g/L、木犀草素1.6g/L和石决明粉100mg/L。
实施例5：
在实施例2的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在外植体诱导培养之前，将外植体置于浸泡液中，在4℃黑暗条件下超声波处理4.5h，超声功率为300W，所述浸泡液的配方为：维生素C 1.4g/L、芸香苷0.6g/L、聚乙烯吡咯烷酮0.8g/L、活性炭1.3g/L、咖啡碱0.2g/L、木犀草素1.7g/L和石决明粉110mg/L。
实施例6：
在实施例2的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在外植体诱导培养之前，将外植体置于浸泡液中，在4℃黑暗条件下超声波处理5h，超声功率为300W，所述浸泡液的配方为：维生素C 1.6g/L、芸香苷0.7g/L、聚乙烯吡咯烷酮0.9g/L、活性炭1.4g/L、咖啡碱0.3g/L、木犀草素1.8g/L和石决明粉120mg/L。
实施例7：
在实施例5的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在步骤B中用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块之前，以及步骤D中将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块接种到分化培养基前，将刀片两侧涂抹0.5mm厚的凝胶剂，所述凝胶剂由以重量份计的如下原料制成：魔芋精粉10份、蜂蜜4份、杨梅素0.15份、迷迭香酸0.36份、竹醋液1.3份、木耳多糖4份和磁化水100份。
实施例8：
在实施例5的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在步骤B中用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块之前，以及步骤D中将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块接种到分化培养基前，将刀片两侧涂抹0.8mm厚的凝胶剂，所述凝胶剂由以重量份计的如下原料制成：魔芋精粉11份、蜂蜜5份、杨梅素0.16份、迷迭香酸0.39份、竹醋液1.4份、木耳多糖6份和磁化水100份。
实施例9：
在实施例5的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在步骤B中用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块之前，以及步骤D中将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块接种到分化培养基前，将刀片两侧涂抹1mm厚的凝胶剂，所述凝胶剂由以重量份计的如下原料制成：魔芋精粉12份、蜂蜜5份、杨梅素0.18份、迷迭香酸0.42份、竹醋液1.5份、木耳多糖8份和磁化水100份。
实施例10：
在实施例8的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述生根培养基中还包括3-5mL/L的促生根营养液，所述促生根营养液的配方为：玉米素50mg/L、无水乙醇30mL/L、磷酸二氢铵200mg/L、小檗碱2mg/L和芦荟汁液10g/L。
其中，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，带根幼苗移栽后的第10天起，每间隔7天喷施促生长营养液1次，共计5次，每次喷施量为每1株带根幼苗喷施50mL，所述促生长营养液由以重量份计的如下原料组成：取48重量份的圣女果破碎榨汁得圣女果汁，将3重量份的筋骨草干燥粉碎后加入到圣女果汁中，加入20重量份的蔗糖，混匀后密闭于10℃下放置7天，取出，加入其重量的5倍的磁化水磨浆，得第一混合物，按照第一混合物、竹醋液和磁化水以质量比为20:3:200加入竹醋液和磁化水，混匀后即得所述促生长营养液。
实施例11：
在实施例8的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述生根培养基中还包括3-5mL/L的促生根营养液，所述促生根营养液的配方为：玉米素60mg/L、无水乙醇30mL/L、磷酸二氢铵210mg/L、小檗碱3mg/L和芦荟汁液12g/L。
其中，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，带根幼苗移栽后的第10天起，每间隔8天喷施促生长营养液1次，共计5次，每次喷施量为每1株带根幼苗喷施60mL，所述促生长营养液由以重量份计的如下原料组成：取53重量份的圣女果破碎榨汁得圣女果汁，将4重量份的筋骨草干燥粉碎后加入到圣女果汁中，加入27重量份的蔗糖，混匀后密闭于12℃下放置8天，取出，加入其重量的5倍的磁化水磨浆，得第一混合物，按照第一混合物、竹醋液和磁化水以质量比为22:3:200加入竹醋液和磁化水，混匀后即得所述促生长营养液。
实施例12：
在实施例8的基础上，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述生根培养基中还包括3-5mL/L的促生根营养液，所述促生根营养液的配方为：玉米素70mg/L、无水乙醇30mL/L、磷酸二氢铵220mg/L、小檗碱4mg/L和芦荟汁液14g/L。
其中，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，带根幼苗移栽后的第10天起，每间隔9天喷施促生长营养液1次，共计5次，每次喷施量为每1株带根幼苗喷施80mL，所述促生长营养液由以重量份计的如下原料组成：取58重量份的圣女果破碎榨汁得圣女果汁，将5重量份的筋骨草干燥粉碎后加入到圣女果汁中，加入34重量份的蔗糖，混匀后密闭于15℃下放置10天，取出，加入其重量的5倍的磁化水磨浆，得第一混合物，按照第一混合物、竹醋液和磁化水以质量比为25:3:200加入竹醋液和磁化水，混匀后即得所述促生长营养液。
为了进一步说明本发明的黑老虎的扦插繁殖方法的有益效果，本申请的发明人对实施例2、实施例5、实施例8和实施例11按照说明书中的实施方式进行黑老虎的组织培养快速繁殖，每一种实施方式使用了100个外植体，得出不同实施方式对黑老虎的组织培养快速繁殖菌污染率、生根率、成苗率和褐化率的影响，见表1。
表1不同实施方式对黑老虎的组培快繁菌污染率、生根率、成苗率和褐化率的影响
| 实施方式 | 生根率 | 成苗率 | 菌污染率 | 褐化率 |
| 实施例2 | 82％ | 80％ | 19％ | 21％ |
| 实施例5 | 86％ | 85％ | 8％ | 9％ |
| 实施例8 | 88％ | 86％ | 4％ | 7％ |
| 实施例11 | 95％ | 97％ | 3％ | 7％ |
本发明的申请人还针对培养基的pH做了一系列组培实验，每组使用30个外植体，将实施例2中所有的培养基的pH分别调整在5.0、5.3、5.5、5.8、6.0，其他的组培方法与实施例2相同，得出外植体的褐化率依次为40％、33％、26％、20％、23％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (5)
1.一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌外植体；
B、外植体的诱导：用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，接种到诱导培养基中，在培养温度为24-26℃，黑暗条件下培养7d，然后在光照强度1500Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下诱导培养21d，获得第一愈伤组织，其中诱导培养基中的配方为：MS、TDZ 1.0-1.5mg/L、2,4-D 1.0-3.0mg/L、NAA 0.1-1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整诱导培养基的pH值为5.8；
C、愈伤组织的防褐化处理：将第一愈伤组织转接到防褐化培养基中，在培养温度为20-25℃，黑暗条件下培养7天，得第二愈伤组织，其中防褐化培养基的配方为：MS、6-BA0.1-0.5mg/L、硝酸银1.0-8.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整防褐化培养基的pH值为5.8；
D、愈伤组织的分化：将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块，接种到分化培养基中，在培养温度为24-26℃，光照强度1500Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天，获得丛生芽苗，其中分化培养基的配方为：MS、6-BA 1.0-2.0mg/L、IBA 0.5-1.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整分化培养基的pH值为5.8；
E、继代增殖培养：将丛生芽苗置于增殖培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养30天得到增殖苗，其中增殖培养基的配方为：MS、KT 0.1-0.5mg/L、6-BA0.5-1.5mg/L、NAA0.2-1.0mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整增殖培养基的pH值为5.8；
F、壮苗培养：将增殖苗置于壮苗培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天得到健壮苗，其中壮苗培养基的配方为：MS、粉状活性炭0.5-1.5g/L、6-BA 0.1-0.5mg/L、IBA0.1-0.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整壮苗培养基的pH值为5.8；
G、生根培养：将健壮苗置于生根培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天得到带根幼苗，其中生根培养基的配方为：1/2MS、粉状活性炭0.1-0.5g/L、IBA0.5-1.5mg/L和NAA0.5-1.5mg/L、琼脂4.5g/L和蔗糖25g/L，调整生根培养基的pH值为5.8；
H、炼苗与移栽。
2.如权利要求1所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，炼苗与移栽具体是指将带根幼苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为25-27℃下，放置7天，然后打开瓶盖，炼苗3-4天，取出，洗净根部培养基，移栽到由腐殖土、蛭石和椰糠按体积比为3:1:1混合组成的基质中，移栽后7-10天覆盖塑料薄膜，再覆盖一层报纸，控制遮光率为60％-70％，空气湿度85％-90％。
3.如权利要求2所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在外植体诱导培养之前，将外植体置于浸泡液中，在4℃黑暗条件下超声波处理4-5h，超声功率为300W，所述浸泡液的配方为：维生素C 1.2-1.6g/L、芸香苷0.5-0.7g/L、聚乙烯吡咯烷酮0.7-0.9g/L、活性炭1.2-1.4g/L、咖啡碱0.1-0.3g/L、木犀草素1.6-1.8g/L和石决明粉100-120mg/L。
4.如权利要求3所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在步骤B中用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.0cm-2.0cm的正方形叶块之前，以及步骤D中将第二愈伤组织用刀片切成2.0cm的正方形叶块接种到分化培养基前，将刀片两侧涂抹0.5-1mm厚的凝胶剂，所述凝胶剂由以重量份计的如下原料制成：魔芋精粉10-12份、蜂蜜4-5份、杨梅素0.15-0.18份、迷迭香酸0.36-0.42份、竹醋液1.3-1.5份、木耳多糖4-8份和磁化水100份。
5.如权利要求1所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述消毒处理在指将黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片用1％洗洁精水溶液浸泡5-10min，线状自来水冲洗10-15min，无菌水润洗一次，再用添加了2-3滴吐温-20的150mL质量分数为0.1％的升汞浸泡6-8min，无菌水冲洗3-5次，得无菌外植体。
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