CN111642398A - 一种植物组培苗内生菌的控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物组培苗内生菌的控制方法，具体包括以下步骤：(1)采取外植体，备用；(2)外植体表面消毒：将采取的外植体用自来水冲洗2小时后，依次采用酒精、渗透性消毒剂A溶液和HgCl浸泡消毒；(3)外植体接种和诱导培养：配制外植体诱导培养基，配制完成后加入杀菌剂，将外植体接入消毒好的具有外植体诱导培养基的培养基瓶内，在有光照的条件下在无菌培养室内进行诱导生长点培养出小苗；(4)继代培养：待新生小苗生长到3cm以上高度时，再使用步骤(3)中外植体诱导培养基，进行二代继代培养；(5)无内生菌组培苗的获得：经过二代培养后，选取生长健壮、无任何细菌真菌污染组培苗即为无内生菌种苗。

Description

一种植物组培苗内生菌的控制方法

技术领域

本发明涉及植物组培过程中的细菌控制方法，具体涉及一种植物组培苗内生菌的控制方法。

背景技术

组培技术是解决农作物脱毒复壮和快繁苗生产最主要的技术。植物内生细菌是生活于健康植物各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，由于内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，会随着外植体带入培养过程，在组培过程中不断出现明显的或不明显的细菌菌落，在部分植物组培时会造成培养基大面积污染，导致培养失败。因而控制内生菌的方法成为部分植物组培成功的关键。

为了控制内生菌对组培过程的污染进行了很多的研究，一般采取以下几种方法：1、对外植体进行无菌培养一段时间或进行喷施杀菌剂，然后采取外植体，这样会大幅度减少外植体含有的内生菌的数量，减低组培苗污染的几率。但这一方法比较麻烦且很难消除内生菌污染的可能；2、在培养基中加入抗生素或杀菌剂，但目前效果也不很理想。原因是抗生素只能抑制部分细菌的生长，而且易高温分解，需高温消毒后加入，工序复杂，并且长期使用会产生耐药性，效果也很难把污染降低到理想状态。

因此找到一种简单易行，能够很好控制内生菌污染，同时不影响组培苗生长的的植物组培苗内生菌的控制方法，对于发展组培苗产业具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够控制内生菌对组培过程的污染的植物组培苗内生菌的控制方法。

为解决以上问题，本发明采用的技术方案是：该植物组培苗内生菌的控制方法，具体包括以下步骤：

(1)采取外植体：在晴朗干燥的天气下，气温在15-25℃，相对湿度低于60％，采取外植体备用；

(2)外植体表面消毒：将采取的所述外植体依次进行酒精消毒、渗透性消毒剂A溶液浸泡消毒和氯化汞消毒浸泡消毒；

(3)外植体接种和诱导组培苗：配制外植体诱导培养基，将所述步骤(2)消毒好的所述外植体接入具有经杀菌剂杀菌且消毒后的所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，在无菌培养室内在光照条件下进行诱导培养；

(4)继代培养：再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行二代继代培养；(5)无内生菌组培苗的获得：经过二代继代培养后，选取生长健壮无任何细菌真菌污染组培苗即为无内生菌种苗。

采用上述技术方案，首先进行外植体的采取，在春秋两季待培养植物生长萌发的季节，选择晴朗干燥的天气采取外植体，获得外植体后采用上述方法对外植体进行组织培养，首先在依次采用75％酒精溶液、新型的具有强力渗透性的渗透性消毒剂A溶液和氯化汞溶液进行浸泡消毒，这种新型杀菌剂(由桂林宏光生物科技有限公司出品的菌杀光溶液和上海万孚生物技术有限公司出品的无毒级杀菌消毒剂：TM配制而成)能够渗透入外植体内细胞间长时间作用，对微生物细胞壁具有强力穿透和吸附作用，从而抑制和杀死细胞间的内生菌；同时，在外植体培养基(MS₀)中加入耐高温自配杀菌剂(采用生物抑菌剂B和化学杀菌剂C，按比例混合，然后加入外植体诱导培养基内，其在外植体诱导培养基内浓度为1.0ml/L)进行连续二代的继代培养；获得的组培苗出现的内生菌污染率可降低到1％以下，在草莓、大蒜、红薯、南天竹的组培过程中种苗的污染率在0.5～1％之间，基本上解决了内生菌的污染，并且没有产生任何对组培苗生长的负面作用，作为种源进行扩繁时(即使不添加杀菌剂)，也没有再出现内生菌污染；本发明主要集成了三种新型杀菌剂一定浓度的组合，具有高渗透的、连续的、长作用时间、大覆盖的杀灭内生菌的能力，形成了一整套可靠的控制组培苗内生菌的方法，在外植体培养的不同阶段(外植体消毒阶段和组培阶段)，通过杀菌剂A强大的渗透力和吸附力，长时间作用杀死细胞内和细胞间的内生菌。通过连续在添加自配杀菌剂培养基上培养二代，长时间、针对性的杀死或抑制外植体内的内生菌，并同时严格筛选生长健康无污染的组培苗，最终获得无内生菌的组培苗，以此为种苗进行组培苗的快繁，内生菌污染率能够长期保持在1％以下；本发明是从外植体消毒开始到组培繁殖，采用一整套组合杀菌抑菌方法(鸡尾酒法)，控制了内生菌的污染。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中，将采取的所述外植体在自来水流水冲洗2小时，然后用无菌水漂洗2遍，再放入75％酒精中浸泡1分钟，然后取出用无菌水漂洗4遍；再将所述外植体投入到事先配置好的渗透性消毒剂A溶液内，浸泡20分钟，取出用无菌水漂洗4遍；再投入浓度为0.1％的HgCl消毒溶液内浸泡30分钟，再使用无菌水漂水漂洗6遍。其中0.1％的HgCl消毒溶液配制方法：称取0.1克的HgCl定容在1升的蒸馏水中配制而成。这一步骤是在常用消毒方法中增加一道渗透性消毒，将消毒剂A渗透到外植体内部，起到杀菌作用；通过杀菌剂A强大的渗透力和吸附力，长时间作用杀死细胞内和细胞间的内生菌。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中渗透性消毒剂A溶液的配置方法为：取500ml的无菌水倒入烧杯，分别加入化学杀菌剂C溶液1ml和MT药剂一片溶解后即配制完成。其中化学杀菌剂C桂林宏光生物科技有限公司生产的菌杀光溶液，MT药剂为上海万孚生物技术有限公司出产的。

本发明进一步改进在于，所述步骤(3)中的所述外植体诱导培养基为无激素培养基MS0，配置所述外植体诱导培养基后再加入所述杀菌剂搅拌均匀，然后将所述外植体诱导培养基灌装培养瓶，后放入高压消毒锅内118～121℃消毒19～21分钟。外植体诱导培养基采用现有技术的常规方法配置而成，配置后加入所述杀菌剂经高温消毒完成，所述杀菌剂含有二种不同性质的杀菌药剂可以杀死或抑制绝大部分的内生菌，同时不易产生抗药性。

作为本发明的优选技术方案，所述杀菌剂的配置方法为：采用生物抑菌剂B和化学杀菌剂C，按1:1～2混合，然后加入到所述配制好的外植体诱导培养基，所述杀菌剂在所述外植体诱导培养基内浓度为0.8～1.2ml/L。其中生物抑菌剂B为山东智科生物科技有限公司出品的组培抗菌剂(III型)；化学杀菌剂C为桂林宏光生物科技有限公司出品的菌杀光；二种不同的杀菌剂可以杀死或抑制绝大部分的内生菌，同时不易产生抗药性。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)采取外植体前先将植物移栽到花盆里，放在温室内生长，并喷施500倍的多菌灵杀菌剂(内吸广谱性杀菌剂)。这样可以大幅度降低表面微生物和植物内生菌的数量。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(4)中，连续二代继代培养过程中，若发现受污染的组培苗则立刻将受污染的组培苗从无菌培养室除去。一般污染率都低于1％。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(4)中，待生长点芽生长到3cm以上高度时，再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行连续二代继代培养。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)中所述外植体为大蒜或草莓或红署或南天竹，采取所述外植体的方法为：将已消毒的大蒜或草莓或红薯或南天竹，用火焰消毒过的刀片或剪刀或镊子，在无菌的环境下，将生长点以下1cm处切下，带有生长点的茎段即为外植体。本方法在大蒜、草莓、红薯、南天竹等植物组培上运用效果明显，尤其在内生菌发生严重的南天竹快繁过程中(内生菌发生率80％)，效果卓著，细菌性内生菌的污染率将至0.5％。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中将所述外植体接入消毒好的具有所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，在室温24～26℃条件下，2000～2500Lux，光照强度12～16小时/天，在无菌培养室进行诱导培养无菌苗，培养周期为25-35天。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、操作简单，只要在外植体消毒时增加一道30分钟的消毒过程即可，同时在配制培养基过程中添加(由二种新型杀菌剂B和C按比例配置)自配而成的杀菌剂；2、培养过程同常规的组培过程，不增加新的工作量；3、控制内生菌的效果十分显著，内生菌的发生率低于1％，并通过淘汰，实现内生菌的基本控制；4、成本低，由于杀菌剂的用量很少，因采购杀菌剂和增加工作量的成本可以忽略不计。

附图说明

图1是本发明的培养无内生菌组培苗方法的流程图。

具体实施方法

实施例1：如图1所示，该植物组培苗内生菌的控制方法，具体包括以下步骤：

(1)采取外植体：在春秋两季晴朗干燥的天气下，气温在15～25℃，相对湿度低于60％，所述外植体为大蒜，采取外植体前先将植物移栽到花盆里，放在温室内(温度控制在25℃以上)生长，并喷施广谱性杀菌剂，初步降低表面微生物和植物内生菌的数量；采取所述外植体的方法为：将已喷施过50％多菌灵可湿性粉剂300倍；溶液消毒的大蒜苗在自来水中冲洗2小时，用无菌刀，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片，将生长点以下0.5～1cm处切断成带生长点的外植体，备用；

(2)外植体表面消毒：将采取的所述外植体依次进行酒精消毒和采用渗透性消毒剂A溶液对所述外植体进行浸泡消毒；所述步骤(2)中，将采取的所述外植体在自来水流水冲洗2小时，然后用无菌水漂洗2遍，再放入75％酒精中浸泡1分钟，然后取出用无菌水漂洗4遍；再将所述外植体投入到事先配置好的渗透性消毒剂A溶液内，浸泡20分钟，取出用无菌水漂洗4遍；这一步骤是将消毒剂A渗透到外植体内部，起到杀菌作用；通过杀菌剂A强大的渗透力和吸附力，长时间作用杀死细胞内和细胞间的内生菌；

所述步骤(2)中渗透性消毒剂A溶液的配置方法为：取500ml的无菌水倒入烧杯，分别加入化学杀菌剂C(桂林宏光生物科技有限公司菌杀光)溶液1ml和上海万孚生物技术有限公司出产的MT药剂一片溶解后配制而成；

(3)外植体接种和诱导组培苗：配制外植体诱导培养基，将所述步骤(2)消毒好的所述外植体接入具有经杀菌剂杀菌且消毒后的所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，每瓶接入6株；在有光照的条件下在无菌培养室内进行诱导培养生长芽；诱导培养条件为：室温25℃，2500Lux光照强度12小时/天；所述步骤(3)中外植体诱导培养基为无激素培养基MS0，配制完成后再加入杀菌剂搅拌均匀，然后将所述外植体诱导培养基灌装培养瓶后放入高压消毒锅内118～121℃消毒19～21分钟；外植体在诱导培养基生长过程中加入的杀菌剂不断杀灭残留在外植体内的微生物，二种不同性质的杀菌剂可以杀死或抑制绝大部分的内生菌，同时不易产生抗药性；

(4)所述杀菌剂的配置方法为：采用生物抑菌剂B和化学杀菌剂C，按1:1混合，然后加入所述外植体诱导培养基，所述杀菌剂在所述外植体诱导培养基内浓度为1.0ml/L。其中生物抑菌剂B为山东智科生物科技有限公司出品的组培抗菌剂(III型)；化学杀菌剂C为桂林宏光生物科技有限公司出品的菌杀光；

(4)继代培养：待外植体苗生长到3cm以上高度时，再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行二代继代培养；在连续二代继代培养过程中，若发现受污染的组培苗则立刻将受污染的组培苗从无菌培养室除去；一般污染率低于1％；

(5)无内生菌组培苗的获得：经过二代继代培养后，选取生长健壮(即株高在3cm以上，3张以上叶片且平展)、无任何细菌真菌污染组培苗即为无内生菌种苗。

实施例2：该植物组培苗内生菌的控制方法，具体包括以下步骤：

(1)采取外植体：在春秋两季的晴朗干燥的天气，气温在15-25℃，相对湿度低于60％，采取外植体，所述外植体为红薯，先将红薯块根先将植物移栽到花盆里，放在温室内25℃以上环境生长，并喷施广谱性杀菌剂，初步降低表面微生物和植物内生菌的数量，采取外植体的方法为：将已消毒的红薯块根上的红薯小苗，用无菌刀或剪刀或镊子，在无菌的环境下，在生长点以下0.5-1cm处切下，带有生长点的茎段即为外植体，备用；

(2)外植体表面消毒：将采取的所述外植体在自来水流水冲洗2小时，然后用无菌水漂洗2遍，再放入75％酒精中浸泡1分钟，然后取出用无菌水漂洗4遍；再将所述外植体投入到事先配置好的渗透性消毒剂A溶液内，浸泡20分钟，取出用无菌水漂洗4遍；再投入浓度为0.1％的HgCl消毒溶液(配制方法：称取0.1克的HgCl定容在1升的蒸馏水中配制而成)内浸泡20分钟，再使用无菌水漂水漂洗6遍；这一步骤是将消毒剂A渗透到外植体内部，起到杀菌作用；通过杀菌剂A强大的渗透力和吸附力，长时间作用杀死细胞内和细胞间的内生菌。

所述步骤(2)中渗透性消毒剂A溶液的配置方法为：取500ml的无菌水倒入烧杯，分别加入化学杀菌剂C(桂林宏光生物科技有限公司菌杀光)溶液1ml和上海万孚生物技术有限公司出产的MT药剂一片溶解后配制而成；

(3)外植体接种和诱导组培苗：配制外植体诱导培养基，将所述步骤(2)消毒好的所述外植体接入具有经杀菌剂杀菌且消毒后的所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，每瓶接入4株；在有光照的条件下在无菌培养室内进行诱导培养外植体苗；诱导培养条件为：室温28℃，2500Lux光照强度14小时/天，所述步骤(3)中外植体诱导培养基为无激素培养基MS0，配制完成后再加入杀菌剂搅拌均匀，然后将所述外植体诱导培养基灌装培养瓶后放入高压消毒锅内118～121℃消毒19～21分钟；外植体在诱导培养基生长过程中杀菌剂不断杀灭残留在外植体内的微生物，二种不同性质的杀菌剂可以杀死或抑制绝大部分的内生菌，同时不易产生抗药性。

(4)所述杀菌剂的配置方法为：采用生物抑菌剂B和化学杀菌剂C，按1:1混合，然后加入所述外植体诱导培养基，所述杀菌剂在所述外植体诱导培养基内浓度为1.0ml/L。其中生物抑菌剂B为山东智科生物科技有限公司出品的组培抗菌剂(III型)；化学杀菌剂C为桂林宏光生物科技有限公司出品的菌杀光；

(5)继代培养：待外植体苗生长到3cm以上高度时，再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行二代继代培养；在连续二代继代培养过程中，若发现受污染的组培苗则立刻将受污染的组培苗从无菌培养室除去；一般污染率低于1％；

(6)无内生菌组培苗的获得：经过二代继代培养后，选取生长健壮(即株高在3cm以上，3张以上叶片且平展)、无任何细菌真菌污染组培苗即为无内生菌红薯种苗。

实施例3：南天竹组培苗内生菌的控制方法，具体包括以下步骤：

(1)采取外植体：在春秋两季的晴朗干燥的天气，气温在15-25℃，相对湿度低于60％，采取外植体，所述外植体为南天竹，先将南天竹移栽到花盆里，放在温室内25℃以上环境生长，并喷施广谱性杀菌剂多菌灵，初步降低表面微生物和植物内生菌的数量；在春秋两季的晴朗干燥的天气采取外植体，采取外植体的方法为：将南天竹嫩芽切下，芽段长度在1～2cm，带有生长点的芽段即为外植体；备用；

所述步骤(1)中所述外植体的方法为：

(2)外植体表面消毒：将采取的所述外植体在自来水流水冲洗2小时，然后用无菌水漂洗2遍，再放入75％酒精中浸泡1分钟，然后取出用无菌水漂洗4遍；再将所述外植体投入到事先配置好的渗透性消毒剂A溶液内，浸泡20分钟，取出用无菌水漂洗4遍；再投入浓度为0.1％的HgCl消毒溶液(配制方法：称取0.1克的HgCl定容在1升的蒸馏水中配制而成)内浸泡30分钟，再使用无菌水漂水漂洗6遍；这一步骤是将消毒剂A渗透到外植体内部，起到杀菌作用；通过杀菌剂A强大的渗透力和吸附力，长时间作用杀死细胞内和细胞间的内生菌。

所述步骤(2)中渗透性消毒剂A溶液的配置方法为：取500ml的无菌水倒入烧杯，分别加入化学杀菌剂C(桂林宏光生物科技有限公司菌杀光)溶液1ml和上海万孚生物技术有限公司出产的MT药剂一片溶解后配制而成；

(5)外植体接种和诱导组培苗：配制外植体诱导培养基，将所述步骤(2)消毒好的所述外植体接入具有经杀菌剂杀菌且消毒后的所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，每瓶接入3株，在有光照的条件下在无菌培养室内进行诱导培养外植体苗；诱导培养条件为：室温24℃，2500Lux光照强度16小时/天，所述步骤(3)中外植体诱导培养基为无激素培养基MS0，配制完成后再加入杀菌剂搅拌均匀，然后将所述外植体诱导培养基灌装培养瓶后放入高压消毒锅内118～121℃消毒19～21分钟；外植体在诱导培养基生长过程中加入的杀菌剂不断杀灭残留在外植体内的微生物，二种不同性质的杀菌剂可以杀死或抑制绝大部分的内生菌，同时不易产生抗药性；

(6)所述杀菌剂的配置方法为：采用生物抑菌剂B和化学杀菌剂C，按1:2混合，然后加入所述外植体诱导培养基，所述杀菌剂在所述外植体诱导培养基内浓度为1.2ml/L；其中生物抑菌剂B为山东智科生物科技有限公司出品的组培抗菌剂(III型)；化学杀菌剂C为桂林宏光生物科技有限公司出品的菌杀光；

(5)继代培养：待外植体苗生长到3cm以上高度时，再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行二代继代培养；在连续二代继代培养过程中，若发现受污染的组培苗则立刻将受污染的组培苗从无菌培养室除去；一般霉菌和内生细菌污染率都可以控制在1％以下；

(6)无内生菌组培苗的获得：经过二代继代培养后，选取生长健壮(即株高在3cm以上，3张以上叶片且平展)、无任何细菌真菌污染组培苗即为无内生菌南天竹种苗。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)采取外植体：在晴朗干燥的天气，气温在15～25℃，相对湿度低于60％，采取外植体备用；

(2)外植体表面消毒：将采取的所述外植体依次进行酒精消毒、渗透性消毒剂A溶液浸泡消毒和氯化汞消毒浸泡消毒；

(3)外植体接种和诱导组培苗：配制外植体诱导培养基，将所述步骤(2)消毒好的所述外植体接入具有经杀菌剂杀菌且消毒后的所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，在无菌培养室内有光照的条件下进行诱导培养；

(4)继代培养：再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行二代继代培养；

(5)无内生菌组培苗的获得：经过二代继代培养后，选取生长健壮、无任何细菌真菌污染组培苗即为无内生菌种苗。

2.根据权利要求1所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将采取的所述外植体在自来水流水冲洗2小时，然后用无菌水漂洗2遍，再放入75％酒精中浸泡1分钟，然后取出用无菌水漂洗4遍；再将所述外植体投入到配置好的所述渗透性消毒剂A溶液内，浸泡20分钟，取出用无菌水漂洗4遍；再投入浓度为0.1％的HgCl消毒溶液内浸泡30分钟，再使用无菌水漂水漂洗6遍。

3.根据权利要求2所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述渗透性消毒剂A溶液的配置方法为：取500ml的无菌水倒入烧杯，分别加入化学杀菌剂C溶液1ml和MT药剂一片溶解后即配制完成。

4.根据权利要求1所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(3)中的所述外植体诱导培养基为无激素培养基MS0，配置所述外植体诱导培养基后再加入杀菌剂搅拌均匀，然后将所述外植体诱导培养基灌装培养瓶，每瓶接入3～6株，后放入高压消毒锅内118～121℃消毒19～21分钟。

5.根据权利要求4所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述杀菌剂的配置方法为：采用生物抑菌剂B和化学杀菌剂C，按1:1～2混合，然后加入所述外植体诱导培养基，所述杀菌剂在所述外植体诱导培养基内浓度为0.8～1.2ml/L。

6.根据权利要求1所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(1)采取外植体前先将植物移栽到花盆里，放在温室内，温度控制在20～35℃生长，并在取外植体前一周喷施多菌灵50％可湿性粉剂300～500倍稀释液。

7.根据权利要求1所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(4)中，连续二代继代培养过程中，若发现受污染的组培苗则立刻将受污染的组培苗从无菌培养室除去。

8.根据权利要求1所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(4)中，待带有生长点的芽段长到3cm以上高度时，再使用步骤(3)中所述外植体诱导培养基，进行连续二代继代培养。

9.根据权利要求1所属的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述外植体为大蒜或草莓或红薯或南天竹，采取所述外植体的方法为：将已消毒的大蒜或草莓或红薯或南天竹，用火焰消毒过的刀片或剪刀或镊子，在无菌的环境下，将生长点以下1cm处切下，带有生长点的茎段即为外植体。

10.根据权利要求1所述的植物组培苗内生菌的控制方法，其特征在于，所述步骤(3)中将所述外植体接入消毒好的具有所述外植体诱导培养基的培养基瓶内，在室温24～26℃条件下，2000～2500Lux光照强度，光照时间为12-16小时/天的无菌培养室进行诱导培养不定芽，培养周期为25-35天。

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