CN101138317A - 组织内带菌外植体消毒的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组织内带菌外植体消毒的处理方法。其处理方法是外植体的植物材料经通用处理后将外植体边缘因消毒变色的部分剪下，后剪成1～3cm大小的小块待用，其特征在于：将经上述处理的外植体分别接种在含各种不同浓度及种类的抗生素培养基上，每个三角瓶中接种8～10块，其中每块外植体的边缘都要与培养基相接触，接种后放入培养室中培养。本发明方法操作简单，在培养基中加入的羧苄青霉素、硫酸链霉素和制霉菌素三种抗生素对外植体消毒处理效果非常明显，不但对细菌起到很好的抑制作用(500+100+1000mg/l时达到100％)，同时也能基本控制真菌的生长。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其是一种组织内带菌外植体消毒的处理方法。
背景技术
组织培养是在无菌条件下，把与母树分离的植物器官(根、茎、叶等)、组织、细胞及原生质体放在人工配制的培养基中，在人工控制的条件下，培养成大量完整的新植株，从母体上截取的用于培养的那部分称为外植体。组织培养有以下优点：(1)培养条件可以人为控制。组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响；且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周期培养生产。(2)生长周期短，繁殖率高。植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快；另外，由于植株比较小，往往20～30d为一个周期，所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。(3)管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产，它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
在植物组织培养过程中，外植体的消毒处理是组培成功与否的关键步骤。一般情况下，植物组织中很少有微生物存在，若取其为外植体时，只对它的表面进行常规的消毒处理后，可直接用于组织培养。但在有些植物材料中其组织内往往存在一些微生物，这些微生物或者是植物所感染的各类病害，或者是与植物以共生或寄生的形式存在。对于这些生存于植物组织内部(在植物组织间隙或植物细胞中)的微生物，如果采用常规的消毒处理，往往不能达到外植体消毒的目的；有些菌类虽然暂时没有在组培的初期生长起来，但随着培养时间的加长，植物组织内部的细菌和真菌就会出现，从而使组培无法进行。因此对于这些组织内部带菌的外植体进行有效的消毒处理，可以使组培得以顺利的进行，尤其对于那些无法取到组织内部无菌的外植体和只有少量可取的组织内部带菌外植体的珍贵植物材料更为重要。因此需要找到一种简单的对组织内带菌的外植体进行有效消毒处理的方法，且不影响外植体的生长，使组织培养得以顺利进行。
发明内容
本发明是克服现有技术的不足，提供一种工艺简单，可对组织内带菌的外植体进行有效消毒的处理方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
该组织内带菌外植体消毒的处理方法是
(1).把取作外植体的植物材料剪成小段或小片，用70％左右的酒精浸湿15～45s，取出后再采用含有效氯2.8％的次氯酸钠水溶液进行消毒10～20min；
(2).用无菌水冲洗3～5次，将外植体边缘因消毒变色的部分剪下，然后剪成1～3cm的小块待用；
(3).将经上述处理的外植体小块分别接种在抗生素培养基上，每个三角瓶中接种8～10块，其中每块外植体的边缘都要与培养基相接触，接种后即可放入培养室中进行植株培养。
而且，所述的抗生素组成成分及其浓度为：
羧苄青霉素：250～1000mg/L
硫酸链霉素：50～200mg/L；
制霉菌素：550～2200mg/L；
而且，所述的抗生素培养基为在MS培养基中附加蔗糖30g、琼脂粉6.5g、肌醇0.1g，调PH值为6.2，然后分装在500mL广口三角瓶中，高温灭菌20min左右。
而且，所述的抗生素用0.2μm的微孔过滤器进行抽滤灭菌。
而且，所述的接种后植株培养条件为28℃、24h光照、光强2000lx，培养1周后观察记录生长状况，同时进行继代培养。
本发明的优点和有益效果是：
1.本发明方法操作简单，可对组织内带菌的外植体进行有效消毒处理，且不影响外植体的生长，使组织培养得以顺利进行。
2.培养基中加入羧苄青霉素和硫酸链霉素的抑制细菌的效果非常明显，且在低浓度(250mg/L+50mg/L)时抑制细菌的效果也能达到100％，因此在不对外植体的生长开始造成了不良的影响的情况下，在培养基中加入低浓度的羧苄青霉素和硫酸链霉素，能充分地抑制外植体中的细菌生长。
3.在培养基中中加入的羧苄青霉素、硫酸链霉素和制霉菌素三种抗生素对外植体消毒处理效果非常明显，不但对细菌起到很好的抑制作用(500+100+1000mg/L时达到100％)，同也能基本控制真菌的生长。在不影响外植体正常生长的情况下，在培养基中附加这三种抗生素对外植体消毒处理效果可以达到组织培养的要求。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，但不限于本实施例。
本实施例仅以组织内带菌的红掌外植体的消毒效果为例进行详细阐述：
组织内带菌外植体消毒的处理方法是：
1.取带有细菌病害的巨型红掌的叶片及叶柄，拿剪刀剪成小段或小片，用70％的酒精浸湿30s；取出后再采用含有效氯2.8％的次氯酸钠水溶液进行消毒15min；
2.然后用无菌水冲洗3～5次，将外植体边缘因消毒变色的部分剪下，后剪成2cm大小的小块待用。
3.将经上述消毒后并剪成小块的红掌外植体分别接种在含各种不同浓度及种类的抗生素培养基上，该抗生素培养基的成分为：
在MS培养基中加入BA 2mg/L和NAA 0.1mg/L，并附加蔗糖30g、琼脂粉6.5g、肌醇0.1g，调PH值为6.2，然后分装在500mL广口三角瓶中，高温灭菌20min左右。
所述的抗生素的组成成分及其浓度为：
羧苄青霉素：250～1000mg/L
硫酸链霉素：50～200mg/L；
制霉菌素：550～2200mg/L；
而且，该抗生素需要用0.2μm的微孔过滤器进行抽滤灭菌。
每个三角瓶中接种8～10块，其中每块外植体的边缘(伤口部位)都要与培养基相接触。接种后放入培养室中培养。培养条件为28℃，24h光照，光强2000lx，培养1周后观察记录生长状况，同时进行继代培养。
本发明的消毒方法的处理效果见表1和表2。
表1加入羧苄青霉素与硫酸链霉素两种抗生素对外植体消毒处理效果
Tablel Effects of different concentration of antibiotics in medium on control of endophyticbacteria in explants
| 抗生素浓度concentrationof antibiotics | 接种块数No.of explants | 真菌污染块数No.of ex-plants infectwith fungus | 细菌污染块数No.of ex-plants infectwith bacteria | 污染率infectionfrequency | 生长表现growing show |
| 250+50 | 45 | 40 | 2 | 93.3 | A |
| 500+100 | 61 | 54 | 0 | 88.5 | A |
| 1000+200 | 45 | 38 | 0 | 84.4 | B |
| CK | 27 | 26 | 27 | 100.0 | A |
注：表中“A”代表外植体生长正常，颜色绿色，有生长量；“B”代表外植体生长受到抑制，无生长量，颜色变黄；
CK表示对照组。
从表1可以看出，加入羧苄青霉素与硫酸链霉素两种抗生素的抑制细菌效果非常明显，在低浓度(250+50mg/L)时抑制细菌的效果也很好，但对真菌的抑制作用几乎看不到，即使其浓度增至1000+200mg/L时(此时的浓度对外植体的生长开始造成影响)仍不起作用，这说明羧苄青霉素与硫酸链霉素两种抗生素对真菌造成的外植体的污染没有抑制作用。
表2加入羧苄青霉素、硫酸链霉素和制霉菌素三种抗生素对外植体消毒处理效果
Tablel Effects of different concentration of antibiotics in medium on control of endophyticbacteria in explants
| 抗生素浓度concentrationof antibiotics | 接种块数No.of explants | 真菌污染块数No.of ex-plants infectwith fungus | 细菌污染块数No.of ex-plants infectwith bacteria | 污染率infectionfrequency | 生长表现growing show |
| 250+50+500 | 20 | 7 | 11 | 90.0 | A |
| 500+100+1000 | 20 | 2 | 0 | 10.0 | B |
| 1000+200+2000 | 19 | 0 | 3 | 4.5 | C |
| CK | 27 | 13 | 27 | 100.0 | A |
注：表中“A”代表外植体生长正常，颜色绿色，有生长量；“B”代表外植体生长受到抑制，无生长量，颜色变黄；“C”代表外植体生长完全停止，颜色边黑，并逐渐死亡。
CK表示对照组。
从表2可以看出，加入羧苄青霉素、硫酸链霉素和制霉菌素三种抗生素对外植体消毒处理效果非常明显，不但对细菌起到很好的抑制作用(500+100+1000mg/L时达到100％)，同也能基本控制真菌的生长，在不影响外植体正常生长的情况下，在培养基中附加这三种抗生素对外植体消毒处理效果可以达到组织培养的要求。
Claims (5)
1.一种组织内带菌外植体消毒的处理方法，其特征在于：
(1).把取作外植体的植物材料剪成小段或小片，用70％左右的酒精浸湿15～45s，取出后再采用含有效氯2.8％的次氯酸钠水溶液进行消毒10～20min；
(2).用无菌水冲洗3～5次，将外植体边缘因消毒变色的部分剪下，然后剪成1～3cm的小块待用；
(3).将经上述处理的外植体小块分别接种在抗生素培养基上，每个三角瓶中接种8～10块，其中每块外植体的边缘都要与培养基相接触，接种后即可放入培养室中进行植株培养。
2.根据权利要求1所述的组织内带菌外植体消毒的处理方法，其特征在于：所述的抗生素组成成分及其浓度为：
羧苄青霉素： 250～1000mg/L
硫酸链霉素： 50～200mg/L；
制霉菌素： 550～2200mg/L。
3.根据权利要求1所述的组织内带菌外植体消毒的处理方法，其特征在于：所述的抗生素培养基为在MS培养基中附加蔗糖30g、琼脂粉6.5g、肌醇0.1g，调PH值为6.2，然后分装在500mL广口三角瓶中，高温灭菌20min左右。
4.根据权利要求2所述的组织内带菌外植体消毒的处理方法，其特征在于：所述的抗生素用0.2μm的微孔过滤器进行抽滤灭菌。
5.根据权利要求1所述的组织内带菌外植体消毒的处理方法，其特征在于：所述的接种后植株培养条件为28℃、24h光照、光强20001x，培养1周后观察记录生长状况，同时进行继代培养。
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