CN108496804B - 无刺花椒组织培养初代诱导的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及无刺花椒组织培养初代诱导的方法，包括取外植体，外植体消毒，接种和诱导培养，通过优化取外植体、消毒处理、接种方式及诱导培养基，该方法有效抑制了无刺花椒外植体的内生菌产生，建立了无刺花椒组织培养初代诱导技术体系，对无刺花椒的种苗繁殖具有重要意义。

Description

无刺花椒组织培养初代诱导的方法

技术领域

本发明属于组培领域，具体涉及通过组织培养繁育无刺花椒的方法。

背景技术

目前我国西南地区是青花椒主要栽种地，但存在品种单一、品种退化较为严重、管理采摘成本过高等问题。前期选育到荣昌无刺花椒新品种，为野生竹叶花椒的芽变品种，但该品种种子繁殖出现返祖现象，其性状回复为野生竹叶花椒仍然带刺，导致无刺等优良性状改变；扦插繁殖受制于插条数量和季节限制；嫁接繁殖速度慢，成活率不高；压条效率则较扦插、嫁接效率更低。

基于以上情况，拟通过植物组织培养等方式进行荣昌无刺花椒种苗繁育，实现种苗的规模化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供通过无刺花椒组织培养初代诱导的方法，该方法简单，解决了外植体内生菌污染和褐化现象。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

无刺花椒组织培养初代诱导的方法，包括如下步骤：取外植体，外植体消毒，接种和诱导培养；所述外植体消毒为将枝条剪成带2-3个芽的小段并去掉浸泡到水中变黑的组织，选取靠近顶芽的2-3处茎段作为培养材料；消毒前加入3-5滴吐温-80，再加入体积分数2%的次氯酸钠溶液消毒，盖住盖子后持续振荡消毒3-4min，无菌水清洗4-5次后置于消毒好的接种盘备用；

所述接种为采用将茎段的下端插入到培养基中，腋芽浸没在培养基中，茎段上端暴露在培养基表面外，培养基配方为含 0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、2.0mg/LZT、0.1mg/L植物抑菌剂、6g/L卡拉胶和30 g/L蔗糖的MS培养基；

所述诱导培养为接种后置于光照培养室暗培养3d后，开灯光照培养为12 h /d，培养温度为25±2℃，7-10d后，筛除真菌、细菌污染及褐化，对无污染、无褐化进行转代培养、更换培养基至出芽。

优选的，所述接种方法为采用将茎段的上端插入到培养基中，腋芽浸没于培养基，茎段下端暴露在培养基表面外。

所述取外植体的取材季节为春季，取材时间选择连续晴3天及以上的午后，选择具有母本典型性状、无病虫害的健壮无刺花椒植株为对象，剪取当年新萌发的嫩梢，腋芽尚未萌动的枝条。

本发明的有益效果在于：本发明提供了通过组织培养繁育无刺花椒的方法，通过筛选预处理、消毒处理、接种方式及诱导培养基，有效抑制了无刺花椒外植体的内生菌产生，建立了无刺花椒组织培养初代诱导技术体系，对无刺花椒的种苗繁殖具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为外植体取材。

图2为外植体培养情况（A：外植体培养7d的情况；B：外植体培养10d的情况；C：外植体培养15d的情况；D：外植体培养20d的情况；外植体培养30d的情况）。

图3为外植体萌芽情况。

图4为外植体继代后生长情况。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例的材料来源：用于植物组织培养研发的实验材料为荣昌无刺花椒原生芽变植株的嫁接苗，来源于荣昌区林业局管辖的无刺花椒种苗繁育基地，位于荣昌区广顺街道办事处。

结果：本实施例方法对控制腋芽处的真菌污染有较好效果，但少数芽会出现褐化现象，控制好外植体木质化程度的话，褐化较少，整体获得率达30%左右。

为研究与预处理对结果的影响，分别使用如下三种方法进行预处理，

A．在实验室自来水下轻轻冲洗10min左右，忌损坏芽和叶柄，然后将材料在低浓度洗手液+洗衣粉溶液中浸泡10min左右，转移到自来水下清洗干净捞出沥干，在超净工作台紫外灯（距离15cm左右）下摊开照射30min后进行常规消毒工作；

B．在实验室自来水下轻轻冲洗5min左右，忌损坏芽和叶柄，捞出沥干；在超净工作台紫外灯（距离15cm左右）下摊开照射30min后进行常规消毒工作；

C．在实验室自来水下轻轻冲洗5min左右，忌损坏芽和叶柄，捞出沥干；将枝条剪成带2-3个芽的小段，置于含有20%的植物抑菌剂的MS培养基中摇床培养6-12h。

结果：前期预处理方法A和B，接种到培养基1-9后先暗培养3天才开灯，光照时间12h/d，第三天开始腋芽表现出霉菌，叶柄开始脱落，第3-7天污染最多，污染率达90%以上，都是腋芽长霉。第10天开始腋芽有萌动。两周过后8号培养基长势明显比其它培养基配方有优势，腋芽有明显抽高。但是到20天左右，新芽周围会布满菌丝和霉粉，30d后，外植体全部被真菌霉粉包围，最终导致植株死掉（见图2）。

在长达2年之多的时间里经历了近20次的规模化试验，不论以何种方式预处理，也不论以何种方式进行消毒，接种到不含有PPM的培养基中，最终的结果均以外植体感染真菌而死亡失败。有的外植体甚至萌发出新芽，但在后期的培养过程中仍然避免不了其内生菌的感染，感染部位90%以上来自腋芽处。

接种在含有PPM培养液预处理的实验结果：经过6-12h的振荡培养，然后分别接种到含有PPM和不含PPM的培养基中培养。暗培养3d后转入到光照培养，实际操作中发现，接种后的第2天，几乎全部的外植体褐化，但在后续的培养过程中发现，有相当一部分外植体没有感染病菌，尤其是接种到含有PPM的培养基中，继续培养后外植体全部死亡。

上述结果表明含有使用含或不含PPM培养液预处理无法解决外植体感染病菌和褐化的问题。

外植体消毒处理对结果的影响

预处理完后，在超净工作台上进行消毒处理并接种培养。具体处理方法可分为以下几种：

A．首先将枝条外植体剪成带2-3个芽的小段并去掉浸泡到水中变黑的组织，并把老枝条和顶端的幼嫩芽分开，根据茎段的木质化程度用2%的次氯酸钠溶液消毒6-10min，无菌水清洗4-5次后置于消毒好的接种盘备用。

B．首先将枝条剪成带2-3个芽的小段并去掉浸泡到水中变黑的组织，选取靠近顶芽的2-3处茎段作为培养材料；消毒前加入吐温-80少量，再加入2%的次氯酸钠溶液消毒，盖住盖子后持续振荡消毒3-4min，无菌水清洗4-5次后置于消毒好的接种盘备用；将消毒好的材料在超净工作台上无菌操作，切成1cm左右长带有腋芽的小段接种到准备好的诱导培养基中。

C．特异性的针对上述第3种预处理方法的试验材料。将摇床培养6-12h的外植体取出，直接切成1cm左右长带有腋芽的小段接种到准备好的诱导培养基中。

结果，采用预处理时间过长或消毒时间为6-10min的其中一种方式，接种后均出现大面积的褐化和污染。采用预处理时间5min左右，消毒时间控制在3-4min的处理整体效果较好，即方案B可以较好的防止褐化和污染。

培养基配方设计

消毒处理好的外植体接种在不同配方的培养基中培养，培养基配方设计如表1所示：

表1无刺花椒初代诱导培养基配方

将消毒后的外植体分别置于表1配方中，结果显示配方11新芽萌发率更高。

接种方法

接种于没有添加PPM的培养基中，接种方法为将茎段的下端插入到培养基中，腋芽暴露在培养基表面。每瓶接种1个茎段外植体，接种好后置于光照培养室暗培养3d后，开灯光照培养，培养时间为12/12h，培养温度为25±2℃；

接种于含有PPM的培养基中，接种方法分为以下五种：

a．将茎段的下端插入到培养基中，腋芽暴露在培养基表面外。

b．接种前，先将整个茎段浸没于培养基中，取出后将茎段的下端插入到培养基中，腋芽暴露在培养基表面外。

c．将茎段的下端插入到培养基中，腋芽浸没在培养基中，茎段上端暴露在培养基表面外。

d．按照茎段的上下端，将茎段全部插入到培养基中。

e．将茎段的上端插入到培养基中，腋芽浸没于培养基，茎段下端暴露在培养基表面外。

结果：

a．将茎段的下端插入到培养基中，腋芽暴露在培养基表面外，这种接种方式外植体褐化较少，接种10d左右，污染率几乎达到90%，20d后全部污染，污染部位绝大多数仍然是在腋芽处。

b．接种前，先将整个茎段浸没于培养基中，取出后将茎段的下端插入到培养基中，腋芽暴露在培养基表面外。这种方式外植体褐化较少，污染率较比处理a效果要好。但接种20d后也几乎全部污染，污染速度较慢，表明PPM有一定的抑菌效果，从实际效果来看这种方式成功率仍然为0。

c．将茎段的下端插入到培养基中，腋芽浸没在培养基中，茎段上端暴露在培养基表面外。这种方式外植体褐化较多，整体污染率较好，对控制腋芽处的内生真菌污染有一定的效果，有极少数（2%左右）新芽能萌发且不感染真菌，接种配方为11号配方。

d．将茎段全部插入到培养基中。这种方式的污染率控制很好。但是外植体几乎褐化，部分没有褐化的外植体也很难萌发，最终成功率仍然为0。

e．将茎段的上端插入到培养基中，腋芽浸没于培养基，茎段形态学下端暴露在培养基表面外。这种方式对控制腋芽处的真菌污染有较好效果，但少数芽会出现褐化现象，控制好外植体木质化程度的话，褐化较少，培养7-10d后，将无污染的且无褐化的外植体按照其形态学上下端顺序转接到新的培养基中培养，整体获得率达20%左右，且配方12诱导外植体萌发效果最好（图3）。

因此，可以使用c和e方法，其中e方法效果最优。

（5）培养条件

以上所有接种处理每瓶接种1个茎段外植体，接种好后置于光照培养室暗培养3d后，开灯光照培养为12 h /d，培养温度为25±2℃，7-10d后，检查真菌、细菌污染及褐化情况，视不同情况进行转代培养、更换培养基等方式继续培养。

实施例1

通过组织培养繁育无刺花椒的方法，包括如下步骤：

（1）外植体取材

外植体取材季节以春季为最佳，9月份后不宜再取材培养，取材时间选择连续晴3天及以上的午后，此时外植体携带病菌最少。选择具有母本典型性状、无病虫害的健壮无刺花椒植株为对象，剪取当年新萌发的嫩梢，腋芽尚未萌动的枝条为最好（见图1）。

（2）消毒处理与接种培养

从母本植株上取下来的枝条，立即从叶柄最外端除去叶片，用保鲜膜覆盖，置于冰盒中保温保湿，备用；再将外植体首先将枝条剪成带2-3个芽的小段并去掉浸泡到水中变黑的组织，选取靠近顶芽的2-3处茎段作为培养材料；消毒前加入吐温-80少量，再加入2%的次氯酸钠溶液消毒，盖住盖子后持续振荡消毒3-4min，无菌水清洗4-5次后置于消毒好的接种盘备用；将消毒好的材料在超净工作台上无菌操作，切成1cm左右长带有腋芽的小段接种到准备好的诱导培养基中；接种方法采用将茎段的下端插入到培养基中，腋芽浸没在培养基中，茎段上端暴露在培养基表面外，培养基使用表1中配方11。接种后置于光照培养室暗培养3d后，开灯光照培养为12 h /d，培养温度为25±2℃，7-10d后，检查真菌、细菌污染及褐化情况，视不同情况进行转代培养、更换培养基等方式继续培养。

结果显示：本实施例外植体褐化较多，整体污染率较好，对控制腋芽处的内生真菌污染有一定的效果，有极少数（2%左右）新芽能萌发且不感染真菌，接种配方为11号配方。对新芽进行继代培养，结果如图4所示。

实施例2

按照与实施例1相同的方法，接种的培养基也相同，区别为接种方是采用将茎段的上端插入到培养基中，腋芽浸没于培养基，茎段下端暴露在培养基表面外。

本实施例方法，对控制腋芽处的真菌污染有较好效果，但少数芽会出现褐化现象，控制好外植体木质化程度的话，褐化较少，整体获得率达20%左右（见图3-4）。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.无刺花椒组织培养初代诱导的方法，其特征在于，包括如下步骤：取外植体，外植体消毒，接种和诱导培养；所述外植体消毒为将枝条剪成带2-3个芽的小段并去掉浸泡到水中变黑的组织，选取靠近顶芽的2-3处茎段作为培养材料；消毒前加入3-5滴吐温-80，再加入体积分数2%的次氯酸钠溶液消毒，盖住盖子后持续振荡消毒3-4min，无菌水清洗4-5次后置于消毒好的接种盘备用；

所述接种为采用将茎段的上端插入到培养基中，腋芽浸没于培养基，茎段下端暴露在培养基表面外，培养基配方为添加 0 mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、2.0mg/L ZT、0.1 mg/L植物抑菌剂、6g/L卡拉胶和30 g/L蔗糖的MS培养基；

所述诱导培养为接种后置于光照培养室暗培养3d后，开灯光照培养为12 h /d，培养温度为25±2℃，7-10d后，筛除真菌、细菌污染及褐化，对无污染、无褐化进行转代培养，将茎段的下端插入到培养基中，更换培养基至出芽。

2.根据权利要求1所述无刺花椒组织培养初代诱导的方法，其特征在于：所述取外植体的取材季节为春季，取材时间选择连续晴3天及以上的午后，选择具有母本典型性状、无病虫害的健壮无刺花椒植株为对象，剪取当年新萌发的嫩梢，腋芽尚未萌动的枝条。