CN114009337B - 一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法，包括以下步骤：(1)于腋芽萌动期采集具有7‑8个腋芽的去年生木质化玫瑰枝条，对枝条进行清洗，然后将清洗后的枝条切成长2‑3cm的单腋芽茎段；(2)对步骤(1)的单腋芽茎段进行消毒处理，将萌动期的腋芽杀死；(3)将杀死后的腋芽剥除，再进行接种。用本发明的消毒方法，可以将萌动期的玫瑰腋芽杀死，促使腋芽两侧的2个隐芽萌发生长；本发明不仅可以使腋芽萌动期的外植体污染率降到6.33％，而且一个单腋芽茎段外植体可以得到2个健壮的无菌芽，解决了腋芽萌动期玫瑰茎段外植体无法消毒的难题，并使最难获得玫瑰无菌材料的腋芽萌动期成为全年中获得无菌材料最高效的时间。

Description

一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法。

背景技术

玫瑰(Rosa rugosa)是中国传统名花，也是山东省特色花卉，具有含芳香、抗寒、抗旱、抗病虫害、耐盐碱等优良性状，是一种集观赏、美容、食用、药用、生态防护功能于一身的“多功能”花木。近年来，我国玫瑰产业发展迅速，栽培范围越来越广，栽培面积不断扩大，但存在以下3个亟待解决的问题：一是全国只有40多个玫瑰品种，且多数品种存在芳香成分含量低、花期短、花色单调等问题，需要通过转基因定向育种来实现品种改良；二是目前绝大多数玫瑰品种扦插难生根，只能依靠嫁接繁殖，不仅繁殖效率低，且砧木的根系特性会导致玫瑰耐盐碱、抗旱等多个优良性状减弱或丢失，致使绝大多数玫瑰品种难以在盐碱地区或干旱地区推广应用；三是培育出的玫瑰新品种繁殖材料少，繁殖时间受限，依靠扦插技术和嫁接技术难以快速实现产业化推广。所以，建立起玫瑰组织培养技术体系对于促进玫瑰产业快速健康发展具有重要意义。

可以随时对外植体进行消毒并获得大量无菌材料是建立玫瑰组织培养技术体系的基础。目前，玫瑰组织培养主要是通过对带腋芽茎段进行消毒来获得无菌材料。玫瑰的腋芽为混合芽，一般包括三个发育阶段：(1)冬季休眠期，腋芽(位于去年生木质化枝条上)被褐色芽鳞包被紧实；(2)早春萌动期，腋芽(位于去年生木质化枝条上)萌动并逐渐展叶，芽鳞包裹松动；(3)晚春及夏秋季休眠期，早春萌动的腋芽逐渐发育为枝条，并在当年生枝条叶腋处形成新的腋芽，此腋芽(位于当年生未木质化或半木质化枝条上)被绿色芽鳞包被紧实并处于休眠状态(目前国内外研究者普遍使用的外植体)。

玫瑰带腋芽茎段外植体主要采用乙醇和升汞浸泡的方法消毒。目前国内外研究者均以带晚春休眠期腋芽的当年生半木质化玫瑰茎段为消毒对象，通过调整乙醇和升汞浸泡时间来获得部分无菌材料(王勇刚，2016；李敏等，2016；李雪，2014；徐立军等，2015)。但对于带早春萌动期腋芽的去年生木质化玫瑰茎段，却无法通过乙醇和升汞浸泡来获得无菌材料。因为如果浸泡时间短，无法把外植体表面的各种微生物杀灭，污染率高达80％以上；如果浸泡时间长，乙醇和升汞就会通过松动的芽鳞进入腋芽内部，严重损伤娇嫩的幼芽，致其无法正常生长。所以，国内外研究者都无法采用带萌动期腋芽的玫瑰茎段做外植体，这在很大程度上限制了玫瑰组培相关的生产和科研工作进展。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法。采用本发明的消毒方法，可以将萌动期的玫瑰腋芽杀死，促使腋芽两侧的2个隐芽萌发生长；本发明不仅可以使腋芽萌动期的外植体污染率降到6.33％，而且一个单腋芽茎段外植体可以得到2个健壮的无菌芽，解决了腋芽萌动期玫瑰茎段外植体无法消毒的难题，并使最难获得玫瑰无菌材料的腋芽萌动期成为全年中获得无菌材料最高效的时间。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法，包括以下步骤：

(1)采集具有7-8个腋芽的去年生木质化玫瑰枝条，所述腋芽为处于早春萌动期的腋芽；对枝条进行清洗，然后将清洗后的枝条切成长2-3cm的单腋芽茎段；

(2)对步骤(1)的单腋芽茎段进行消毒处理，将萌动期的腋芽杀死；

(3)将杀死后的腋芽剥除，再进行接种。

优选的，步骤(2)中，所述消毒处理具体为：将步骤(1)的单腋芽茎段先用75％的乙醇浸泡3-5min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗；再用0.1％的升汞浸泡55-65min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗。

更优选的，将步骤(1)的单腋芽茎段先用75％的乙醇浸泡4min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞浸泡60min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

更优选的，所述0.1％的升汞中添加有吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20。

优选的，步骤(3)中，将杀死后的腋芽剥除具体为：将消毒处理后的单腋芽茎段表面多余水分吸干，并将单腋芽茎段的上下端各剪掉1mm，然后将腋芽剥除。

优选的，步骤(3)中，所述接种具体为：将剥除腋芽后的单腋芽茎段的形态学下端朝下接种于MS培养基中，置于温度24±2℃，光照强度2000-3000lx，光照长度14h/d的条件下进行培养。

本发明的第二方面，提供上述消毒方法在增加玫瑰组织培养外植体的壮芽数量中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明以腋芽萌动期的去年生木质化玫瑰茎段作为外植体，拓宽了玫瑰组培外植体的选择。

(2)本发明打破了现有技术固有的外植体消毒处理方法，采用超出常规时间的乙醇和升汞浸泡，极大地降低了外植体污染率。

(3)本发明通过超出常规时间的消毒处理将萌动的腋芽杀死，并于消毒处理后将其剥除，再进行接种，每个单腋芽茎段可以获得2个健壮隐芽。

(4)本发明使最难获得玫瑰无菌材料的腋芽萌动期成为全年中获得无菌材料最高效的时间。

附图说明

图1：消毒后玫瑰腋芽受害状态；图中，A 1级；B 2级；C 3级。

图2：接种后玫瑰隐芽生长状态；图中，A为接种后2周，B为接种后3周。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，外植体消毒是玫瑰组织培养的关键技术。以处于腋芽萌动期的去年生木质化玫瑰茎段作为外植体，如果浸泡时间短，无法把外植体表面的各种微生物杀灭，污染率极高；如果浸泡时间长，乙醇和升汞就会通过松动的芽鳞进入腋芽内部，严重损伤娇嫩的幼芽。因此，现有技术中一般不选择腋芽萌动期的玫瑰茎段作为外植体进行组织培养。

本发明在研究过程中意外发现，玫瑰(包括其他很多植物)萌动的腋芽(主芽)两侧有2个看不见的隐芽(副芽)，如果腋芽(主芽)生长受到抑制，2个隐芽(副芽)就会萌动。如果腋芽(主芽)伤而不死，隐芽(副芽)生长也不健壮；如果腋芽(主芽)完全被杀死，隐芽(副芽)则会健壮生长。

根据这一发现，本发明采用超出常规时间的乙醇和升汞浸泡(乙醇4min、升汞60min)将萌动的腋芽(主芽)完全杀死，并在接种前将其完全剥除，不仅污染率降到了6.33％，而且一个单腋芽茎段外植体得到了2个健壮隐芽。因此，通过大幅度延长消毒时间杀死已萌动的腋芽(主芽)来获取隐芽(副芽)是一种高效的腋芽萌动期玫瑰组培外植体消毒方法。本发明使最难获得玫瑰无菌材料的腋芽萌动期成为全年中获得无菌材料最高效的时间，也可为其他植物的组培外植体取材提供一定参考，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

本发明所使用的玫瑰材料为种植于山东农业大学玫瑰种质资源圃的‘紫枝’玫瑰品种。

实施例1：腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法

(1)取材：于腋芽萌动期(山东省泰安市一般为2月底-3月中旬)采集玫瑰生长健壮、无病虫害，且具有7～8个腋芽的去年生木质化枝条；所述腋芽均为处于早春萌动期的腋芽。

(2)清洗：首先用牙刷蘸取洗洁精，将枝条和腋芽，尤其是茎芽连接处的缝隙刷洗干净。然后将枝条切为长2-3cm的单腋芽茎段，并流水冲洗1h。

(3)将清洗完的单腋芽茎段置于超净工作台上的培养皿里，先用75％的乙醇浸泡4min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡60min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

(4)消毒后先用无菌滤纸将单腋芽茎段表面多余水分吸干，并将单腋芽茎段上下端各剪掉1mm，然后将单腋芽茎段的腋芽剥除，将其作为外植体进行接种培养。

对比例1：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡1min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡10min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例2：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡1min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡30min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例3：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡1min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡60min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例4：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡2min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡10min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例5：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡2min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡30min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例6：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡2min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡60min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例7：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡4min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡10min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例8：

将实施例1的步骤(3)的消毒方法调整为：先用75％的乙醇浸泡4min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞(添加吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200μl吐温-20)浸泡30min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍。

对比例9：

将实施例1的步骤(2)的消毒方法调整为：首先将萌动的腋芽剥除，然后用牙刷蘸取洗洁精，将枝条刷洗干净。最后将枝条切为长2-3cm的单腋芽茎段，并流水冲洗1h。

对比例10：

将实施例1的步骤(4)调整为：消毒后先用无菌滤纸将单腋芽茎段表面多余水分吸干，并将单腋芽茎段上下端各剪掉1mm，将其作为外植体进行接种培养。

试验例1：不同消毒方案对外植体的影响

1、试验方法：

分别将实施例1、对比例1-对比例8处理后的茎段作为外植体进行接种，将茎段的形态学下端朝下接种于MS培养基中，置于温度24±2℃，光照强度2000-3000lx，每天光照14h的培养条件下进行培养。每瓶接种4个茎段，每处理接种5瓶，重复3次，15d后统计污染率(污染的外植体数量/接种的外植体数量×100％)和腋芽受害级别。

2、试验结果：

试验结果见表1和图1。

表1：不同消毒方案对外植体的影响

组别	污染率(％)	主芽受害级别
			对比例1	100.0±0.00A	1级
对比例2	81.17±4.78C	1级
			对比例3	38.67±2.89D	3级
对比例4	91.17±3.43AB	1级
			对比例5	45.83±4.16CD	2级
对比例6	15.67±1.81D	3级
			对比例7	78.67±4.53B	2级
对比例8	25.50±3.16DE	3级
			实施例1	6.33±0.58E	3级

注：DuncanA-1显著性检验，不同字母表示在0.01水平下差异显著；1级：腋芽受伤程度小，生长稍变缓，可以成苗；2级：腋芽受伤程度大，生长缓慢，难以成苗；3级：腋芽完全被杀死。

结果表明：经不同消毒方案处理过的外植体受到了不同程度的伤害，其中经对比例1、对比例2和对比例4消毒方案处理过的外植体腋芽受害级别为1级(图1-A)，生长稍变缓，可以成苗，但外植体污染率高达80％以上；经对比例5和对比例7消毒方案处理过的外植体腋芽受害级别为2级(图1-B)，生长缓慢，难以成苗，且外植体污染率高达45％以上；经对比例3、对比例6、对比例8和实施例1消毒方案处理过的外植体腋芽受害级别为3级(图1-C)，完全被杀死，但外植体污染率低，特别是经实施例1消毒方案处理的外植体污染率只有6.33％，且1w后在被杀死的腋芽两侧各萌发出1个隐芽，并快速萌动生长；所以，经实施例1消毒方案(75％乙醇4min+0.1％升汞60min)处理过的腋芽萌动期外植体污染率最低，且每个外植体可以得到2个健壮隐芽。

试验例2：不同主芽剥除方式对外植体的影响

1、试验方法：

将实施例1处理后的茎段外植体(消毒后剥除腋芽)记为Bh，将对比例9处理后的茎段外植体(消毒前剥除腋芽)记为Bq，以对比例10处理后的茎段外植体(未剥除腋芽)作为对照，记为CK。

将实施例1、对比例9和对比例10处理后的茎段外植体的形态学下端朝下接种于MS培养基中，置于温度24±2℃，光照强度2000-3000lx，每天光照14h的培养条件下进行培养。观察接种后玫瑰隐芽的萌发和生长状态，并分别于接种2W后和3W后统计隐芽萌发率和隐芽长度。

2、试验结果：

试验结果见表2和图2。

表2：不同腋芽剥除方式对外植体的影响

注：隐芽萌发率＝萌芽数/茎段数。

结果表明：经不同腋芽剥除方式处理过的外植体隐芽萌发率和隐芽生长速度不同。其中，未剥除腋芽茎段(CK)和消毒后剥除腋芽茎段(Bh)的隐芽萌发率均为200％，即每个茎段均可以萌发2个隐芽，而且消毒后剥除腋芽茎段(Bh)的隐芽生长速度显著快于未剥除腋芽茎段(CK)。另外，消毒前剥除腋芽茎段(Bq)的隐芽萌发率仅有72.43％，即有的隐芽不萌动，可能是消毒剂从芽剥除后产生的伤口处渗入茎段内部伤害了隐芽。但其生长速度与未剥除腋芽茎段(CK)相比却差异不显著，可能是由隐芽数量少，养分充足而导致的。所以，消毒后剥除腋芽(Bh)的隐芽萌发率最高，且生长速度最快。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种腋芽萌动期玫瑰组培外植体的消毒方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集具有7-8个腋芽的去年生木质化玫瑰枝条，所述腋芽为处于早春萌动期的腋芽；对枝条进行清洗，然后将清洗后的枝条切成长2-3cm的单腋芽茎段；

(2)对步骤(1)的单腋芽茎段进行消毒处理，将萌动期的腋芽杀死；

(3)将杀死后的腋芽剥除，再进行接种；

步骤(2)中，所述消毒处理具体为：将步骤(1)的单腋芽茎段先用75％的乙醇浸泡4min，将浸泡后的单腋芽茎段取出后用无菌水冲洗3遍；再用0.1％的升汞浸泡60min，浸泡后将单腋芽茎段取出再用无菌水冲洗5遍；

所述0.1％的升汞中添加有吐温-20，吐温-20的添加量为每100ml升汞中加入200ul吐温-20。

2.根据权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，步骤(3)中，将杀死后的腋芽剥除具体为：将消毒处理后的单腋芽茎段表面多余水分吸干，并将单腋芽茎段的上下端各剪掉1mm，然后将腋芽剥除。

3.根据权利要求1所述的消毒方法，其特征在于，步骤(3)中，所述接种具体为：将剥除腋芽后的单腋芽茎段的形态学下端朝下接种于MS培养基中，置于温度24±2℃，光照强度2000-3000lx，光照长度14h/d的条件下进行培养。

4.权利要求1-3任一项所述的消毒方法在增加玫瑰组织培养外植体的壮芽数量中的应用。

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