CN116369207B - 水茄组培快繁方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种水茄组培快繁方法，步骤包括：(1)外植体选择与清洗；(2)外植体消毒；(3)丛生芽诱导培养；(4)继代增殖培养；(5)生根培养；(6)驯化；(7)移栽。本发明采用水茄营养器官作为外植体，不存在杂交情况，能最大程度的将筛选出的优质品质的优良性状稳定遗传，利用水茄腋芽或顶芽诱导生产大量丛生芽，缩减了愈伤分化的环节，降低了生产成本，继代增殖时用NAA和TDZ以及BR有效搭配，可使增殖系数高达7.0以上，增殖系数高；生根培养时采用NAA和IBA组合，可使生根率达100%，同时添加适宜浓度的SA，可使水茄生根苗具抗逆性提高，提高了练苗成活率，炼苗约3～4个月即可移栽，移栽成活率100%。
Description
技术领域
本发明涉及中药材组织培养技术领域，特别涉及水茄组培快繁方法及应用。
背景技术
水茄（Solanum trovum Swartz）为茄科茄属多年生灌木，以根及老茎入药，具有镇咳平喘，散瘀止痛的功效，主要用于治疗慢性支气管炎，哮喘，胃痛，风湿腰腿痛，寒性脓疡，痈肿疮毒，跌打损伤等。除根茎作药用外，其果实在民间常进行食用，取名苦子果，目前在云南有一定规模的栽培。
目前关于水茄的组培技术研究报道主要有李栋等发表的（《水茄组织培养技术体系的建立》[J]，山西农业大学学报，2019，39（2）：69～74），方岩岩发表的（《水茄植株再生及其与紫长茄杂交F1代花药培养的研究》[D]，南宁：广西大学，2013），张红发表的（《水茄的组织培养与快速繁殖》[J]，植物生理学通讯，2010，46（11）：1175～1176），但其都采用种子做外植体建立无菌体系，而水茄为异花杂交植物，种子可能存在异株杂交，对于筛选出的优质母本，其优良性状可能不能稳定遗传。
现有技术的技术路线为无菌体系建立-愈伤诱导-愈伤分化成芽-生根培养，一方面，在生产过程中技术流程中相对多了一个环节，也就意味着其成本增加了一个流程；另一方面，愈伤为脱分化细胞团，相较分化成器官的细胞组织稳定性差，在高植物生长调节剂浓度条件下较易产生变异。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种水茄组织培养方法，其培育的水茄遗传性状稳定、生产环节简便、生产成本低、增殖系数高和驯化及移栽成活率高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种水茄组培快繁方法，步骤包括：
(1)外植体选择与清洗；
(2)外植体消毒；
(3)丛生芽诱导培养：消毒好外植体，用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种于MS+NAA 0.1～0.2mg/L+2-iP 0.05～0.1mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养40～45天；
(4)继代增殖培养：丛生芽剪成具单芽小段，接种于MS+NAA 0.05～0.1mg/L+TDZ1.0～2.0mg/L+BR 0.1～0.2mg/L的丛生芽继代增殖培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养30～35天；
(5) 生根培养：经过继代增殖的丛生芽剪成具单芽小段，接种于WPM+NAA 0.4～0.6mg/L+IBA 0.2～0.3mg/L+SA 5.0～6.0mg/L的生根培养基中，置于温度25±2℃，每日照光14h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养20～25天；
(6) 驯化：获得的生根苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土的混合基质，进行常规管理；
(7) 移栽：驯化3～4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
进一步的，所述外植体选择与清洗具体为：选择顶部15-25cm茎，用自来水冲淋表面5～10min，剪去叶片，并将茎剪成2～3cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加2～3滴吐温-80，震摇10～15min，最后用自来水冲淋50～60min。
进一步的，所述外植体消毒具体为：将清洗好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒30～60s，无菌水涮洗2～3次，再用饱和漂白粉溶液消毒30～35min，无菌水涮洗3～4次，最后用0.05%升汞溶液消毒3～4min，无菌水涮洗6～7次。
进一步的，所述泥炭土、珍珠岩与田园土质量比为5:1:2。
本发明的有益技术效果是：
1、本发明采用水茄营养器官作为外植体，不存在杂交情况，能最大程度的将筛选出的优质品质的优良性状稳定遗传。
2、本发明利用水茄腋芽或顶芽，诱导生产大量丛生芽，缩减了愈伤分化的环节，降低了生产成本，同时还能一定程度的降低变异的概率。
3、本发明在继代增殖时用NAA和TDZ以及BR的有效搭配，可使增殖系数高达7.0以上，而在生产实践中，增殖系数愈高，生产成本愈低。
4、本发明在生根培养时，采用NAA和IBA的组合，可使生根率达100%，同时添加适宜浓度的SA，可使水茄生根苗具抗逆性提高，较大幅度的提高了练苗成活率，同时炼苗约3～4个月即可移栽，移栽成活率100%。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种水茄组培快繁方法，步骤包括：
(1)外植体选择与清洁：选择顶部15cm茎，用自来水冲淋表面10min，剪去叶片，并将茎剪成2cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗10min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加2滴吐温-80，震摇10min，最后用自来水冲淋50min。
(2)外植体消毒：将清洗好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒40s，无菌水涮洗2次，再用饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水涮洗3次，0.05%升汞溶液消毒3min，无菌水涮洗7次。
(3)丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种于MS+NAA 0.1mg/L+2-iP 0.05mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度23℃，每日照光12h，光强2000lx的光暗交替下培养40天。
(4)继代增殖培养：将诱导出的丛生芽剪成具单芽小段，接种于MS+NAA 0.05mg/L+TDZ 1.0mg/L+BR 0.1mg/L的丛生芽继代增殖培养基中，置于温度23℃，每日照光12h，光强2000lx的光暗交替下培养30天。
(5)生根培养：将经过继代增殖的丛生芽剪成具单芽小段，接种于WPM+NAA 0.4mg/L+IBA 0.2mg/L+SA 5.0mg/L的生根培养基中，置于温度23℃，每日照光14h，光强2000lx的光暗交替下培养25天。
(6)驯化：将经生根培养的苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
(7)移栽：驯化4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
实施例2
一种水茄组培快繁方法，步骤包括：
(1)外植体选择与清洁：选择顶部20cm茎，用自来水冲淋表面10min，剪去叶片，并将茎剪成2.5cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋60min。
(2)外植体消毒：清洗好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒60s，无菌水涮洗3次，再用饱和漂白粉溶液消毒35min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液消毒4min，无菌水涮洗7次。
(3)丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，疡按极性接种于MS+NAA 0.2mg/L+2-iP 0.1mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度25℃，每日照光12h，光强2500lx的光暗交替下培养45天。
(4)继代增殖培养：诱导出的丛生芽剪成具单芽小段，接种于MS+NAA 0.1mg/L+TDZ2.0mg/L+BR 0.2mg/L的丛生芽继代增殖培养基中，置于温度25℃，每日照光12h，光强2500lx的光暗交替下培养35天。
(5)生根培养：经过继代增殖的丛生芽剪成具单芽小段，接种于WPM+NAA 0.6mg/L+IBA 0.3mg/L+SA 6.0mg/L的生根培养基中，置于温度25℃，每日照光14h，光强2500lx的光暗交替下培养25天。
(6)驯化：将经生根培养的苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
(7)移栽：驯化3个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
实施例3
一种水茄组培快繁方法，步骤包括：
(1)外植体选择与清洁：选择顶部25cm茎，用自来水冲淋表面5min，剪去叶片，并将茎剪成3cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗13min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋55min。
(2)外植体消毒：清洗好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒30s，无菌水涮洗3次，再用饱和漂白粉溶液消毒35min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液消毒3min，无菌水涮洗6次。
(3)丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，疡按极性接种于MS+NAA 0.2mg/L+2-iP 0.1mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度27℃，每日照光12h，光强3000lx的光暗交替下培养45天。
(4)继代增殖培养：诱导出的丛生芽剪成具单芽小段，接种于MS+NAA 0.1mg/L+TDZ2.0mg/L+BR 0.2mg/L的丛生芽继代增殖培养基中，置于温度27℃，每日照光12h，光强3000lx的光暗交替下培养35天。
(5)生根培养：经过继代增殖的丛生芽剪成具单芽小段，接种于WPM+NAA 0.6mg/L+IBA 0.3mg/L+SA 6.0mg/L的生根培养基中，置于温度27℃，每日照光14h，光强3000lx的光暗交替下培养25天。
(6)驯化：将经生根培养的苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
(7)移栽：驯化3个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
对比例1
1、外植体的选择与清洁：选择顶部20cm茎，用自来水冲淋表面10min，剪去叶片，并将茎剪成2cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋60min。
2、照李栋等发表的（《水茄组织培养技术体系的建立》[J]，山西农业大学学报，2019，39（2）：69～74）的消毒方法进行外植体消毒。
3、照李栋等发表的（《水茄组织培养技术体系的建立》[J]，山西农业大学学报，2019，39（2）：69～74）的最佳愈伤分化培养基、继代增殖培养基及生根培养基进行丛生芽的诱导、继代增殖及生根培养。
4、驯化：获得的生根苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
5、移栽：驯化4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
对比例2
1、外植体选择与清洁：选择顶部20cm茎，用自来水冲淋表面10min，剪去叶片，并将茎剪成3cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋60min。
2、照方岩岩发表的（《水茄植株再生及其与紫长茄杂交F1代花药培养的研究》[D]，南宁：广西大学，2013）的消毒方法进行外植体消毒。
3、照方岩岩发表的（《水茄植株再生及其与紫长茄杂交F1代花药培养的研究》[D]，南宁：广西大学，2013）的最佳愈伤分化培养基及生根培养基进行丛生芽的诱导、继代增殖（采用愈伤分化培养基）及生根培养。
4、驯化：获得的生根苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
5、移栽：驯化4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
对比例3
1、外植体选择与清洁：选择顶部20cm茎，用自来水冲淋表面10min，剪去叶片，并将茎剪成2.5cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋60min。
2、照张红发表的（《水茄的组织培养与快速繁殖》[J]，植物生理学通讯，2010，46（11）：1175～1176）的消毒方法进行外植体消毒。
3、照张红发表的（《水茄的组织培养与快速繁殖》[J]，植物生理学通讯，2010，46（11）：1175～1176）的最佳愈伤分化诱导培养基、继代增殖培养基及生根培养基进行丛生芽的诱导、继代增殖及生根培养。
4、驯化：获得的生根苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
5、移栽：驯化4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
对比例4
1、外植体选择与清洁：选择顶部20cm茎，用自来水冲淋表面10min，剪去叶片，并将茎剪成3cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加3滴吐温-80，震摇15min，最后用自来水冲淋60min。
2、照专利《一种树茄及其培育方法、快繁方法和应用》（CN 202011454792.1）中的消毒方法进行外植体消毒。
3、照专利《一种树茄及其培育方法、快繁方法和应用》（CN 202011454792.1）中的丛生芽的诱导培养、继代增殖培养基及生根培养基进行丛生芽的诱导、继代增殖及生根培养。
4、驯化：获得的生根苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土（5:1:2）的混合基质，进行常规管理。
5、移栽：驯化4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
表1：消毒及丛生芽诱导数据
| 实施例 | 消毒污染率 | 消毒死亡率 | 丛生芽诱导率 | 丛生芽生长势 |
| 实施例1 | 12.3% | 2.4% | 83.0% | 佳 |
| 实施例2 | 9.6% | 3.9% | 84.9% | 佳 |
| 实施例3 | 10.3% | 3.4% | 85.6% | 佳 |
| 对比例1 | 6.9% | 84.3% | 43.2% | 较佳 |
| 对比例2 | 7.4% | 83.9% | 24.1% | 较佳 |
| 对比例3 | 7.3% | 90.1% | 3.8% | 佳 |
| 对比例4 | 8.8% | 88.4% | 66.1% | 佳 |
表2：继代增殖及生根数据
| 实施例 | 增殖系数 | 增殖苗状态 | 生根率 |
| 实施例1 | 7.3 | 壮 | 100% |
| 实施例2 | 7.1 | 壮 | 100% |
| 实施例3 | 8.2 | 壮 | 100% |
| 对比例1 | 4.4 | 弱 | 63.4% |
| 对比例2 | 4.9 | 弱 | 94.6% |
| 对比例3 | 2.8 | 壮 | 86.7% |
| 对比例4 | 5.3 | 较弱 | 96.7% |
表3：驯化移栽数据
| 实施例 | 驯化成活率 | 驯化苗长势 | 移栽成活率 |
| 实施例1 | 97.4% | 强，抗逆性好 | 100% |
| 实施例2 | 98.2% | 强，抗逆性好 | 100% |
| 实施例3 | 96.8% | 强，抗逆性好 | 100% |
| 对比例1 | 81.3% | 较弱，抗逆性差 | 84.3% |
| 对比例2 | 90.9% | 较强，抗逆性差 | 85.9% |
| 对比例3 | 88.6% | 较弱，抗逆性差 | 83.2% |
| 对比例4 | 81.1% | 弱，抗逆性差 | 90.7% |
由表1、表2可以看出，采用现有消毒技术对以顶端具腋芽茎段进行消毒，消毒死亡率极高，而丛生芽诱导率也极低，不能快速获得大量无菌体系，实际生产中几乎不能应用。不论是增殖系数还是生根率，现有技术均远低于本发明。
在发明之初，生根培养基中并未添加SA，使得驯化管理相对较为困难，需要每天进行人工喷施雾化水，而本发明添加了适宜浓度的SA，能很大程度的增加生根苗的抗逆性，可一定程度的提高了驯化成活率，由表3即可看出。
表3中驯化表现为生长迅速，生长势较强，猜测生根苗体内仍残留一定浓度的BR，使得其驯化时，生长速度现有技术快，使得驯化周期缩短至3~4个月
而在实际过程中，生产程序、增殖系数、生根率、驯化成活率、驯化周期等因素，决定了组培苗的生产成本。而移栽成活率，很大程度的决定了种苗生产单位的行业口碑。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.水茄组培快繁方法，其特征在于，步骤包括：
(1) 外植体选择与清洗：所述外植体选择与清洗具体为：选择顶部15～25cm茎，用自来水冲淋表面5～10min，剪去叶片，并将茎剪成2～3cm具芽小段，先用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min，后用自来水涮洗至无肥皂液残留，再滴加2～3滴吐温-80，震摇10～15min，最后用自来水冲淋50～60min；
(2)外植体消毒；
(3)丛生芽诱导培养：消毒好外植体，用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种于MS+NAA 0.1～0.2mg/L+2-iP 0.05～0.1mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养40～45天；
(4)继代增殖培养：丛生芽剪成具单芽小段，接种于MS+NAA 0.05～0.1mg/L+TDZ 1.0～2.0mg/L+BR 0.1～0.2mg/L的丛生芽继代增殖培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养30～35天；
(5) 生根培养：经继代增殖的丛生芽剪成具单芽小段，接种于WPM+NAA 0.4～0.6mg/L+IBA 0.2～0.3mg/L+SA 5.0～6.0mg/L的生根培养基中，置于温度25±2℃，每日照光14h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养20～25天。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外植体消毒具体为：将清洗好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒30～60s，无菌水涮洗2～3次，再用饱和漂白粉溶液消毒30～35min，无菌水涮洗3～4次，最后用0.05%升汞溶液消毒3～4min，无菌水涮洗6～7次。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括驯化步骤，具体为：获得的生根苗，栽植于具75%遮阴率的大棚内，基质采用泥炭土、珍珠岩与田园土的混合基质，进行常规管理。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述泥炭土、珍珠岩与田园土质量比为5:1:2。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括移栽步骤，具体为：驯化3～4个月后，移栽于大田内，进行常规管理。
6.根据权利要求1-5任一项所述方法在水茄组培快繁中的运用。
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| CN107926715A (zh) * | 2018-01-05 | 2018-04-20 | 湖北乡香茄生态农业有限公司 | 一种茄子或/和辣椒或/和番茄的嫁接培育方法 |
| CN110537489A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-06 | 广西大学 | 一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法 |
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- 2023-06-05 CN CN202310652847.7A patent/CN116369207B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "水茄的组织培养与快速繁殖";张红;《植物生理学通讯》;第46卷(第11期);第1175-1176页 * |
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