CN102986526A - 一种开放式植物组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种开放式植物组织培养方法，其在培养基中添加挥发性植物精油抑菌剂，免去高压消毒程序，在室内开放环境接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的环境条件下进行培养。本发明的挥发性抑菌剂在对培养基本身消毒的同时，也能对瓶内空间进行消毒，使培养物处在较为无菌的环境生长，降低培养物污染概率；本发明采用的抑菌剂在培养基添加量小(总使用量为2μl-2ml/L培养基)，对培养基渗透压没有影响；本发明成分对人体无毒；添加量少，无不适刺激味。
Description
技术领域
本发明涉及一种农林领域的植物组织培养育苗技术。
背景技术
植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项现代农业技术。经过近一个世纪的发展。利用植物组织培养技术进行无性繁殖的方法已取得了很大的进展。与传统的植物繁育方法相比，这方法具有快速高效，不受季节限制，有时还结合“脱毒”技术取得防止带毒退化、增强生活力及较好地保持种性的效果，在当前倡导高效现代化农业发展模式的形势下，通过植物组织培养技术生产高质量的种苗具有十分广阔的市场前景。虽然它的理论研究已相当精深，但由于技术环节还存在不少问题，组培成本太高，无法满足市场对高质量组培苗低价位的需求，因此，如何降低组培成本是决定组培效益的关键所在，也是组培技术得以健康发展的首要条件。传统组培过程中的污染是组培技术的主要难点之一，主要表现为培养基的污染，培养基高压灭菌具有资金投入大、能耗高，培养基成分遭受破坏等缺点，近年引起兴趣的植物开放式组织培养，是在抗菌剂的作用下，培养基不需高压灭菌，利用塑料杯代替组培瓶，简化组培环节，降低组培成本。
将培养基改造成既可保证植物组织正常生长，又具有抗菌功能的培养基，关键是要找到一种或几种能够添加到培养基的高效广谱性抗菌剂。植物组织培养制作培养基，将热熔的琼脂营养液分装进培养瓶，培养基体积一般占培养瓶容积的五分之一左右，留有较大的瓶内空间，从已经公开的资料来看，现有的开放式组织培养中，培养基加入抑菌剂只对固体培养基部分抑菌，对瓶内空间的微生物无能为力，这就可能导致植物材料接种到培养基表面后，瓶内微生物沉降附着在培养物表面并繁殖，培养物遭受污染几率较高。
从已经公开的资料来看，培养基所添加抑菌剂的量较大，可能将提高培养基渗透压，对培养物生长产生不利的影响。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种开放式组织培养方法，本发明采用挥发性抑菌剂加入培养基，在对培养基本身消毒的同时，由于抑菌剂自身具有挥发能力，能挥发到瓶内空间进行消毒，使培养物处在较为无菌的环境生长，降低培养物污染概率。
本发明提供的技术方案如下：
一种开放式植物组织培养方法，其在培养基中添加挥发性植物精油抑菌剂，免去高压消毒程序，在室内开放环境条件下接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的环境条件下进行培养。
所述的植物精油抑菌剂的使用量为2μl-2ml/L培养基。
所述的植物精油抑菌剂包括以下成分的至少一种：
(1)肉桂油。包括桂皮油和桂叶油，分别蒸镏自肉桂(Cinnamomum cassia)的干燥枝、叶，主要成分桂皮醛，反式茴香脑、可巴烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(2)桉叶油(尤加利油)。从蓝桉、桉叶树等桉树属(Eucalyptus)植物的叶、枝中提取。主要组成：1，8-桉叶素、莰烯、水芹烯、松油醇、乙酸香叶醇等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(3)茶树油。自白千层属(Melaleuca)植物的新鲜枝叶提取。主要组成：对孟烯-1-醇，1，8-桉叶油素、松油烯、异松油烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(4)百里香油。由百里香(Thymus vulgaris及T.zygis var gracilis)进入花期的地上部分提取。主要成分：百里香酚、香芹酚。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(5)丁香油。提取自丁香(Eugenia caryophyllata)干燥花蕾，主要成分丁香酚。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(6)薰衣草油。由薰衣草(Lavandula officinalis或L.angustifolia)的花序提取。主要成分为乙酸芳樟酯、芳樟醇、薰衣草醇、乙酸薰衣草酯、对-1-孟烯-4-醇等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(7)柠檬油。由柠檬属(Lemon)的新鲜果皮经压榨而得。主要成分是苎稀(对孟-1，8-二烯)和柠檬醛。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(8)山苍子油由山苍子(Litsea cubeba)果实提取。主要成分是括柠檬醛、甲基庚烯酮、香茅醛、香茅醇、蒎烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(9)香茅油(香草油)。香茅(Cymbopogon nardus)全草提取。主要成分香茅醛、香茅醇。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(10)牛至油。自牛至(Origanum vulgare)全草提取，主要成分香芹酚、欧百里香酚、麝香草酚等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(11)广藿香油。自广藿香(Pogostemon cablin或P.patchouli pelletiver var.snavis或P.heyneanus)叶子、枝杆及根部提取，主要成分为广藿香烯、广藿香醇、广藿香酮。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(12)紫苏油。提取自紫苏(Perilla frutescens)茎叶，主要成分为柠檬烯、紫苏烯，α-亚麻酸等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(13)迷迭香油。提取自迷迭香(Rosmarinus officinalis)茎叶，主要成分为α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、1，8-桉叶素、樟脑、龙脑。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(14)大蒜油。从大蒜(Allium sativum)鳞茎提取，主要成分：丙基二硫化丙烯、二硫化二丙烯、三硫化二丙烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(15)没药油。地丁树或哈地丁树(Commiphora)的树脂油，主要成分为桂醛、没药酸、肉桂醛、小茴香醛，丁香酚。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(16)土荆芥油。自土荆芥(Chenopodium ambrosioides)果实和叶提取，主要成分驱蛔素、对聚伞花素、土荆芥酮。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(17)丁香罗勒油。提取自丁香罗勒(Ocimum gratissimum)的全草，主要成分丁香酚、芳樟醇、松油醇罗勒烯。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(18)薄荷油。提取自薄荷(Mentha arvensis)茎叶。主要成分左旋薄荷醇、左旋薄荷酮、异薄荷酮、胡薄荷酮、乙酸癸酯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(19)花椒油。从花椒属(Zanthoxylum)果实提取，主要成分为柠檬烯、枯醇、香叶醇等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(20)佛手柑油。从佛手柑(Citrus medica var sarcodactylis)果皮提取，中国的佛手柑主要含有橙花醇、柠檬脑、柠檬醛等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(21)连翘油。提取自连翘(Forsythia suspens)的果实，主要成分α-蒎烯、β-蒎烯、松油醇-4-醇、水芹烯。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(22)苍术油。从南苍术(Atractylodes lancea)或北苍术(A.chinensis)等的干燥根茎提取。主要成分苍术醇、苍术酮、苍术烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(23)岩兰草油(香根油)。提取自岩兰草(Andropogon muricatus)根，主要成分安息香酸、岩兰草醇、岩兰草酮、岩兰草烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(24)藿香油。提取自藿香(Agastache rugosus)全草，主要成分甲基黑椒酚(对烯丙基苯甲醚)、丁香酚甲醚等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(25)雪松油。提取自雪松(Juniperus virginiana)根茎枝，主要成分α-雪松烯、γ-依兰油烯、雪松醇等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(26)艾叶油。提取自蒿属(Artemisia)的干叶或鲜叶，主要成分为蒲品烯醇-4与α-萜品烯醇等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(27)鼠尾草油。提取自鼠尾草(Salvia officinalis)叶与花，主要成分有龙脑、侧柏酮、樟脑、桉叶油。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(28)快乐鼠尾草油。提取自快乐鼠尾草(Salvia sclarea)花苞和花，主要成分洋苏草醇、洋苏草酮、桉油醇、沉香醇。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(29)欧薄荷油。提取自欧薄荷(Mentba piperita)叶子，主要成分薄荷脑、胡薄荷醇、薄荷酮等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(30)生姜油。提取自姜(Zingiber officinale)的根茎。主要成分姜烯、姜醇、姜酮等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(31)细辛精油。提取自辽细辛(Asarum heterotropoide)根。主要成分甲基丁香酚、黄樟醚、优香芹酮等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(32)芫荽油。芫荽(Coriandrum sativum)的果实经水蒸气蒸馏而得。主要成分为芳樟醇、聚伞花酚、松油烃、香叶醇等。其在培养基添加量是2μ1-2ml/L。
(33)月桂油。提取自月桂树(Laurus nobilis)的叶。主要成分是丁子香酚、桉树脑和蒎烯。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(34)松节油。由松属(Pinus)的树脂蒸馏取得。主要成分为α-蒎烯、β-蒎烯、芋烯、莰烯、蒈烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(35)茴香油。提取自大茴香(Illicium verum)或小茴香(Foeniculum vulgare)的果实。主成分：桉油醇、甲基黑椒酚、反式茴脑、大茴香醛。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(36)天竺葵油。由天竺葵(Pelargonium graveolens)花叶提取。主成分：香茅醇、甲酸香茅酯和乙酸香茅醇。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(37)柏木油。产自侧柏(Thuja occidentalis)和扁柏(Cupressus funebris)木，枝，叶，主成分为柏木脑、α-和β-寸白木烯、罗汉柏烯等。其在培养基添加量是2μ1-2ml/L。
(38)芥茉油(黑芥末油和白芥末油)。由黑芥(Brassica nigra)和白芥(B.hirta)种子提取。主成分为异硫氰酸烯丙酯。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(39)橙花油。从橙(Citrus sinensis)花提取，主要成分L-芳樟醇、乙酸芳樟醇、橙花醇、乙酸橙花酯。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(40)罗勒油。由甜罗勒(Ocimum basilicum)或圣罗勒(O.sanctum)全草提取，主要化学成分为沉香醇、樟脑、松萜或蒎烯、莰烯等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(41)葡萄柚油。由葡萄柚(Citrus paradisi)果皮提取，主要成分松萜、蒎烯、桧烯、月桂烯、柠檬油精、香叶醇。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(42)樟脑油。由樟(Cinnamomum camphora)的树干、枝叶提取，主要成分为樟脑、桉叶素、黄樟素、芳樟醇等。其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
所述的植物精油抑菌剂还包括吐温-20，单方或复合精油总体积与吐温-20体积比为1.8-2.5∶1。其中，添加乳化剂吐温-20可使精油均匀地分散在培养基中。
组培的微生物污染是限制组培产业化的重要原因之一，传统组培中培养基需经高温高压灭菌。在培养基添加抑菌剂，可免去高压灭菌程序，又能保证植物组织正常生长，具有省去高压灭菌器的资金投入，节省能源，缩短培养基制作时间，许多不耐高压灭菌的培养基添加剂可直接投放到培养基，减少琼脂用量，培养基营养物质和激素损失较少，不耐高温的培养容器也适宜用作培养容器等优点。
与现有技术的实施方案比较：
1、专利公开号CN101455180A以大蒜、黄连、忍冬叶、甘草根、桂花、石蒜提取物减压浓缩制作抑菌剂，发明开放式组织培养育苗方法。公开号CN101946809以聚赖氨酸、异噻唑啉酮、中药水提物等发明适合于组织培养的抑菌剂组合，省去培养基高压灭菌程序。专利号ZL 200610172193.4发明了含蜂胶抑菌剂植物培养基。从以上已经公开的资料来看，以上加入的抑菌剂不具挥发性，它们只能对固体培养基部分抑菌。本发明的挥发性抑菌剂在对培养基本身消毒的同时，也能对瓶内空间进行消毒，使培养物处在较为无菌的环境生长，降低培养物污染概率；
2、相对已经公开的类似专利，本发明采用高效抑菌剂，在培养基添加量小(总使用量为2μl-2ml/L培养基)，对培养基渗透压没有影响；
3、本发明成分为植物天然成分，广泛应用于空气清新、食品调香、皮肤擦拭等，对人体无毒，添加量少，无不适刺激味。
具体实施方式
抑菌培养基制备方法
1、容器选择：玻璃培养瓶一定要干净，消毒剂(液)浸泡后，倒扣凉干不留水迹，可直接分装培养基。若用一次性无色透明塑料口杯，直接分装培养基，PE保鲜膜封口，抗老化皮筋扎口。均不经高压灭菌。
2、制备培养基
培养基制备室需干净，配培养基按常规方法，琼脂条用量为常规用量的70％。左右，琼脂完全溶解停止加热，定容。加入本抑菌剂(单方或复方使用抑菌剂，在培养基总添加量是2μl-2ml/L)，调PH，分装到培养瓶，5min内完成加盖封口。
3.培养基冷却后常规方法接种和培养。接种间紫外线消毒20分钟，75％酒精喷雾降尘，75％酒精擦拭台面，接种在开放的台面上进行，无需超净工作台。
实施例一、单方抑菌培养基在蝴蝶兰类原球茎增殖上的应用
1/2大量元素MS培养基，每升加激素6-BA 3mg，蔗糖30g、琼脂7g，加热完全熔化，断开热源，定容，培养基分别添加表1各种抑菌剂，调pH至5.8，不经高压灭菌，直接分装到玻璃培养瓶，5分钟内加盖封口，在室内开放环境接种蝴蝶兰类原球茎，对照培养基不添加抑菌剂，分装到玻璃培养瓶，常规高压灭菌，冷却后常规方法接种类原球茎，每种处理15瓶，常规培养，一个月后观察培养瓶污染情况、类原球茎重量增加情况，见表1。
表1蝴蝶兰类原球茎在抑菌培养基上的增殖情况
实施例二、单方抑菌培养基在胡萝卜种子发芽长苗上的应用
MS培养基，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，加热完全熔化，断开热源，定容，培养基分别添加下表各种抑菌剂，调pH至5.8，不经高压灭菌，直接分装到玻璃培养瓶，5分钟内加盖封口。对照培养基不添加抑菌剂，分装到玻璃培养瓶，常规高压灭菌，每种处理10瓶。
去刺胡萝卜种子常规75％酒精瞬间消毒，0.1％氯化汞浸泡10分钟，在室内开放环境接种，每瓶30粒，常规培养，一个月后观察培养基污染瓶数、种子发芽率、芽苗高度范围，见表2
表2胡萝卜种子接种在抑菌培养基的生长情况
实施例三、单方抑菌培养基在菜心种子发芽长苗上的应用
MS液体培养基，蔗糖30g/L，加入各种抑菌剂，搅拌均匀，定容，调pH至5.8，吸少量加入底部垫放滤纸玻璃培养瓶，5分钟内加盖封口，不经高压灭菌。对照培养基不添加抑菌剂，分装到底部垫放滤纸玻璃培养瓶，常规高压灭菌，每种处理10瓶。
菜心种子常规75％酒精瞬间消毒，0.1％升汞浸泡10分钟，加抑菌剂培养基在室内开放环境接种，对照则常规方法接种，每瓶40粒，常规培养，一个月后观察培养基污染瓶数、种子发芽率、苗高，见表3
表3菜心种子接种在抑菌培养基的生长情况
实施例四、复方抑菌培养基在蝴蝶兰类原球茎增殖上的应用
1/2大量元素MS培养基，每升加激素6-BA 3mg，蔗糖30g、琼脂7g，加热完全熔化，断开热源，定容，培养基分别添加香茅油、山苍子油、迷迭香油、薰衣草油各0.1ml，合计精油浓度0.4ml/L，调pH至5.8，不经高压灭菌，直接分装到一次性无色透明塑料口杯，5分钟内保鲜膜封口，皮筋扎口。在室内开放环境接种蝴蝶兰类原球茎，对照培养基不添加抑菌剂，分装到玻璃培养瓶，常规高压灭菌，冷却后常规方法接种类原球茎，每种处理15瓶，常规培养，一个月后观察培养瓶污染情况、类原球茎重量增加情况，见表4。
表4蝴蝶兰类原球茎接种在复方抑菌培养基的生长情况
实施例五、复方抑菌培养基在菜心种子发芽上的应用
MS培养基，每升蔗糖30g、琼脂7g，加热完全熔化，断开热源，定容，培养基分别添加丁香油、广藿香油、牛至油、百里香油各0.3ml，合计精油浓度1.2ml/L，调pH至5.8，不经高压灭菌，直接分装到干净玻璃培养瓶，5分钟内加盖封口。对照培养基不添加抑菌剂，分装到玻璃培养瓶，常规高压灭菌，每种处理15瓶。种子常规75％酒精瞬间消毒，0.1％氯化汞浸泡10分钟，加抑菌剂培养基在室内开放环境接种，对照培养基常规方法接种，每瓶40粒，常规培养，一个月后观察污染瓶数、种子发芽率、芽苗高度，见表5
表5菜心种子接种在复方抑菌培养基的生长情况
Claims (4)
1.一种开放式植物组织培养方法，其特征在于：在培养基中添加挥发性植物精油抑菌剂，免去高压消毒程序，在室内开放环境接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的环境条件下进行培养。
2.如权利要求1所述的一种开放式植物组织培养方法，其特征在于：所述的植物精油抑菌剂的使用量为2μl-2ml/L培养基。
3.如权利要求1所述的一种开放式植物组织培养方法，其特征在于：所述的植物精油抑菌剂包括以下成分的至少一种：
(1)肉桂油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(2)桉叶油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(3)茶树油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(4)百里香油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(5)丁香油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(6)薰衣草油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(7)柠檬油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(8)山苍子油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(9)香茅油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(10)牛至油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(11)广藿香油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(12)紫苏油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(13)迷迭香油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(14)大蒜油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(15)没药油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(16)土荆芥油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(17)丁香罗勒油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(18)薄荷油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(19)花椒油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(20)佛手柑油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(21)连翘油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(22)苍术油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(23)岩兰草油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(24)藿香油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(25)雪松油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(26)艾叶油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(27)鼠尾草油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(28)快乐鼠尾草油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(29)欧薄荷油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(30)生姜油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(31)细辛精油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(32)芫荽油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(33)月桂油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(34)松节油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
(35)茴香油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(36)天竺葵油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(37)柏木油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(38)芥茉油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(39)橙花油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(40)罗勒油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(41)葡萄柚油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L；
(42)樟脑油，其在培养基添加量是2μl-2ml/L。
4.如权利要求2或3所述的一种开放式植物组织培养方法，其特征在于：所述的植物精油抑菌剂还包括吐温-20，单方或复合精油总体积与吐温-20体积比为1.8-2.5∶1。
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