CN106212281B - 一种提高香蕉成活率的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物组织培养领域，公布了一种提高香蕉成活率的组织培养方法，发明的组织培养方法包括以下步骤：(1)培养室消毒；(2)外植体的选择；(3)外植体的灭菌；(4)初始诱导培养；(5)继代培养；(6)炼苗，该方法利用植物处理液对外植体进行消毒，提高了在组织培养过程中外植体的成活率，同时还利用木薯酒精废液替代常用的MS培养基，能有效降低组培成本，提供了一种能提香蕉外植体成活率，不会对外植体进行侵害，同时还能降低成本的组培方法。

Description

一种提高香蕉成活率的组织培养方法
【技术领域】
本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种提高香蕉成活率的组织培养方法。
【背景技术】
香蕉属于芭蕉科芭蕉属为多年，起源于亚洲热带地区，是世界主要鲜果种类之一。香蕉属于三倍体有高度不育性，果实没有种子，只能通过无性繁殖传代，常用的繁殖手段为组织培养，自20世纪60年代以来，植物组织培养技术不断地发展，并逐步完善成熟，虽然植物组培的理论研究已相当精深，但技术环节还存在不少问题，例如在组织培养消毒过程中，常用的消毒剂选用的是化学制剂、农药、紫外线等，利用消毒剂在消毒过程中，消毒时间的掌握很重要，时间过长极易对植物造成危害，降低成活率，消毒时间过短又不能起到消毒的作用，造成污染。多年来国内外研究者对消毒剂进行了广泛研究和筛选,但至今没有发现一种能满足理想条件的消毒剂。常用的组织培养基选用的是MS培养基，培养基原料较贵，配置复杂，而且做为大生产时，成本较大。
目前，我国常用的灭菌消毒剂主要以升汞为主,国内外对汞的毒性作用进行了大量的研究,证实汞对细胞的每一生长过程都有重要影响,所以经过升汞灭菌的外植体,需彻底除去残留的Hg+,以消除微量的残留升汞对外植体的伤害。例如，中国专利CN 105284618A公开了一种香蕉无MS组织培养的方法，该发明提供了一种香蕉无MS组织培养的方法，使用木薯酒精厌氧发酵液替代基本培养基MS，该方案可以降低生产成本，变废为宝，但该方案并没有对消毒剂进行改进，因此，在现行的组织培养中需要提供一种理想的消毒剂，不仅能对外植体进行表面消毒，还不会对外植体进行侵害，同时还能降低组培的生产成本的组织培养方法。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种理想的消毒剂，不仅能对外植体进行表面消毒，还不会对外植体进行侵害，同时还能降低组培的生产成本的组织培养方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种提高香蕉成活率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：
(1)培养前20h-24h对培养室进行灭菌消毒；
(2)外植体的选择：选择香蕉吸芽为外植体，长2cm-3cm，直径1cm-2cm；
(3)外植体的灭菌：外植体经过水冲洗、75％的酒精浸泡沥干后，在质量浓度为5％-8％的植物处理液中浸泡10min-20min进行灭菌，所述植物处理液的组成及重量百分数如下：30％-50％的灵芝浸出液、10％-20％的辣蓼草汁、10％-20％的大蒜汁、10％-20％的洋葱汁、5％-10％的藿香汁、5％-10％的仙人掌汁。
(4)初始诱导培养：将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为26℃-28℃，用5红3绿2蓝光质的LED光灯进行光照，光照强度为400Lx-1000Lx，光照时间为20h-25h；
(5)继代培养：将诱导培养后长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为26-28℃，用4红3绿3白LED光灯进行光照，光照强度为600Lx-1200Lx，光照时间为20h-25h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养4-6代后将长成生根苗的幼苗转接到放有培养基质的营养杯中进行培养；
(6)炼苗：将营养杯中的香蕉幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为24℃-28℃，光照为日光照射。
进一步的，所述诱导培养基组成为：COD含量为300mg/L-800mg/L的15％-20％木薯酒精废液，2.0g/L-4.0g/L的蔗糖溶液，5.0g/L-8.0g/L的灵芝浸出液，5.0g/L-8.0g/L的香蕉叶汁，2.0g/L-5.0g/L的辣蓼草汁，5.0g/L-8.0g/L的琼脂，0.1mg/L-0.5mg/L的吲哚丁酸。
进一步的，所述继代培养基组成为：COD含量为500mg/L-1000mg/L的15-20％木薯酒精废液，5.0g/L-8.0g/L的蔗糖溶液，5g/L-10g/L的灵芝浸出液，5.0g/L-10.0g/L的辣蓼草汁，6.0g/L-10.0g/L的琼脂。
进一步的，所述营养杯基质的重量百分比组成为：40％-60％的椰糠、20％-30％的稻杆，10％-20％的黄沙，5％-10％的有机肥。
进一步的，所述步骤(4)的LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-红-蓝-红-绿-蓝-红-绿-红”。
进一步的，所述步骤(5)的LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-白-红-绿-白-红-绿-白-红”。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明选用植物处理液替代消毒剂，该植物处理液组成及重量百分数如为：30％-50％的灵芝浸出液、10％-20％的辣蓼草浸出液、10％-20％的大蒜汁、10％-20％的洋葱汁、5％-10％的藿香浸出液、5％-10％的仙人掌浸出液；灵芝浸出液具有强烈的抑制细菌作用，能对外植体进行有效消毒，但是灵芝浸出液含量过高会抑制外植体的生长，可以使用辣蓼草配合进行杀菌，辣蓼草能有促进植物生长的作用，但是仅用辣蓼草和灵芝并不能达到杀菌浓度，发明人经过研究发现可以添加大蒜汁和藿香进行杀毒，大蒜汁性质不稳定及易失去活性，但是大蒜汁的杀菌能力很强，与藿香进行配合利用藿香散发的气味进行消毒，形成一个相对无菌无毒的生长环境，利用上述的植物处理液与植物间不会造成拮抗作用，对外植体表面进行消毒不会对外植体造成侵害。
2、本发明的诱导培养基选用COD含量为300mg/L-800mg/L的15％-20％木薯酒精废液为培养基主要成分，木薯酒精废液在经过发酵、厌氧处理含有丰富的无机盐离子，同时含有丰富的有机质能促进外植体的生长，对废液的二次利用能降低组培成本，但是发酵液中含有较高浓度的菌群，发明人通过研究发现可以通过添加灵芝浸出液、辣蓼草来抑制细菌的生长，香蕉浸出液中含有丰富的叶绿素，可促进外植体的光合作用，吲哚丁酸能促进外植体生根，本发明人发现在此配方下的培养基中能充分促进外植体的诱导培养；外植体在诱导培养之后，生长能力较强，在继代培养时不需要添加吲哚丁酸进行生根，也不需要添加香蕉浸出液来提高叶绿素含量，发明人发现在此继代培养基配方下能充分促进外植体的继代培养；为了提高炼苗效率，发明人经过不断试验发现40％-60％椰糠、20％-30％稻杆，10％-20％黄沙，5％-10％有机肥最接近外界生长环境，同时含有丰富的有机肥可做为营养杯的基质可提高炼苗效率。
3、发明人经过研究发现在光照处理时，红光能促进外植体的生长，而蓝光则有显著抑制作用，蓝光能够缓解外植体可溶性蛋白的降解，可溶性蛋白含量高，红蓝光组合处理可显著提高了外植体中VC含量。在红蓝光LED灯处理上添加绿光LED灯处理时能促进外植体的生长和干物质的积累，经发明人不断研究发现，当选用5红3绿2蓝光质的LED灯对外植体进行灯照并按照“红-绿-红-蓝-红-绿-蓝-红-绿-红”的顺序进行排布时，外植体的生长情况最良好，各营养物质的指标也最好；而白光相能显著增加外植体的下胚轴的伸长，经发明人不断研究发现，当选用4红3绿3白光质的LED灯对外植体进行灯照并按照“红-绿-白-红-绿-白-红-绿-白-红”的顺序进行排布时，能充分促进外植体的生根生长。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
植物浸出液的制取：
(1)灵芝浸出液：称取一定质量的洗净晾干的灵芝切块放入研钵中捣碎研磨，研磨后放入烧杯中，将等质量的蒸馏水倒入烧杯中进行浸泡24h，用滤纸过滤，取滤液备用。
(2)辣蓼草汁：称取一定质量的洗净晾干的新鲜辣蓼草剪碎加入等质量的蒸馏水，放入榨汁机中进行榨汁，榨汁完成后放入烧杯中静置2-4h，取上层清液体备用。
(3)大蒜汁：称取一定质量的洗净晾干的新鲜大蒜切碎加入等质量的蒸馏水，放入榨汁机中进行榨汁，榨汁完成后放入烧杯中静置2-4h，取上层清液体备用。
(4)洋葱汁：称取一定质量的洗净晾干的新鲜大蒜切碎加入等质量的蒸馏水，放入榨汁机中进行榨汁，榨汁完成后放入烧杯中静置2-4h，取上层清液体备用。
(5)藿香汁：称取一定质量的洗净晾干的新鲜藿香剪碎加入等质量的蒸馏水，放入榨汁机中进行榨汁，榨汁完成后放入烧杯中静置2-4h，取上层清液体备用。
(6)仙人掌汁：称取一定质量的洗净晾干的新鲜仙人掌剪碎加入等质量的蒸馏水，放入榨汁机中进行榨汁，榨汁完成后放入烧杯中静置2-4h，取上层清液体备用。
(7)香蕉叶汁：称取一定质量的洗净晾干的新鲜香蕉叶剪碎加入等质量的蒸馏水，放入榨汁机中进行榨汁，榨汁完成后放入烧杯中静置2-4h，取上层清液体备用。
实施例1：
在培养前20h向关闭门窗的培养室地面喷洒石灰粉，向空气中喷洒浓度为75％的医用酒精，进行灭菌消毒；选择无病虫害的香蕉吸芽为外植体，长2cm，直径1cm；用自来水对外植体进行冲洗9min，捞出后用浓度为75％的酒精溶液浸泡5min，外植体沥干后在质量浓度为5％的植物处理液中浸泡10min(植物处理液的组成及重量百分数如下：37％的灵芝浸出液、10％的辣蓼草汁、17％的大蒜汁、20％的洋葱汁、8％的藿香汁、8％的仙人掌汁)；将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养(诱导培养基组成为：COD含量为300mg/L的15％木薯酒精废液，2.0g/L的蔗糖溶液，5.0g/L的灵芝浸出液，5.0g/L的香蕉叶汁，2.0g/L的辣蓼草汁，5.0g/L的琼脂，0.1mg/L的吲哚丁酸)，培养温度为26℃，用5红3绿2蓝光质的LED光灯进行光照，LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-红-蓝-红-绿-蓝-红-绿-红”，光照强度为400Lx，光照时间为20h；将长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养(继代培养基组成为：COD含量为500mg/L的15％木薯酒精废液，5.0g/L的蔗糖溶液，5g/L的灵芝浸出液，5.0g/L的辣蓼草汁，6.0g/L的琼脂)，培养温度为26，用4红3绿3白LED光灯进行光照，LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-白红-绿-白-红-绿-白-红”，光照强度为600-1200Lx，光照时间为20h-25h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养4代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养(营养杯基质的重量百分比组成为：40％的椰糠、30％的稻杆，20％的黄沙，10％的有机肥)；将营养杯中的香蕉幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为24℃，光照为日光照射。
实施例2：
在培养前22h向关闭门窗的培养室地面喷洒石灰粉，向空气中喷洒浓度为75％的医用酒精，进行灭菌消毒；选择无病虫害的香蕉吸芽为外植体，长3cm，直径2cm；用自来水对外植体进行冲洗12min，捞出后用浓度为75％的酒精溶液浸泡7min，外植体沥干后在质量浓度为8％的植物处理液中浸泡20min(植物处理液的组成及重量百分数如下：50％的灵芝浸出液、15％的辣蓼草汁、10％的大蒜汁、10％的洋葱汁、5％的藿香汁、10％的仙人掌汁)；将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养(诱导培养基组成为：COD含量为800mg/L的20％木薯酒精废液，4.0g/L的蔗糖溶液，8.0g/L的灵芝浸出液，8.0g/L的香蕉叶汁，5.0g/L的辣蓼草汁，8.0g/L的琼脂，0.5mg/L的吲哚丁酸)，培养温度为28℃，用5红3绿2蓝光质的LED光灯进行光照，LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-红-蓝-红-绿-蓝-红-绿-红”，光照强度为1000Lx，光照时间为25h；将长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养(继代培养基组成为：COD含量为1000mg/L的20％木薯酒精废液，8.0mg/L的蔗糖溶液，10mg/L的灵芝浸出液，10.0mg/L的辣蓼草汁，10.0g/L的琼脂)，培养温度为28℃，用4红3绿3白LED光灯进行光照，LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-白红-绿-白-红-绿-白-红”，光照强度为1200Lx，光照时间为25h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养6代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养(营养杯基质的重量百分比组成为：60％的椰糠、25％的稻杆，10％的黄沙，5％的有机肥)；将营养杯中的香蕉幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为28℃，光照为日光照射。
实施例3：
在培养前24h向关闭门窗的培养室地面喷洒石灰粉，向空气中喷洒浓度为75％的医用酒精，进行灭菌消毒；选择无病虫害的香蕉吸芽为外植体，长2.5cm，直径1.5cm；用自来水对外植体进行冲洗11min，捞出后用浓度为75％的酒精溶液浸泡6min，外植体沥干后在质量浓度为5％-8％的植物处理液中浸泡15min(植物处理液的组成及重量百分数如下：30％的灵芝浸出液、20％的辣蓼草汁、20％的大蒜汁、15％的洋葱汁、10％的藿香汁、5％的仙人掌汁)；将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养(诱导培养基组成为：COD含量为500mg/L的18％木薯酒精废液，3.0g/L的蔗糖溶液，6.0g/L的灵芝浸出液，6.0g/L的香蕉叶汁，3.0g/L的辣蓼草汁，7.0g/L的琼脂，0.3mg/L的吲哚丁酸)，培养温度为27℃，用5红3绿2蓝光质的LED光灯进行光照，LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-红-蓝-红-绿-蓝-红-绿-红”，光照强度为800Lx，光照时间为23h；将长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养(继代培养基组成为：COD含量为700mg/L的16％木薯酒精废液，7.0g/L的蔗糖溶液，7g/L的灵芝浸出液，7.0g/L的辣蓼草汁，8.0g/L的琼脂)，培养温度为27℃，用4红3绿3白LED光灯进行光照，LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-白-红-绿-白-红-绿-白-红”，光照强度为1000Lx，光照时间为22h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养5代后将长成生根苗的幼苗转接到放好培养基质的营养杯中进行培养(营养杯基质的重量百分比组成为：50％的椰糠、28％的稻杆，14％的黄沙，8％的有机肥)；将营养杯中的香蕉幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为26℃，光照为日光照射。
对照组1：
按照实施例2的步骤进行组织培养，省去植物浸泡液灭菌步骤，形成植物浸泡液的空白试验，统计并计算在继代培养前外植体成活情况。
对照组2：
按照实施例2的步骤进行组织培养，将诱导培养基、继代培养基的主要成分替换成常用的MS培养基，并向其中加入实施例2的植物提取物，即诱导培养基成分为：MS培养基，4.0g/L的蔗糖溶液，8.0g/L的灵芝浸出液，8.0g/L的香蕉叶汁，5.0g/L的辣蓼草汁，8.0g/L的琼脂，0.5mg/L的吲哚丁酸；继代培养基成分为：MS培养基，8.0mg/L的蔗糖溶液，10g/L的灵芝浸出液，10.0g/L的辣蓼草汁，10.0g/L的琼脂；形成木薯酒精废液培养基的空白试验，统计并计算在继代培养前外植体及继代培养后生根苗移植进营养杯前5cm生根苗成活情况。
对照组3：
按照实施例2的步骤进行组织培养，将诱导培养基、继代培养基的植物浸出液成分省去，即诱导培养基成分为COD含量为800mg/L的20％木薯酒精废液，4.0g/L的蔗糖溶液，8.0g/L的琼脂，0.5mg/L的吲哚丁酸；继代培养基成分为：COD含量为1000mg/L的20％木薯酒精废液，8.0g/L的蔗糖溶液，10.0g/L的琼脂；形成培养基中植物浸出液的空白试验，统计并计算在继代培养前外植体及继代培养后生根苗移植进营养杯前5cm生根苗成活情况。
实验结果分析：
1、成活率：
统计并计算实施例1-3和对照组1的继代培养前外植体成活率；统计并计算对照组1-3和对照组2、对照组3的继代培养前外植体成活率，继代培养后生根苗移栽进营养杯前5cm生根苗成活率，香蕉幼苗移栽定植后10d、20d、30d成活率，具体情况见表1。
表1香蕉组培成活情况
实施例1-3的成活率比对照组1高，说明使用植物处理液进行消毒可提高植物外植体成活率；实施例1-3的成活率与对照组2的外植体成活率、5cm生根苗成活率无明显区别，说明木薯酒精废液与常用的组培MS培养基成分相近，能够保证组培苗、外植体的成活率，可以替代MS培养基，但是对照组2苗木成活率明显低于实施例1-3的成活率说明用木薯酒精废液制成的培养基香蕉苗质量更好；实施例1-3的各成活率比对照组3高，说明在诱导培养与继代培养中植物浸出液能进行有效消毒，提高组培苗、外植体、移栽的成活率。
2、组培苗生长情况：
随机抽取100个香蕉外植体为样本，将实施例1-3和对照组1的香蕉外植体的染菌情况；随机抽取100个香蕉生根苗为样本，将实施例1-3和对照组2、对照组3的生根苗的根系生长情况进行对比，统计生根苗的根数、测量生根苗的根长和根粗具体情况见表2。
表2组培苗生长情况表
样本源 染菌数(株) 平均根长cm 最长跟cm 平均根粗mm 最粗根mm 根数
实施例1 8 5.44 8.47 0.56 0.70 7.12
实施例2 7 5.42 8.56 0.54 0.72 6.91
实施例3 5 5.41 8.45 0.56 0.71 7.02
对照组1 20 5.22 8.01 0.51 0.69 6.98
对照组2 9 2.11 3.12 0.20 0.34 4.15
对照组3 14 5.32 8.98 0.50 0.71 6.97
实施例1-3的染菌数明显低于对照组1，说明植物处理液能对外植体进行消毒，提高植物外植体成活率；实施例1-3、对照组1、对照组3的根长、根粗、根数明显大于对照组2，说明木薯酒精废液能明显提高香蕉幼苗的质量。
综上所述，本发明的组织培养方法是一种能提香蕉外植体成活率，不会对外植体进行侵害，同时还能降低成本的组培方法。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围。

Claims (4)

1.一种提高香蕉成活率的组织培养方法，其特征在于，该组织培养方法包括以下步骤：
(1)培养前20h-24h对培养室进行灭菌消毒；
(2)外植体的选择：选择香蕉吸芽为外植体，长2cm-3cm，直径1cm-2cm；
(3)外植体的灭菌：外植体经过水冲洗、75％的酒精浸泡沥干后，在质量浓度为5％-8％的植物处理液中浸泡10min-20min进行灭菌，所述植物处理液的组成及重量百分比为：30％-50％的灵芝浸出液、10％-20％的辣蓼草汁、10％-20％的大蒜汁、10％-20％的洋葱汁、5％-10％的藿香汁、5％-10％的仙人掌汁。
(4)初始诱导培养：将灭菌后的外植体接种在诱导培养基中在培养箱中进行诱导培养，培养温度为26℃-28℃，用5红3绿2蓝光质的LED光灯进行光照，光照强度为400Lx-1000Lx，光照时间为20h-25h；
(5)继代培养：将诱导培养后长出新芽的外植体转接入继代培养基中在培养箱中进行继代培养，培养温度为26-28℃，用4红3绿3白LED光灯进行光照，光照强度为600Lx-1200Lx，光照时间为20h-25h，随着外植体的生长不断更换培养基，继代培养4-6代后将长成生根苗的幼苗转接到放有培养基质的营养杯中进行培养；
(6)炼苗：将营养杯中的香蕉幼苗放在大棚中进行炼苗，炼苗温度为24℃-28℃，光照为日光照射；
所述步骤(4)的诱导培养基组成为：COD含量为300mg/L-800mg/L的15％-20％木薯酒精废液，2.0g/L-4.0g/L的蔗糖溶液，5.0g/L-8.0g/L的灵芝浸出液，5.0g/L-8.0g/L的香蕉叶汁，2.0g/L-5.0g/L的辣蓼草汁，5.0g/L-8.0g/L的琼脂，0.1mg/L-0.5mg/L的吲哚丁酸；
所述步骤(5)的继代培养基组成为：COD含量为500mg/L-1000mg/L的15-20％木薯酒精废液，5.0g/L-8.0g/L的蔗糖溶液，5g/L-10g/L的灵芝浸出液，5.0g/L-10.0g/L的辣蓼草汁，6.0g/L-10.0g/L的琼脂。
2.根据权利要求1所述的一种提高香蕉成活率的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(5)营养杯中的培养基质的质量百分比组成为：40％-60％的椰糠、20％-30％的稻杆，10％-20％的黄沙，5％-10％的有机肥。
3.根据权利要求1所述的一种提高香蕉成活率的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(4)的LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-红-蓝-红-绿-蓝-红-绿-红”。
4.根据权利要求1所述的一种提高香蕉成活率的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(5)的LED灯安装在暗箱顶部，为单色LED灯管，灯管进行间隔排列，排列顺序为“红-绿-白-红-绿-白-红-绿-白-红”。
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Assignor: Guangxi County Lu Chuan Wu Ni Po guava professional cooperatives

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Denomination of invention: Tissue culture method for improving survival rate of bananas

Granted publication date: 20171027

License type: Common License

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