CN108990799B - 一种利用新生侧芽高效获得杂交兰无菌材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用新生侧芽高效获得杂交兰无菌材料的方法，该方法涉及植物组织培养领域。本发明创建了一种提高杂交兰新芽中的小侧芽成活率的方法，通过灭菌剂的联合使用，降低无菌消毒过程中的污染率，提高小侧芽的获得率，为杂交兰育种中特异单株的种苗扩繁奠定基础。本发明以杂交兰新芽产生的小侧芽为外植体来获得无菌材料，不仅能够降低污染率，还能提高成活率，对于杂交兰特异单株的种苗扩繁具有重要意义。

Description

一种利用新生侧芽高效获得杂交兰无菌材料的方法
技术领域
本发明公开了一种利用新生侧芽高效获得杂交兰无菌材料的方法，该方法涉及植物组织培养领域。
背景技术
杂交兰，是国兰与大花蕙兰种间杂交获得的优良杂交后代，与亲本相比，不论在观赏性、适应性，还是生产和经济效益方面，都具备很明显的优势。杂交兰不但继承了国兰的优雅姿态、浓郁幽香，还兼具大花蕙兰的花色艳、花朵大、花数多等优点，且株型大小适中，叶态飘逸，花叶共赏。杂交兰的适应性更强，可实现平地越夏，易于种植养护，经济效益更好。因此，杂交兰近年来在国内外兰花产业中发展势头迅猛。然而，目前国内市场上流通的杂交兰品种基本上由国外进口，走向商品化的自育品种几乎为零，种苗源头受制于人，花农和企业生产经营成本过高，且进口品种在本地气候的适应性不尽如人意。因此，培育出具有自主知识产权的适栽新品种，才能保证我国杂交兰产业的良性、有序发展。
在杂交兰育种过程中，种苗扩繁是非常关键的一步。在选育出符合育种目标的特异单株后，需以该单株为亲本进行营养繁殖，扩大种苗数量，从而形成一个株系。杂交兰通过组织培养方式进行种苗扩繁，可大幅提高繁殖系数，不仅速度快，且成苗整齐，品质好。现有技术中，以单株为基础扩繁种苗主要以新生芽的茎尖组织为外植体诱导原球茎或根状茎途径，原球茎或根状茎成倍增殖、分化后形成大量完整植株，从而实现种苗扩繁的目的。在此过程中，有时选育的目标单株只有特异的1个或少量单株，育种材料相当宝贵，因此，以该单株为母株进行种苗扩繁过程中，控制外植体的污染，减少育种材料损失，保证取材的成功率尤为重要。
本申请的发明人实际试验了很多年，污染率是很高的，尤其是多年生植株。但发现采用侧芽就明显降低污染率，而且侧芽数量也多，对于珍稀植株特别像只有1株的情况，降低污染非常重要。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种利用新生侧芽高效获得杂交兰无菌材料的方法。
本方法的实施步骤为：
1.前处理。取材前1周，杂交兰植株用800倍多菌灵溶液灌根处理2次，间隔3天，并保证外植体取材时植株干燥。
2.取样。从健壮母株上选取长势健康的新生芽，去除杂质和污物，带回实验室。
3.表面清洁。剥去老叶，刮除根基部污物，用蘸有洗洁精的软毛刷刷洗外植体表面，冲洗后浸入75％酒精中数秒，浸入浓肥皂水中，震荡清洗1小时，流水冲洗1小时。
4.无菌消毒。用吸水纸吸干外植体的表面的水分，转移至超净工作台进行灭菌处理，采用酒精、升汞、次氯酸钠等消毒剂联合灭菌。具体操作方法为：将新芽浸入75％酒精1分钟，取出后无菌水清洗3次；剥去1-2片外苞叶，浸入10％次氯酸钠消毒10分钟，之后无菌水清洗3次，每次1分钟；浸入0.1％升汞消毒16分钟，之后无菌水清洗5次，每次1分钟；层层剥离叶片，剥取每层的小侧芽，茎尖也一并保留，用0.05％升汞浸泡20秒，之后无菌水清洗6次，每次1分钟。
5.接种。将剥离的小侧芽和茎尖分别接种于原球茎诱导培养基：1/2MS+1.0mg/LNAA+1.0mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂+1g/L活性炭，50mL三角瓶每瓶接种1个外植体。
本发明创建了一种提高杂交兰新芽中的小侧芽成活率的方法，通过灭菌剂的联合使用，降低无菌消毒过程中的污染率，提高小侧芽的获得率，为杂交兰育种中特异单株的种苗扩繁奠定基础。本发明主要解决传统以茎尖组织为外植体繁殖杂交兰种苗过程中污染严重、无菌茎尖获得率低、死亡率高等问题。
与传统的以茎尖组织为外植体相比，取新芽中的小侧芽作为外植体具有一定的优势：
1.操作简便。杂交兰为多年生植株，比一二年生植物更容易染菌，且茎尖生长点在新芽的最里层，外围由叶片层层包裹，在剥离取材的过程中操作步骤繁多，增加了污染几率。而小侧芽生长于苞叶之间，切取过程方便快捷，减少染菌机会；
2.数量更多。杂交兰的1个新芽只有1个茎尖组织，相比之下，一个新芽往往带有2～4个小侧芽，取小侧芽的成功率可提高2～3倍，尤其适用于母株数量较少的情况；
3.组织完整。小侧芽组织相对完整，未经切割伤害，较裸露的茎尖组织更易存活，且污染率更低。
综上所述，以杂交兰新芽产生的小侧芽为外植体来获得无菌材料，不仅能够降低污染率，还能提高成活率，对于杂交兰特异单株的种苗扩繁具有重要意义。
附图说明
图1获取杂交兰小侧芽流程图。
其中，A：完整的杂交兰新生芽；B：剥去1～2片外苞叶，露出1个小侧芽；C：继续剥去1片外苞叶，露出2个小侧芽；D：继续剥去1片外苞叶，露出4个小侧芽；E：小侧芽与茎尖生长点侧面；F：小侧芽与茎尖生长点正面。
具体实施方式
实施例：
1.前处理。取材前1周，杂交兰植株用800倍多菌灵溶液灌根处理2次，间隔3天，并保证外植体取材时植株干燥。
2.取样。从健壮母株上选取长势健康的新生芽，去除杂质和污物，带回实验室。
3.表面清洁。剥去老叶，刮除根基部污物，用蘸有洗洁精的软毛刷刷洗外植体表面，冲洗后浸入75％酒精中数秒，浸入浓肥皂水中，震荡清洗1小时，流水冲洗1小时。
4.无菌消毒。用吸水纸吸干外植体的表面的水分，转移至超净工作台进行灭菌处理，采用酒精、升汞、次氯酸钠等消毒剂联合灭菌。具体操作流程和每种消毒剂的浸泡时间见表1。
5.接种。将剥离的小侧芽和茎尖分别接种于原球茎诱导培养基：1/2MS+1.0mg/LNAA+1.0mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂+1g/L活性炭，50mL三角瓶每瓶接种1个外植体。
表1外植体的灭菌方法
Figure BDA0001742246400000031
所得数据显示(表2)，在10％次氯酸钠灭菌时间不变的情况下，随着0.1％升汞消毒时间的延长(W1～W3)，茎尖和小侧芽的污染率都呈下降趋势；同样，在0.1％升汞灭菌时间不变的情况下，随着10％次氯酸钠消毒时间的延长(W4～W7)，茎尖和小侧芽的污染率也大致呈下降趋势；死亡率均不表现出明显的规律，大部分方法都能控制在30％以内。茎尖的污染率普遍偏高，各方法都达到半数以上；相比之下，小侧芽的污染率较低，各方法均控制在51.92％以下。其中，灭菌方法W7和W3的小侧芽污染率和死亡率较低，优选W3，小侧芽污染率和死亡率均为最低，分别为15.00％和11.67％，是杂交兰小侧芽灭菌的理想方法，进而取得无菌材料用于后续种苗扩繁。
表2不同灭菌方法的外植体污染和死亡情况
Figure BDA0001742246400000041
。

Claims (1)

1.一种利用新生侧芽高效获得杂交兰无菌材料的方法，其特征在于：具体的实施步骤为：
1)前处理：取材前1周，杂交兰植株用800倍多菌灵溶液灌根处理2次，间隔3天，并保证外植体取材时植株干燥；
2)取样：从健壮母株上选取长势健康的新生芽，去除杂质和污物，带回实验室；
3)表面清洁：剥去老叶，刮除根基部污物，用蘸有洗洁精的软毛刷刷洗外植体表面，冲洗后浸入75%酒精中数秒，浸入浓肥皂水中，震荡清洗1小时，流水冲洗1小时；
4)无菌消毒：用吸水纸吸干外植体的表面的水分，转移至超净工作台进行灭菌处理，采用酒精、升汞、次氯酸钠联合灭菌；
5)接种：将剥离的小侧芽和茎尖分别接种于原球茎诱导培养基：1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+100 ml/L椰汁+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+1 g/L活性炭，50 mL三角瓶每瓶接种1个外植体；
所述步骤4）具体操作方法为：将新芽浸入75%酒精1分钟，取出后无菌水清洗3次；剥去1-2片外苞叶，浸入10%次氯酸钠消毒10分钟，之后无菌水清洗3次，每次1分钟；浸入0.1%升汞消毒16分钟，之后无菌水清洗5次，每次1分钟；层层剥离叶片，剥取每层的小侧芽，茎尖也一并保留，用0.05%升汞浸泡20秒，之后无菌水清洗6次，每次1分钟。
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