CN107637520A - 一种湖北海棠的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种湖北海棠的组织培养方法，包含外植体的消毒处理、初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽这五个步骤。本发明的优点在于利用组织培养快速繁殖技术，保留了原有母株的优良性状，繁殖后代整齐一致，且能有效且快速地增加湖北海棠的繁殖系数，缩短了繁殖周期，同时保证了较高的湖北海棠的移栽成活率，使其不仅能满足南方地区对湖北海棠的市场需求，又有利于湖北海棠野生资源的保护；另外，培养方法易于操作，需要投入的人力和时间成本低，有利于在市场上推广。

Description

一种湖北海棠的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体涉及一种湖北海棠的组织培养方法。

背景技术

湖北海棠(Malus hupehensis)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)植物，在中国广泛分布，不仅具有重要的观赏价值和药食兼用价值，而且由于生长强健、抗性强、适应范围广，在中国黄河流域以南地区常作为苹果属优良砧木。由于天然林的过度开发利用，湖北海棠的天然群落遭到了严重破坏，野生资源存量急剧下降。1997年世界自然保护联盟(IUCN)就已经把湖北海棠列入濒危物种。因此对湖北海棠这一种质资源进行有效的保存、高效的繁殖已经成为一个日趋紧迫的问题。

尽管湖北海棠具有无融合生殖现象，但个体间仍存在差异，播种后代存在一定的分化现象，因此无性繁殖技术对湖北海棠的良种选育和良种的无性化推广具有重要意义。目前对湖北海棠的无性繁殖研究主要是采用植物扦插繁殖技术，但成活率不高，为推动湖北海棠优良无性系的选育和大规模的育苗生产，有必要对湖北海棠组织培养技术进行发明创造。

发明内容

本发明的目的在于提供一种湖北海棠组织培养方法，旨在解决湖北海棠播种育苗个体间存在差异、繁殖效率低等问题，为湖北海棠种质资源的保存，快速、高效繁殖提供重要参考。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种湖北海棠的组织培养方法，包含以下步骤：

S₁、外植体的消毒处理：选取一年生湖北海棠实生苗半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉溶液浸泡30min，并用软毛刷刷洗表面脏污，然后流水冲洗2h后置于超净工作台中，用质量浓度为0.1％的HgCl₂溶液消毒7min，再用无菌水冲洗5次，冲洗完后切除茎段与药液接触的部分，在无菌滤纸上切成1～2cm的茎段；

S₂、初代培养：将步骤S₁处理后的1～2cm茎段接种到诱导培养基上进行初代培养，直至外植体腋芽萌发，长成2～3cm的植株，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx，并定期喷洒酒精；

S₃、继代培养：将步骤S₂获得的植株接种到增殖培养基上进行继代培养，得到丛生芽，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₄、生根培养：将步骤S₃过程获得的高度为2～3cm的丛生芽分切接种到生根培养基进行生根培养，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₅、炼苗移栽：当根长到2～3cm时，将培养瓶敞口放置，炼苗3～5d得到试管苗，用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗去残留在根部的培养基，保证根部的完整性，再用质量浓度为0.1％的多菌灵对试管苗根部进行蘸根处理后移栽到基质中，放在温室中，并每天喷雾浇水。

进一步改进在于，在HgCl₂消毒和无菌水冲洗过程中，轻轻摇晃无菌瓶，使液体与外植体充分接触。

进一步改进在于，步骤S₅中所述的基质由珍珠岩和蛭石混合组成，且珍珠岩和蛭石的质量比为1:1。

进一步改进在于，步骤S₅中所述的基质在使用前两天用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液对使用基质进行消毒。

进一步改进在于，步骤S₂所述的诱导培养基为：MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂+2.0g·L^-1PVP。

进一步改进在于，步骤S₃所述的增殖培养基为：MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^{- 1}IBA+30g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂+0.5g·L^-1PVP。

进一步改进在于，步骤S₄所述的生根培养基为：1/2MS+0.6mg·L^-1NAA+0.7mg·L^{- 1}IBA+15g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂。

本发明的有益效果是：利用组织培养快速繁殖技术，保留了原有母株的优良性状，繁殖后代整齐一致，且能有效且快速地增加湖北海棠的繁殖系数，缩短了繁殖周期，同时保证了较高的湖北海棠的移栽成活率，使其不仅能满足南方地区对湖北海棠的市场需求，又有利于湖北海棠野生资源的保护；另外，培养方法易于操作，需要投入的人力和时间成本低，有利于在市场上推广。

附图说明

图1是实施例1中湖北海棠继代培养形成的丛生芽；

图2是实施例1中湖北海棠已形成的肉质根系。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示和实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

一种湖北海棠的组织培养方法，包含以下步骤：

S₁、外植体的消毒处理：在3月初，选取健壮的一年生湖北海棠实生苗半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉溶液浸泡30min，并用软毛刷刷洗表面脏污，然后流水冲洗2h后置于超净工作台中，用质量浓度为0.1％的HgCl₂溶液消毒7min，再用无菌水冲洗5次，冲洗完后切除茎段与药液接触的部分，在无菌滤纸上切成1～2cm的茎段；

S₂、初代培养：将步骤S₁处理后的1～2cm茎段接种到诱导培养基上进行初代培养，直至外植体腋芽萌发，萌芽率90.0％，长成2～3cm的植株，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx，并定期喷洒酒精，培养期间及时取出被污染的培养瓶；

S₃、继代培养：将步骤S₂获得的植株接种到增殖培养基上进行继代培养，得到丛生芽，如图1所示，增值系数为3.80，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₄、生根培养：将步骤S₃过程获得的高度为2～3cm的丛生芽分切接种到生根培养基进行生根培养，如图2所示，诱导生根率100％，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₅、炼苗移栽：当根长到2～3cm时，将培养瓶敞口放置，炼苗3～5d得到试管苗，用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗去残留在根部的培养基，保证根部的完整性，再用质量浓度为0.1％的多菌灵对试管苗根部进行蘸根处理后移栽到基质中，放在温室中，并每天喷雾浇水。移栽成活率达到85.0％。

实施例2

一种湖北海棠的组织培养方法，包含以下步骤：

S₁、外植体的消毒处理：在3月初，选取健壮的一年生湖北海棠实生苗半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉溶液浸泡30min，并用软毛刷刷洗表面脏污，然后流水冲洗2h后置于超净工作台中，用质量浓度为0.1％的HgCl₂溶液消毒7min，再用无菌水冲洗5次，冲洗完后切除茎段与药液接触的部分，在无菌滤纸上切成1～2cm的茎段；

S₂、初代培养：将步骤S₁处理后的1～2cm茎段接种到诱导培养基上进行初代培养，直至外植体腋芽萌发，萌芽率66.7％，长成2～3cm的植株，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx，并定期喷洒酒精，培养期间及时取出被污染的培养瓶；

S₃、继代培养：将步骤S₂获得的植株接种到增殖培养基上进行继代培养，得到丛生芽，增值系数为2.87，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₄、生根培养：将步骤S₃过程获得的高度为2～3cm的丛生芽分切接种到生根培养基进行生根培养，诱导生根率83.3％，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₅、炼苗移栽：当根长到2～3cm时，将培养瓶敞口放置，炼苗3～5d得到试管苗，用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗去残留在根部的培养基，保证根部的完整性，再用质量浓度为0.1％的多菌灵对试管苗根部进行蘸根处理后移栽到基质中，放在温室中，并每天喷雾浇水。移栽成活率达到85.0％。

实施例3

一种湖北海棠的组织培养方法，包含以下步骤：

S₁、外植体的消毒处理：在3月初，选取健壮的一年生湖北海棠实生苗半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉溶液浸泡30min，并用软毛刷刷洗表面脏污，然后流水冲洗2h后置于超净工作台中，用质量浓度为0.1％的HgCl₂溶液消毒7min，再用无菌水冲洗5次，冲洗完后切除茎段与药液接触的部分，在无菌滤纸上切成1～2cm的茎段；

S₂、初代培养：将步骤S₁处理后的1～2cm茎段接种到诱导培养基上进行初代培养，直至外植体腋芽萌发，萌芽率80.0％，长成2～3cm的植株，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx，并定期喷洒酒精，培养期间及时取出被污染的培养瓶；

S₃、继代培养：将步骤S₂获得的植株接种到增殖培养基上进行继代培养，得到丛生芽，增值系数为2.77，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₄、生根培养：将步骤S₃过程获得的高度为2～3cm的丛生芽分切接种到生根培养基进行生根培养，诱导生根率100.0％，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₅、炼苗移栽：当根长到2～3cm时，将培养瓶敞口放置，炼苗3～5d得到试管苗，用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗去残留在根部的培养基，保证根部的完整性，再用质量浓度为0.1％的多菌灵对试管苗根部进行蘸根处理后移栽到基质中，放在温室中，并每天喷雾浇水。移栽成活率达到85.0％。

上述各实施例在HgCl₂消毒和无菌水冲洗过程中，均轻轻摇晃无菌瓶，使液体与外植体充分接触。

上述各实施例步骤S₅中的基质均由珍珠岩和蛭石混合组成，且珍珠岩和蛭石的质量比为1:1。

上述各实施例步骤S₅中的基质均在使用前两天用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液对使用基质进行消毒。

上述各实施例步骤S₂中的诱导培养基均为：MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂+2.0g·L^-1PVP。

上述各实施例步骤S₃中的增殖培养基均为：MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1IBA+30g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂+0.5g·L^-1PVP。

上述各实施例步骤S₄中的生根培养基均为：1/2MS+0.6mg·L^-1NAA+0.7mg·L^-1IBA+15g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于，包含以下步骤：

S₁、外植体的消毒处理：选取一年生湖北海棠实生苗半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉溶液浸泡30min，并用软毛刷刷洗表面脏污，然后流水冲洗2h后置于超净工作台中，用质量浓度为0.1％的HgCl₂溶液消毒7min，再用无菌水冲洗5次，冲洗完后切除茎段与药液接触的部分，在无菌滤纸上切成1～2cm的茎段；

S₂、初代培养：将步骤S₁处理后的1～2cm茎段接种到诱导培养基上进行初代培养，直至外植体腋芽萌发，长成2～3cm的植株，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx，并定期喷洒酒精；

S₃、继代培养：将步骤S₂获得的植株接种到增殖培养基上进行继代培养，得到丛生芽，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₄、生根培养：将步骤S₃过程获得的高度为2～3cm的丛生芽分切接种到生根培养基进行生根培养，且培养室温度23～27℃，空气相对湿度50～60％，光照时间为12h·d^-1，光照强度1500lx；

S₅、炼苗移栽：当根长到2～3cm时，将培养瓶敞口放置，炼苗3～5d得到试管苗，用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗去残留在根部的培养基，保证根部的完整性，再用质量浓度为0.1％的多菌灵对试管苗根部进行蘸根处理后移栽到基质中，放在温室中，并每天喷雾浇水。

2.根据权利要求1所述的一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于：在HgCl₂消毒和无菌水冲洗过程中，轻轻摇晃无菌瓶，使液体与外植体充分接触。

3.根据权利要求1所述的一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于：步骤S₅中所述的基质由珍珠岩和蛭石混合组成，且珍珠岩和蛭石的质量比为1:1。

4.根据权利要求1或3所述的一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于：步骤S₅中所述的基质在使用前两天用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液对使用基质进行消毒。

5.根据权利要求1所述的一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于：步骤S₂所述的诱导培养基为：MS+1.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂+2.0g·L^{- 1}PVP。

6.根据权利要求1所述的一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于：步骤S₃所述的增殖培养基为：MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1IBA+30g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂+0.5g·L^{- 1}PVP。

7.根据权利要求1所述的一种湖北海棠的组织培养方法，其特征在于：步骤S₄所述的生根培养基为：1/2MS+0.6mg·L^-1NAA+0.7mg·L^-1IBA+15g·L^-1蔗糖+7.0g·L^-1琼脂。