CN105123524B - 一种大丽花组培繁殖的种质保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大丽花组培繁殖的种质保存方法，包括以下技术环节：1）外植体的选材与低温预处理；2）接种；3）不定芽诱导并转接；4）慢生长保存种质；5）复壮；6）生根移栽。本发明提供的大丽花组培繁殖的种质保存方法对大丽花种质保存周期长达4年，同时还解决了种质保存占地面积大、费用高等问题，而且操作简便，技术稳定可靠，可重复性强，非常适合大规模大丽花种质的保存，是一种优良的大丽花种质资源保存方法。

Description

一种大丽花组培繁殖的种质保存方法

技术领域

本发明涉及一种大丽花组培繁殖的种质保存方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

大丽花（Dahlia pinnata Cav）为菊科大丽花属多年生球根花卉，全属约27种，又名大理菊、天竺牡丹、西番莲、洋芍药、大丽菊、地瓜花、红苕花等，原产墨西哥、哥伦比亚及危地马拉等国，后传到欧洲、日本和我国。大丽花茎杆粗壮，叶片肥大，花形与牡丹相似，花大而色彩艳丽，具有花姿优美、花型多样、花期长、品种繁多等特点，被誉为花卉中的宠儿。大丽花系天然种间杂交，人工选育的历史不长，世界各国普遍栽培，目前在东北、西北、华北等地栽培较广泛，其中在广东秋、冬两季栽培比较多。经过人工杂交选择，成为异源八倍体，新品种层出不穷，花色娇艳，花期长，适应性强，易于栽培，故一跃成为世界名花。目前大丽花是墨西哥的国花，西雅图的市花，我国吉林省的省花，张家口、赤峰、包头（小丽花）等城市的市花，大丽花象征大方、富丽，大吉大利，是世界著名的观赏花卉。

大丽花常用分株繁殖，但每株每年仅可分出5-6个新株，无法满足产业化生产的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代积累，从而造成大丽花品种退化严重。除了分株繁殖，造成大丽花品种退化的原因还包括：栽培环境如光照、水分、温度、营养不适宜大丽花生长发育，土壤板结和盐渍化；连作土地的病原菌大量积累并复合浸染等，导致品种失去原有的典型性；在大丽花组织培养过程中，培养温度、增殖芽的继代代数以及激素浓度等因素都可能造成大丽花种苗发生无性变异。大丽花品种退化通常表现为花朵变小、过渡色多、花型紊乱、双秆现象、株高参差不齐、生活力下降、抗性和产量降低等。

目前，大丽花种质资源的保存大多采用田间栽培保存，但田间栽培保存存在以下局限性：光、温、水及病虫害控制较难，造成种质资源丧失；占地面积多，耗费人力、物力、财力巨大；长期无性繁殖过程中易出现人为混杂和种性退化等。组培繁殖的种质保存方法是花卉商品化推广的重要辅助，既可在长距离运输优良种苗，也可长时间保存优质种苗，防止种质退化。目前，还没有成熟的大丽花种质保存体系应用于大丽花的产业发展，因此针对现有大丽花保存人力、物力、空间耗费大、保种时间短的不足，因此建立一种适宜的、保存时间久、低成本的大丽花种质资源保存方法对大丽花的产业发展具有重要意义。

发明内容

为克服目前大丽花常规保存所存在的保存空间大、投入资源高、保存时间短等缺点，本发明建立了一种大丽花组培繁殖的种质保存方法，通过优化培养程序、培养条件和培养组分，大大提高了大丽花的保存质量和保存期间，大丽花种质保存周期可长达4年，而且操作简便，技术稳定可靠，可重复性强，非常适合大规模大丽花种质的保存。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种大丽花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于，它包括以下技术环节：

1）外植体的选材与低温预处理；2）接种；3）不定芽诱导并转接；4）慢生长保存种质；5）复壮；6）生根移栽。

该方法的详细步骤如下：

1）外植体的选材与低温预处理：

选择生长至现蕾期的、健壮无病、种质与亲本一致的大丽花整株，先用自来水冲洗掉根部泥土及其它表面杂物，然后用毛刷蘸取洗洁精洗一遍后接着用超纯水冲洗干净，将植株根部浸入装有8mg/L的KT溶液中，2℃低温预处理4-8天；

2）接种：

将大丽花用超纯水清洗后转移到超净工作台里，用70%酒精表面消毒15s，再用无菌水冲洗两次，然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10 min，再用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用解剖刀切割茎段后用镊子接种至装有培养基①的三角瓶中；

3）不定芽诱导并转接：培养室温度控制为26±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1600-2000Lx，光周期控制为光14h/暗10h，25-30天诱导出不定芽，然后将不定芽接种至培养基②中，将接种好的三角瓶放入培养箱中培养，培养箱温度控制为23-25℃，光照强度控制为1600-2000Lx、光周期控制为光14h/暗10h，培养5-8天；

4）慢生长保存种质：

将三角瓶转移到低温、弱光条件下缓慢生长，每培养10个月，继代接种一次，再低温培养；

5）复壮：

当需要大丽花恢复生长时，将三角瓶转移到温度控制为23-25℃、光照强度为1500-2000Lux，光周期为12h光/12h的培养箱中培养10-15天，获得健壮的大丽花幼苗；

6）生根移栽：

将大丽花幼苗转移到培养基③中，控制温度为23-25℃、湿度≥85%、光照强度为2000-3000lx、光周期为12h光/12h培养条件下生长10-15天诱导生根，然后炼苗移栽。

所述步骤1）中切割下接种的茎段长度为0.6-0.8cm。

所述步骤2）中的培养基①的配方为：MS +2.5mg/L6-BA+0.08NAA+3%蔗糖+6.5g/L植物凝胶，pH为5.8。

所述步骤3）中的培养基②的配方为：MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LGA+2.5mg/L氯化胆碱+4%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

所述步骤4）中的低温、弱光条件为：培养温度控制为5-8℃，光照强度控制为400-600lx，光周期控制为光12h/暗12h。

所述步骤6）中的培养基③的配方为：1/2MS+0.15mg/L NAA+1.5%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8。

所述步骤4）中的继代次数不超过5次。

本发明的有益效果：

（1）本发明采用大丽花茎段作为种质保存材料来源，取材容易，来源广阔，生长季节不受限制，为育种工作中的种质引进和保存提供了捷径；

（2）本发明通过控制组织培养条件，有效地延缓了大丽花种苗的生长，使得种质资源保存周期大大拉长，种质资源保存周期最长可达4年；

（3）与常规保种方法相比，本发明的原料成本降低、劳动力和培养保存空间减少，而且操作简便，从而大大降低了保种成本；

（4）与常规保种方法相比，本发明苗移栽成活率大大提高，可达95%以上。

附图说明

附图1为常规组培条件下大丽花品种亮剑生长1个月的示意图；

附图2为采用本发明的大丽花组培繁殖的种质保存方法，大丽花品种亮剑继代4次又生长8个月的示意图；

附图3为采用本发明的大丽花组培繁殖的种质保存方法，大丽花品种亮剑继代4次又生长8个月复壮并生根移栽时的状态示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。

实施例

2010年6月，选择大丽花品种亮剑按照本发明的技术路线进行组培繁殖的种质保存，详细步骤如下：

1）外植体的选材与低温预处理：

选择生长至现蕾期的、健壮无病、种质与亲本一致的大丽花品种亮剑的整株植株，先用自来水冲洗掉根部泥土及其它表面杂物，然后用毛刷蘸取洗洁精洗一遍后接着用超纯水冲洗干净，将植株根部浸入装有8mg/L的KT溶液中，2℃低温预处理6天；

2）接种：

将大丽花用超纯水清洗后转移到超净工作台里，用70%酒精表面消毒15s，再用无菌水冲洗两次，然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10 min，再用无菌水冲洗5次，滤纸吸干，用解剖刀切割茎段后用镊子接种至装有培养基①（配方为：MS +2.5mg/L6-BA+0.08NAA+3%蔗糖+6.5g/L植物凝胶，pH为5.8）的三角瓶中；

3）不定芽诱导并转接：

培养室温度控制为26±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，26天左右诱导出不定芽，然后将不定芽接种至培养基②（MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LGA+2.5mg/L氯化胆碱+4%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8）中，将接种好的三角瓶放入培养箱中培养，培养箱温度控制为24℃，光照强度控制为1800Lx、光周期控制为光14h/暗10h，培养7天，同时设置对照组，对照组继外植体选材、低温预、接种方式、培养基种类均相同，对照组不转移到低温弱光条件下而维持本培养条件，持续生长1个月，亮剑的生长状态如附图1；

4）慢生长保存种质：

将三角瓶转移到低温、弱光条件下，具体为培养箱温度控制为6℃、光照强度控制为500lx、光周期控制为光12h/暗12h，让亮剑不定芽缓慢生长，不定芽持续生长每满10个月，继代接种一次，再置于本培养条件下缓慢生长，亮剑继代4次又生长8个月的状态如附图2；

5）复壮：

亮剑种质继代4次又生长8个月后，将三角瓶转移到温度控制为23-25℃、光照强度为1500-2000Lux，光周期为12h光/12h的培养箱中培养15天，重新获得鲜活的幼苗；

6）生根移栽：

将亮剑幼苗转移到培养基③（配方为：1/2MS+0.15mg/L NAA+1.5%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8）中，控制温度为24℃、湿度≥85%、光照强度为2500lx、光周期为12h光/12h的培养条件下生长10天诱导生根，然后进行炼苗，此时亮剑生长恢复健壮，发育状态良好，如附图3，再移栽到装有基质的培养盆里，此时移栽成活率统计达95%。

以上实施例可以发现，采用本发明的大丽花组培繁殖的种质保存方法，通过控制组织培养条件，有效地延缓了大丽花种苗的生长，种质资源保存周期可长达4年，而且种质保存状态良好，材料经过复壮后植株鲜活，移栽成活率高达95%以上。本发明取材简单，来源便捷，劳动力和培养保存空间减少，而且操作简便，大大降低了保种成本，克服了常规大丽花种质资源保存的不足，而且技术稳定可靠，可重复性强，非常适合大规模大丽花种质的保存，是一种优良的大丽花种质资源保存方法。

本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。

Claims (3)

1.一种大丽花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于，它包括以下技术环节：

1）外植体的选材与低温预处理；2）接种；3）不定芽诱导并转接；4）慢生长保存种质；5）复壮；6）生根移栽；

该方法的详细步骤如下：

1）外植体的选材与低温预处理：

选择生长至现蕾期的、健壮无病、种质与亲本一致的大丽花整株，先用自来水冲洗掉根部泥土及其它表面杂物，然后用毛刷蘸取洗洁精洗一遍后接着用超纯水冲洗干净，将植株根部浸入装有8mg/L的KT溶液中，2℃低温预处理4-8天；

2）接种：

将大丽花用超纯水清洗后转移到超净工作台里，用70%酒精表面消毒15s，再用无菌水冲洗两次，然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用解剖刀切割茎段后用镊子接种至装有培养基①的三角瓶中；

3）不定芽诱导并转接：培养室温度控制为26±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1600-2000Lx，光周期控制为光14h/暗10h，25-30天诱导出不定芽，然后将不定芽接种至培养基②中，将接种好的三角瓶放入培养箱中培养，培养箱温度控制为23-25℃，光照强度控制为1600-2000Lx、光周期控制为光14h/暗10h，培养5-8天；

4）慢生长保存种质：

将三角瓶转移到低温、弱光条件下缓慢生长，每培养10个月，继代接种一次，再低温培养；

5）复壮：

当需要大丽花恢复生长时，将三角瓶转移到温度控制为23-25℃、光照强度为1500-2000Lux，光周期为12h光/12h的培养箱中培养10-15天，获得健壮的大丽花幼苗；

6）生根移栽：

将大丽花幼苗转移到培养基③中，控制温度为23-25℃、湿度≥85%、光照强度为2000-3000lx、光周期为12h光/12h培养条件下生长10-15天诱导生根，然后炼苗移栽；

所述步骤2）中的培养基①的配方为：MS+2.5mg/L6-BA+0.08NAA+3%蔗糖+6.5g/L植物凝胶，pH为5.8；

所述步骤3）中的培养基②的配方为：MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LGA+2.5mg/L氯化胆碱+4%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8；

所述步骤6）中的培养基③的配方为：1/2MS+0.15mg/L NAA+1.5%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8；

所述步骤4）中的低温、弱光条件为：培养温度控制为5-8℃，光照强度控制为400-600lx，光周期控制为光12h/暗12h。

2.根据权利要求1所述的大丽花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于：所述步骤2）中的茎段长度为0.6-0.8cm。

3.根据权利要求1所述的大丽花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于：所述步骤4）中的继代次数不超过5次。