CN104663459A

CN104663459A - 一种无患子组培快繁方法

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Publication number: CN104663459A
Application number: CN201510124023.8A
Authority: CN
Inventors: 黎有辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-03-22
Filing date: 2015-03-22
Publication date: 2015-06-03

Abstract

本发明公开了一种无患子组培快繁方法，无患子（Sspindus mukurossi）又名肥皂树，是落叶乔木，主要靠种子播种繁殖，但其种皮坚硬，蛀虫率高，而且出苗不整齐，周期长。组织培养能够弥补种子繁殖的不足，不仅能保持母株优良特性不变，而且繁殖速度快，繁殖系数高，可降低生产成本，满足大规模种植无患子的需求。以无患子带节茎段为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了无患子离体再植株，建立无患子组织培养快速繁殖技术体系，为无患子的规模化育苗提供一条有效途径，为无患子苗木的工厂化生产及应用奠定基础。

Description

一种无患子组培快繁方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种无患子组培快繁方法。

背景技术

无患子（Sspindus mukurossi）又名肥皂树,是无患子科的高大落叶乔木，是重要的天然肥皂来源。主要分布于淮河流域以南以及广东、福建、台湾、广西、云南等地,分布地域广阔。无患子树形高大,树干通直,树冠浓密，枝叶广展,叶形奇特,姿态优美。秋季满树叶色金黄,橙黄色的果实缀满枝头,观赏效果极好,是目前新兴的园林观叶、观果树种。在城市道路上种植无患子为绿化植物,也是一道很美的城市风景线,大规模栽培无患子树,能有效地绿化治理荒山,也是绿化造林的首选树种。无患子不仅是优良的园林色叶绿化树种,而且它的木材、嫩叶、果核、果肉、种仁等在医药、日化、工艺品、能源开发等方面都有较高的经济价值,是一种具有广阔开发利用前景的经济树种,已引起国内外专家的高度重视。但是,由于无患子的开发研究才刚刚开始,仍存很多问题亟待解决。

由于人为乱砍伐、自然破坏及物种退化等原因,目前野生无患子数量急剧减少,百年无患子古树极为稀有。无患子是落叶乔木,主要靠种子播种繁殖,其种皮骨质,坚硬,属硬实种子,在自然条件下,蛀虫率高,萌发率很低,而且出苗不整齐，出苗周期长,严重限制了无患子的自然更新和产业化应用。目前,人工种植的无患子大多使用天然种源的实生苗,而良种筛选、培育研究基础薄弱,导致良种选育相对滞后,良种优苗供应缺乏,难以保证连续性高产。

组织培养能够弥补种子繁殖的不足，减少对外界自然环境的依赖程度，不仅能保持母株优良特性不变，而且繁殖速度快，繁殖系数高，可降低生产成本，满足大规模种植无患子的需求。因此，本发明以无患子带节茎段为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了无患子离体再植株，建立无患子组织培养快速繁殖技术体系，为无患子的规模化育苗提供一条有效途径，为无患子苗木的工厂化生产及应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供出一种无患子组培快繁方法，本发明以川百合鳞茎为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了川百合离体再植株，建立川百合组织培养快速繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种无患子组培快繁方法，包括以下的步骤：

（1）外植体消毒：在连续晴天3天以上、枝条无露水时进行取样，取样时间在上午9～10时。取无患子当年生枝条上的幼嫩带腋芽的茎段为外植体，清水洗去表面的污垢，在3%洗衣粉稀释液中浸泡30min以上，后在流动水下冲洗2h以上，转到超净工作台上，作灭菌处理。先用70%～80%乙醇溶液浸泡20s～60s，无菌水冲洗4～6次，再用0.1%～0.2%升汞溶液消毒5～15min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。最后将灭好菌的鳞片置于无菌的滤纸上吸干表面水分备用。

（2）不定芽诱导：剪取步骤（1）长约2cm带腋芽的茎段并接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照8～10小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为20～23℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养15天后统计污染率，45天后统计诱导率。

(3增殖培养：将诱导培养产生的不定芽从基部切割下来，剪成2cm左右的小段，接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照10～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计增殖情况。

（4）生根培养：选取经增殖培养得到的2cm以上组培苗接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计生根情况。

（5）炼苗移栽：选取长势良好、根系多又粗壮且株大于2 cm的组培苗进行炼苗。首先,将所选组培苗的瓶盖揭开,在组培室里炼苗1～3天,炼苗过程中,注意喷水保持湿度。然后将这些组培苗搬至炼苗室,炼苗2～5天。之后将小苗取出,洗净培养基,注意防止根系损伤。去掉部分叶片，较大的叶片剪去1/3。然后直接移栽或者在0.1%的多菌灵溶液中浸泡20 min后栽植到由河沙:泥炭土:腐殖质＝2:1:1混合成的基质中，移栽30天后统计成活率。

上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+0.01～0.1mg/LIBA+2.0～6.0mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

上述步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

上述步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～1.0mg/LIBA+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

本发明与现有技术相比的有益效果是：通过组织培养能够弥补种子繁殖的不足，减少对外界自然环境的依赖程度，不仅能保持母株优良特性不变，而且繁殖速度快，繁殖系数高，可降低生产成本，满足大规模种植无患子的需求。以无患子带节茎段为外植体，通过不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程成功获得了无患子离体再植株，建立无患子组织培养快速繁殖技术体系，为无患子的规模化育苗提供一条有效途径，为无患子苗木的工厂化生产及应用奠定基础。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1

（1）外植体消毒：在连续晴天3天以上、枝条无露水时进行取样，取样时间在上午9～10时。取无患子当年生枝条上的幼嫩带腋芽的茎段为外植体，清水洗去表面的污垢，在3%洗衣粉稀释液中浸泡30min以上，后在流动水下冲洗2h以上，转到超净工作台上，作灭菌处理。先用70%乙醇溶液浸泡60s，无菌水冲洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒8min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。最后将灭好菌的鳞片置于无菌的滤纸上吸干表面水分备用。

（2）不定芽诱导：剪取步骤（1）长约2cm带腋芽的茎段并接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照8小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为20℃，空气相对湿度为75%的条件下培养15天后污染率10.5%，培养45天诱导率为94.1%。所述的诱导培养基为：MS+0.05mg/LIBA+4.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+19g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.5。

(3增殖培养：将诱导培养产生的不定芽从基部切割下来，剪成2cm左右的小段，接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为4.2，且没有愈伤组织形成，芽体最健壮，苗的长势较好。所述的增殖培养基为：MS+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/L IBA+27g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.5。

（4）生根培养：选取经增殖培养得到的2cm以上组培苗接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天生根90.47%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.6mg/LIBA+0.6mg/L NAA+23g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.5。

（5）炼苗移栽：选取长势良好、根系多又粗壮且株大于2cm的组培苗进行炼苗。首先,将所选组培苗的瓶盖揭开,在组培室里炼苗1天,炼苗过程中,注意喷水保持湿度。然后将这些组培苗搬至炼苗室,炼苗2天。之后将小苗取出,洗净培养基,注意防止根系损伤。去掉部分叶片，较大的叶片剪去1/3。然后在0.1%的多菌灵溶液中浸泡20 min后栽植到由河沙:泥炭土:腐殖质＝2:1:1混合成的基质中，移栽30天后成活率达到90%以上。

实施例2

（1）外植体消毒：在连续晴天3天以上、枝条无露水时进行取样，取样时间在上午9～10时。取无患子当年生枝条上的幼嫩带腋芽的茎段为外植体，清水洗去表面的污垢，在3%洗衣粉稀释液中浸泡30min以上，后在流动水下冲洗2h以上，转到超净工作台上，作灭菌处理。先用75%乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，再用0.15%升汞溶液消毒5min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止。最后将灭好菌的鳞片置于无菌的滤纸上吸干表面水分备用。

（2）不定芽诱导：剪取步骤（1）长约2cm带腋芽的茎段并接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养。接种后置于每天光照10小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为21℃，空气相对湿度为75%的条件下培养15天后污染率7.6%，培养45天诱导率为91.9%。所述的诱导培养基为：MS+0.1mg/LIBA+6.0mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+23g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.8。

(3增殖培养：将诱导培养产生的不定芽从基部切割下来，剪成2cm左右的小段，接种到增殖培养基上进行继代培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为4.6，且没有愈伤组织形成，芽体最健壮，苗的长势较好。所述的增殖培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+20g/L蔗糖+4.3g/L琼脂，pH为5.8。

（4）生根培养：选取经增殖培养得到的2cm以上组培苗接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天生根94.6%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.0mg/LIBA+0.4mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.8。

（5）炼苗移栽：选取长势良好、根系多又粗壮且株大于2cm的组培苗进行炼苗。首先,将所选组培苗的瓶盖揭开,在组培室里炼苗1天,炼苗过程中,注意喷水保持湿度。然后将这些组培苗搬至炼苗室,炼苗3天。之后将小苗取出,洗净培养基,注意防止根系损伤。去掉部分叶片，较大的叶片剪去1/3。然后在0.1%的多菌灵溶液中浸泡20 min后栽植到由河沙:泥炭土:腐殖质＝2:1:1混合成的基质中，移栽30天后成活率达到95.6%。

Claims

1.一种无患子组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）外植体消毒：在连续晴天3天以上、枝条无露水时进行取样，取样时间在上午9～10时，取无患子当年生枝条上的幼嫩带腋芽的茎段为外植体，清水洗去表面的污垢，在3%洗衣粉稀释液中浸泡30min以上，后在流动水下冲洗2h以上，转到超净工作台上，作灭菌处理，先用70%～80%乙醇溶液浸泡20s～60s，无菌水冲洗4～6次，再用0.1%～0.2%升汞溶液消毒5～15min，然后用无菌水冲洗外植体至无泡沫为止，最后将灭好菌的鳞片置于无菌的滤纸上吸干表面水分备用；

（2）不定芽诱导：剪取步骤（1）长约2cm带腋芽的茎段并接种到诱导培养基进行不定芽诱导培养，接种后置于每天光照8～10小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为20～23℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养15天后统计污染率，45天后统计诱导率；

增殖培养：将诱导培养产生的不定芽从基部切割下来，剪成2cm左右的小段，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照10～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计增殖情况；

（4）生根培养：选取经增殖培养得到的2cm以上组培苗接种至生根培养基中进行诱导生根，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养30天后统计生根情况；

（5）炼苗移栽：选取长势良好、根系多又粗壮且株大于2 cm的组培苗进行炼苗，首先,将所选组培苗的瓶盖揭开,在组培室里炼苗1～3天,炼苗过程中,注意喷水保持湿度，然后将这些组培苗搬至炼苗室,炼苗2～5天，之后将小苗取出,洗净培养基,注意防止根系损伤，去掉部分叶片，较大的叶片剪去1/3，然后直接移栽或者在0.1%的多菌灵溶液中浸泡20 min后栽植到由河沙:泥炭土:腐殖质＝2:1:1混合成的基质中，移栽30天后统计成活率。

2.根据权利要求1所述的一种无患子组培快繁方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+0.01～0.1mg/LIBA+2.0～6.0mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

3.根据权利要求1所述的一种无患子组培快繁方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

4.根据权利要求1所述的一种无患子组培快繁方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～1.0mg/LIBA+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。