CN109952957B - 一种海棠的组织培养方法以及培养基 - Google Patents

一种海棠的组织培养方法以及培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海棠的组织培养方法以及培养基，涉及海棠组织培养技术领域。本发明公开的海棠的组织培养方法其包括：芽诱导步骤；所述芽诱导步骤包括：将海棠外植体置于芽诱导培养基中以诱导形成不定芽；其中，所述芽诱导培养基具有如下成分：MS+0.18‑0.22mg/L TDZ+0.38‑0.42mg/L KT+0.8‑0.12mg/L NAA。该组织培养方法具有较低的污染率低以及较高的诱导率、增殖倍数和生根率，用于对海棠组织培养，可培养出大量的海棠植株，提高植株成活率，缩短育种周期。

Description

一种海棠的组织培养方法以及培养基
技术领域
本发明涉及海棠组织培养技术领域，具体而言，涉及一种海棠的组织培养方法以及培养基。
背景技术
‘冬红’海棠取自江苏省江都市仙女镇(东经119°55′，北纬32°42′)的南京林业大学海棠种质资源圃。在常规的育苗方式为播种育苗，一颗种子一般只能孕育一株植株。单粒种子只可诱导单株植株，育种周期长。但现有的海棠组织培养方法对‘冬红’海棠而言存在诱导率、增殖倍数和生根率低等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海棠的组织培养方法。该组织培养方法具有较低的污染率低以及较高的诱导率、增殖倍数和生根率，用于对海棠组织培养，可培养出大量的海棠植株，提高植株成活率，缩短育种周期。
本发明的另一目的在于提供一种用于海棠组织培养的培养基组合。该培养基组合可以用于海棠的组织培养，具有较低的污染率低以及较高的诱导率、增殖倍数和生根率，可培养出大量的海棠植株，提高植株成活率，缩短育种周期。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种海棠的组织培养方法，其包括：芽诱导步骤；上述芽诱导步骤包括：将海棠外植体置于芽诱导培养基中以诱导形成不定芽；
其中，上述芽诱导培养基具有如下成分：MS+0.18-0.22mg/L噻苯隆(N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-基脲，简称TDZ)+0.38-0.42mg/L激动素(KT)+0.8-0.12mg/L萘乙酸(NAA)；
优选的，上述海棠外植体为去除海棠种子的种皮后的胚。
种皮是在种子发育过程中进化来保护内部胚不受外界环境所损坏。而在种子萌发过程中，种皮也会限制种子的萌发，在本发明的研究中，发现种皮对种子的组织培养有较大影响，种皮会影响种子的萌发，污染率增高，不定芽的诱导率降低。因此，采用去除海棠种子的种皮后的胚作为外植体，可以大大地降低污染率、提高诱导数和诱导率。
优选的，上述芽诱导培养基具有如下成分：MS+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.1mg/LNAA；即在MS培养基的基础上，添加0.2mg/L TDZ、0.4mg/L KT、和0.1mg/L NAA。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，芽诱导培养的条件如下：暗培养25-35天，转光培养，光培养28-32天，光照强度1100-1300lx，时长14-16h/d。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述芽诱导步骤之后，上述组织培养方法还包括：增殖培养步骤；
上述增殖培养步骤包括：将上述不定芽置于增殖培养基中以诱导形成无根苗；
上述增殖培养基具有如下成分：MS+0.48-0.52mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.18-0.22mg L NAA+0.8-0.12mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
优选的，上述增殖培养基具有如下成分：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg L NAA+0.1mg/LPVP。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，增殖培养的条件如下：光培养28-32天，光照强度1100-1300lx，时长16h/d。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述增殖培养步骤之后，上述组织培养方法还包括：生根培养步骤；
上述生根培养步骤包括：将上述无根苗置于生根培养基中以诱导形成根得到海棠植株；
上述生根培养基具有如下成分：1/2MS+0.48-0.52mg/L IBA+0.8-0.12mg/L PVP，培养基pH为5.8。
优选的，上述生根培养基具有如下成分：1/2MS+0.5mg/L IBA+0.1mg/L PVP。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，生根培养的条件如下：光培养28-32天，光照强度1100-1300lx，时长16h/d。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述海棠种子为冬红海棠品种的种子。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还具有如下成分：30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
本发明的组织培养方法通过对各阶段培养基包括芽诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的成分的合理优化，使各阶段培养基能够在相应阶段进行有效诱导培养，例如芽诱导培养基可以提高海棠外植体的芽诱导率和增殖倍数、增殖培养基可以提高不定芽的增殖倍数、生根培养基可以提高无根苗的生根率等。
另一方面，本发明提供了一种用于海棠组织培养的培养基组合，上述培养基组合包括：用于诱导海棠外植体形成不定芽的芽诱导培养基；
上述芽诱导培养基具有如下成分：MS+0.18-0.22mg/L TDZ+0.38-0.42mg/L KT+0.0.8-0.12mg/L NAA；
优选的，上述海棠外植体为去除海棠种子的种皮后的胚。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述培养基组合还包括：用于诱导上述不定芽形成无根苗的增殖培养基；
上述增殖培养基具有如下成分：MS+0.48-0.52mg/L 6-BA+0.18-0.22mg L NAA+0.8-0.12mg/L PVP。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述培养基组合还包括：用于诱导上述无根苗生根的生根培养基；
上述生根培养基具有如下成分：1/2MS+0.48-0.52mg/L IBA+0.8-0.12mg/L PVP。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述海棠种子为冬红海棠品种的种子。
本发明的培养基组合通过对各阶段培养基包括芽诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的成分的合理优化，使各阶段培养基能够在相应阶段进行有效诱导培养，例如芽诱导培养基可以提高海棠外植体的芽诱导率和增殖倍数、增殖培养基可以提高不定芽的增殖倍数、生根培养基可以提高无根苗的生根率等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中胚刚接入芽诱导培养基上培养时的图片。
图2为实施例1中胚经芽诱导培养基培养后，诱导形成的丛生芽的图片。
图3为实施例1中在照培养基2中上的叶片发红的不定芽的图片。
图4为实施例中1中的将增殖培养后的不定芽图片。
图5为实施例1中的不定芽转入增殖培养基中诱导形成的无根苗图片。
图6为实施例1中的无根苗经生根培养后形成的带有根的完整植株图片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的海棠的组织培养方法，包括如下步骤：
1取‘冬红’海棠品种(来自江都市仙女镇的南京林业大学海棠种质资源圃)，将海棠果去除外种皮洗净，晾干后放入冰箱4℃沙藏30天。目的：低温沙藏刺激种子萌发。
2芽诱导培养
在超净工作台上使用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分。将种子放入培养皿中，剥去外种皮，将胚接入经高压灭菌锅灭菌(温度121℃，1.1kg/cm2高压下灭菌20min)的芽诱导培养基上(见图1)，暗培养25-35天后，转光培养，光培养30天，光照强度1200lx，时长16h/d，以培养得到不定芽(见图2)。
其中，芽诱导培养基的成分如下：MS+0.2mg/L TDZ+0.4mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
(1)设置对照试验1，以种子直接作为外植体，比较以胚作为外植体对不定芽的影响；
在超净工作台上使用75％酒精浸泡1min，无菌水清洗3次，25％次氯酸钠浸泡8min，无菌水清洗5次，使用无菌滤纸吸去多余水分。将种子直接接入经高压灭菌锅灭菌的培养基内，暗培养25-35天，转光培养，光培养30天，照强度1200lx，时长16h/d。每瓶接种一粒，每个处理接种30瓶，重复3次，结果见表1。
表1 剥胚与否对不定芽诱导影响
Figure BDA0002055125890000061
种皮是在种子发育过程中进化来保护内部胚不受外界环境所损坏。而在种子萌发过程中，种皮也会限制种子的萌发，从表1可以看出，种皮对种子的组织培养有较大影响，种皮会影响种子的萌发，污染率增高，不定芽的诱导率降低，而将种子的皮去除后以胚作为外植体，其污染率较低，诱导数、诱导率以及增殖倍数都有较大幅度的提高。
(2)设置对照试验2，以不同的基础培养基作为对照，用于芽诱导培养，比较不同培养基对海棠胚不定芽诱导及增殖的影响。
对照培养基与步骤2中的芽诱导培养基的差别仅在于基础培养基不同；具体地：对照芽诱导培养基1以WPM作为基础培养基，对照芽诱导培养基2以1/2MS作为基础培养基，其他成分与步骤2中的芽诱导培养基一致。培养结果见表2。
表2 不同基本培养基对海棠胚不定芽诱导及增殖的影响
Figure BDA0002055125890000071
通过表2数据发现，在暗培养阶段，实施例1的芽诱导培养基和对照培养基2在污染率和诱导数、诱导率以及增殖倍数等指标上具有比较明显的优势，但转入光培养一段时间以后，对照培养基2中的不定芽叶片发红(见图3)。因此，综合来看，采用实施例1步骤2中的芽诱导培养基对海棠胚进行芽诱导培养效果更突出。
3增殖培养
将由步骤2培养得到的不定芽转入增殖培养基中进行培养，以诱导形成无根苗；
增殖培养的条件：
光培养30天，照强度1200lx，时长16h/d。
本实施例中，增殖培养基具有如下成分：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg L NAA+0.1mg/LPVP+30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
设置对照试验3，对照增殖培养基以不同浓度的6-BA作为对照，其余成分与上述增殖培养基相同，比较6-BA对不定芽的诱导影响；结果见表3。
表3 不同浓度分裂素对不定芽诱导影响
组别 6-BAmg/L 诱导数/瓶 增殖倍数/倍
实施例1增殖培养基 <u>0.5</u> <u>231</u> <u>5.5</u>
对照增殖培养基1 1 168 4.6
对照增殖培养基2 2 78 2.8
从表3可以看出，本实施例1的增殖培养基诱导不定芽增殖的效果高于对照增殖培养基，增殖倍数可达5.5倍，增殖效果突出(见图4)。
4生根培养
将步骤3得到的无根苗(见图5)转入生根培养基中，进行生根培养，以得到完整的海棠苗植株(见图6)。
其中，生根培养的条件如下：
光培养30天，照强度1200lx，时长16h/d。
生根培养基的成分如下：
1/2MS+0.5mg/L IBA+0.1mg/L PVP+30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
设置对照试验4，以不同浓度的IBA和NAA作为对照，比较其对生根的影响。对照生根培养基的其余成分与实施例1的生根培养基成分相同，生根培养结果见下表4。
表4 不同浓度的生长素对海棠生根的影响
Figure BDA0002055125890000081
Figure BDA0002055125890000091
从表4可以看出，采用本实施例的生根培养基生根率可达95.45，远高于其他对照生根培养基，说明只添加0.5mg/L IBA的1/2MS基础培养基中对海棠无根苗的生根有明显提升作用。
表4试验是观测接种20天和接种36天后的生根效果，发现多培养一段时间后，其生根率都有明显提高，在接种20天时，7号培养基变现出来的效果较好，但是其生根率较培养36天的10号培养基低，此培养基配方可适用于生产时间较短的紧急情况，在实际生产中，当给予较长时间的培养，添加0.5mg/L IBA的1/2MS培养基是更为适合的培养配方。以上上述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海棠的组织培养方法，其特征在于，其包括：芽诱导步骤；所述芽诱导步骤包括：将海棠外植体置于芽诱导培养基中以诱导形成不定芽；
其中，所述芽诱导培养基具有如下成分：MS+0.18-0.22mg/L TDZ+0.38-0.42mg/L KT+0.8-0.12mg/L NAA；
所述海棠外植体为去除海棠种子的种皮后的胚。
2.根据权利要求1所述的海棠的组织培养方法，其特征在于，芽诱导培养的条件如下：暗培养25-35天，转光培养，光培养28-32天，光照强度1100-1300lx，时长14-16h/d。
3.根据权利要求1或2所述的海棠的组织培养方法，其特征在于，在所述芽诱导步骤之后，所述组织培养方法还包括：增殖培养步骤，
所述增殖培养步骤包括：将所述不定芽置于增殖培养基中以诱导形成无根苗；
所述增殖培养基具有如下成分：MS+0.48-0.52mg/L 6-BA+0.18-0.22mg L NAA+0.8-0.12mg/L PVP。
4.根据权利要求3所述的海棠的组织培养方法，其特征在于，增殖培养的条件如下：光培养28-32天，光照强度1100-1300lx，时长16h/d。
5.根据权利要求4所述的海棠的组织培养方法，其特征在于，在所述增殖培养步骤之后，所述组织培养方法还包括：生根培养步骤；
所述生根培养步骤包括：将所述无根苗置于生根培养基中以诱导形成根，得到海棠植株；
所述生根培养基具有如下成分：1/2MS+0.48-0.52mg/L IBA+0.8-0.12mg/L PVP。
6.根据权利要求5所述的海棠的组织培养方法，其特征在于，生根培养的条件如下：光培养28-32天，光照强度1100-1300lx，时长16h/d。
7.根据权利要求1或2所述的海棠的组织培养方法，其特征在于，所述海棠种子为冬红海棠品种的种子。
8.一种用于海棠组织培养的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包括：用于诱导海棠外植体形成不定芽的芽诱导培养基；
所述芽诱导培养基具有如下成分：MS+0.18-0.22mg/L TDZ+0.38-0.42mg/L KT+0.8-0.12mg/L NAA；
所述海棠外植体为去除海棠种子的种皮后的胚。
9.根据权利要求8所述的用于海棠组织培养的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合还包括：用于诱导所述不定芽形成无根苗的增殖培养基；
所述增殖培养基具有如下成分：MS+0.48-0.52mg/L 6-BA+0.18-0.22mg L NAA+0.8-0.12mg/L PVP。
10.根据权利要求9所述的用于海棠组织培养的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合还包括：用于诱导所述无根苗生根的生根培养基；
所述生根培养基具有如下成分：1/2MS+0.48-0.52mg/L IBA+0.8-0.12mg/L PVP。
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