CN109526750A

CN109526750A - 一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法

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Publication number: CN109526750A
Application number: CN201811639319.3A
Authority: CN
Inventors: 吴高殷; 王晓; 邹薇薇; 魏春芳
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109526750B

Abstract

本发明公开了一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，该方法为：通过消毒清洗、叶片愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织成熟与分化、分化芽生根诱导和移栽驯化获得冰灯玉露，本发明以上部分叶为愈伤组织诱导的最佳外植体，胚性愈伤诱导的适宜培养基为MS+6‑BA（1.0‑2.0mg·L^‑1）+NAA（0.1mg·L^‑1）+2,4‑D（0.2mg·L^‑1）+琼脂（6g·L^‑1）+蔗糖（30mg·L^‑1）；体细胞胚胎成熟分化培养基为MS+6‑BA（1.0mg·L^‑1）+NAA（0.1mg·L^‑1）+琼脂（6g·L^‑1）+蔗糖（30g·L^‑1），1/2MS培养基中添加IBA1.0g·L^‑1、琼脂6g·L^‑1和蔗糖30g·L^‑1对体胚分化苗进行生根诱导，诱导率最高为76%，培养基中添加活性炭不利于生根诱导。

Description

一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法

技术领域

本发明涉及一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，属于冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生技术领域。

背景技术

冰灯玉露(Haworthia cooperi var.cooperi)为百合科十二卷属植物，形状奇特，肉质叶晶莹明亮，观赏价值极高，是名贵的室内观赏花卉，具有良好的市场前景。主要以分株和叶插法为繁殖方法，其存在繁殖材料少、易损害母株和繁殖系数小等缺点，且十二卷属植物的自交不亲和，雄性不育阻碍了快速繁殖，难以满足市场需求。研究表明，植物体细胞胚胎发生是替代其他无性繁殖的一种有效方法，也是拯救濒危物种的有效途径。其技术除不受地区、气候等影响外，能提高扩繁速率和繁殖率，可获得大量与母本性状一致的再生植株，已广泛应用到多种植物上。但并未记载对冰灯玉露的叶片的培养技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，以解决上述现有技术中存在的问题。

本发明采取的技术方案为：一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，该方法包括以下步骤：

(1)选取生长茂盛，幼嫩无病虫的叶片，对幼嫩叶片进行清洗消毒，用无菌滤纸吸干叶片表面水分后，将叶片切成1cm×1cm大小方块；

(2)叶片愈伤组织诱导：用刀片将幼嫩叶片均匀切成上部分叶、中部分叶和下部分叶三部分，选择上部分叶为外植体，接种至MS基本培养基中，MS基本培养基添加6-BA、NAA、2,4-D、蔗糖和琼脂，叶片背面朝下，培养条件为暗培养，温度为25±2℃；

(3)胚性愈伤组织诱导：将步骤(2)中培养后的组织接种至培养基中，以MS为基本培养基，培养基中添加分裂素6-BA、NAA、蔗糖和琼脂，并进行继代培养，培养条件为暗培养，温度为25±2℃；

(4)胚性愈伤组织成熟与分化：挑选胚性愈伤组织(疏松、白色或透明水渍状的愈伤)转移至成熟分化培养基中(每块胚性愈伤组织0.5g)，成熟分化中添加6-BA和NAA，培养条件为光培养，光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；

(5)分化芽生根诱导：取胚性愈伤诱导出的分化芽(高约1.5cm、叶片翠绿和生长健壮)，以分株或簇状形式接种至1/2MS生根培养基中，生根培养基中添加IBA，培养条件为光培养，光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；

(6)移栽驯化：分化芽生根30d后，挑选根系较好、叶片翠绿的再生植株，清洗掉根系上的培养基，移栽至已消毒的草炭土中，温室棚内进行驯化，白天温度22-27℃，夜间温度不低于15℃，空气湿度85％以上。

优选的，上述步骤(1)中清洗消毒：用毛笔刷洗叶片上杂质，然后加入1ml吐温-20，自来水下冲洗30min后转移至超净工作台；75％酒精处理30s，无菌水清洗2遍；再用0.1％HgCl₂处理6min，无菌水清洗4遍。

优选的，上述步骤(2)中6-BA、NAA、2,4-D、琼脂和蔗糖的量分别为1-2mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、6g/L和30g/L。

优选的，上述步骤(3)中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mg/L、0.1mg/L、6g/L和30g/L。

优选的，上述步骤(5)中IBA的量为0.5mg/L。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明以上部分叶为愈伤组织诱导的最佳外植体，胚性愈伤诱导的适宜培养基为MS+6-BA(1.0-2.0mg·L^-1)+NAA(0.1mg·L^-1)+2,4-D(0.2mg·L^-1)+琼脂(6g·L^-1)+蔗糖(30mg·L^-1)；体细胞胚胎成熟分化培养基为MS+6-BA(1.0mg·L^-1)+NAA(0.1mg·L^-1)+琼脂(6g·L^-1)+蔗糖(30g·L^-1)，1/2MS培养基中添加IBA1.0g·L^-1、琼脂6g·L^-1和蔗糖30g·L^-1对体胚分化苗进行生根诱导，诱导率最高为76％，培养基中添加活性炭不利于生根诱导。

附图说明

图1为叶片不同部位愈伤组织的诱导，图中：A:上部叶愈伤组织(C)，B:中部叶愈伤组织(C)，C:下部叶愈伤组织(C)和胚状体(DSE)，D:下部叶胚状体(DSE)；

图2为体胚发育过程，图中：E：不同步化体胚；F：同步化体胚；G：褐化的愈伤组织；H：绿色的胚性愈伤；I和J：体胚的分化；K：添加活性炭的生根培养基；L和M：分化芽的生根；N：再生植株；

图3为不同浓度IBA与活性炭对分化芽的生根诱导。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对本发明进行进一步介绍。

实施例1：一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，该方法包括以下步骤：

(2)叶片愈伤组织诱导：用刀片将幼嫩叶片均匀切成上部分叶、中部分叶和下部分叶三部分，选择上部分叶为外植体，接种至MS基本培养基中，培养基添加6-BA、NAA、2,4-D、蔗糖和琼脂，叶片背面朝下，培养条件为暗培养，温度为25±2℃；

(5)分化芽生根诱导：取胚性愈伤诱导出的分化芽(高约1.5cm、叶片翠绿且生长健壮)，以分株或簇状形式接种至1/2MS生根培养基中，生根培养基中添加IBA，培养条件为光培养，光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；

优选的，上述步骤(5)中IBA的量为0.5mg/L。

为了进一步说明本发明的效果，进行如下实验：

1材料和方法

1.1试验材料

材料采集于内蒙古赤峰市天鑫花卉繁育基地多肉繁育大棚，选取生长旺盛、幼嫩无病虫害的叶片，用毛笔刷洗叶片上杂质，然后加入1ml吐温-20，自来水下冲洗30min后转移至超净工作台；75％酒精处理30s，无菌水清洗2遍；再用0.1％HgCl₂处理6min，无菌水清洗4遍。无菌滤纸吸干叶片表面水分后，将叶片切成1cm×1cm大小方块。

1.2叶片愈伤组织诱导

用刀片将幼嫩叶片均匀切成上部分叶、中部分叶和下部分叶三部分，接种至MS基本培养基中(下同)，添加6-BA(1.0mg·L^-1)、NAA(0.1mg L^-1)、琼脂(6g·L^-1)和蔗糖(30g·L^-1)。叶片背面朝下，每组接种10瓶，每瓶接种2个外植体，3次重复。培养条件为暗培养，温度为25±2℃(下同)。30d统计愈伤组织诱导率。

1.3胚性愈伤组织诱导

以上部叶片为外植体，培养基中添加6-BA(1.0、2.0、3.0mg·L^-1)，NAA(0.1、0.2、0.5mg·L^-1)和2,4-D(0.1、0.2、0.3mg·L^-1)，采用三因素三水平正交试验对叶片胚性愈伤进行诱导。30d统计胚性愈伤诱导率，继代培养基为原培养基。

1.4胚性愈伤组织成熟与分化

挑选胚性愈伤组织(疏松、白色或透明水渍状的愈伤)转移至成熟分化培养基中(每块胚性愈伤组织约0.5g)，培养基中添加6-BA(1.0、2.0mg·L^-1)和NAA(0.1、0.2mg·L^-1)。培养条件为光照强度2000Lux，16h/d(下同)。30d统计胚性愈伤分化芽数量。

1.5分化芽生根诱导

选取胚性愈伤诱导出的分化芽(高约1.5cm、叶片翠绿和生长健壮)，以分株或簇状形式接种至1/2MS生根培养基中，培养基添加IBA(0、0.5、1.0mg·L^-1)和活性炭AC(0、0.5、1.0g·L^-1)9个组合进行生根诱导。30d统计分化芽生根率。

1.6移栽驯化

分化芽生根30d后，挑选根系较好、叶片翠绿的再生植株，清洗掉根系上的培养基，移栽至已消毒的草炭土中，温室棚内进行驯化，白天温度22-27℃，夜间温度不低于15℃，空气湿度85％以上。30d统计试管苗的成活率和生长情况。

1.7数据分析

从愈伤诱导到试管苗硬化，经11个月的培养和观察，每个阶段的数据被记录。使用Excle和SPSS.20对数据进行均值和方差显著性分析(P<0.05)。

2结果与分析

2.1叶片不同部位对愈伤组织诱导的影响

叶片经8d暗培养后，叶片伤口处均有白色透明状的小颗粒愈伤组织。继续培养观察到愈伤的数量和质地逐渐发生了变化，上部叶片愈伤组织质地变紧密呈白色或黄白色大米颗粒近似圆球状(见图1-A)，中部叶片愈伤呈白色或乳白色团状或块状(图1-B)，下部叶片愈伤组织呈黄白色颗粒状(图1-C)。下部叶片培养20d左右，从伤口处直接分化出胚状体DSE(图1-D)，上部叶和中部叶却未观察到体胚直接发生现象。由表1可得，上部叶与下部叶和中部叶愈伤组织诱导率具显著差异(P<0.05)，其愈伤组织诱导率最高(88％)；而下部叶与中部叶愈伤组织诱导率不具显著差异(P<0.05)。

表1叶片不同部位对愈伤组织的诱导

注：表中数据为平均值±标准差，同列数据后的不同小写字母表示水平差异显著(P<0.05)，下同。

2.2不同激素组合对叶片胚性愈伤诱导的影响

叶片在不同激素下进行胚性愈伤组织诱导，其诱导率均大于60％，第4组诱导率最高(79％)。诱导出的愈伤组织继续培养可获得大量胚性愈伤，从愈伤外观形态观察到同一叶片上诱导的愈伤有多种类型，最为普遍的两种：一种为非胚性愈伤组织，黄色或黄白色、坚硬、块状，易褐化，不具备分化成胚状体的能力(图2G)；另一种为胚性愈伤组织，白色或透明水渍、疏松、颗粒状，不易褐化，可进一步分化成再生植株(图2H和2I)。由表2极差分析可得：三个因素影响胚性愈伤诱导的主次关系是：R_NAA>R_6-BA>R_2,4-D；且NAA、6-BA和2,4-D对愈伤组织诱导率分别具有极显著(p<0.01)，显著(p<0.05)和不显著(p<0.05)(表3)。由K值得出：诱导胚性愈伤最佳激素组合为：6-BA 1.0或2.0mg·L^-1，NAA 0.1mg·L^-1和2,4-D 0.2mg·L^-1。

表2不同激素配比对胚性愈伤诱导的正交试验表

表3不同激素配比对叶片愈伤组织诱导的方差分析表

变异源	平方和	自由度	均方	均方比	F<sub>a</sub>
						6-BA	0.00	2	0.001	19.67*
NAA	0.02	2	0.010	159.93**	F<sub>0.05</sub>(2,2)＝19.0
						2,4-D	0.00	2	0.001	17.76	F<sub>0.01</sub>(2,2)＝99.0
e	0.00	2	0.000
						∑	0.03	8

2.3 6-BA与NAA对胚性愈伤分化的影响

经继代培养的胚性愈伤转至成熟分化培养基中，培养15d左右，胚性愈伤组织沿四周不断增殖，同时胚性愈伤在形态结构上也发生了相应的变化。同一块愈伤上观察到不同发育时期的体细胞胚：球形胚GE和心形胚HSE(图2-E)，说明体胚发生过程不同步；但一些胚性愈伤组织上却能观察到同步化的胚状体EM(图2-F)。透明或白色愈伤组织在光照条件下培养逐渐变成黄色或绿色，部分黄色胚性愈伤会变黑死亡(图2-G)，而绿色的愈伤组织最终发育成胚状体(图2-H、I)。由表3可得，胚性愈伤组织在4组培养基中进行成熟分化诱导，每块胚性愈伤的胚状体成熟分化数达7株以上，胚状体萌发后生长良好，叶片翠绿(如图2-J)。第1组和第3组与第2组和第4组胚性愈伤分化数具有显著差异(P<0.05)，第1组分化数最高为10，虽然第3组分化数高达9.67，但是部分胚性愈伤容易褐化死亡，这可能是高浓度的6-BA促进胚性愈伤成熟分化，同时，加剧了愈伤褐化程度，不利体胚生长发育。然而第1组与第2组、第3组与第4组在同一6-BA浓度下，NAA浓度的提高显著降低了胚性愈伤的分化率，说明低浓度NAA利于胚性愈伤的分化。综上所述选取：MS+6-BA(1.0mg·L^-1)+NAA(0.1mg·L^-1)为胚性愈伤成熟分化培养基。

表4 6-BA与NAA对胚性愈伤分化的影响

2.4 IBA与活性炭对分化芽生根影响

将分化芽切成单株或者小簇芽丛接种至生根培养基中，观察到分化芽在生根过程中生长速度较慢，20天内叶片的外观没有明显的变化，继续培养分化芽的基部诱导出少许愈伤(图2-K和2-L)，并伴随着根源基的分化。在无IBA激素的培养基中分化芽生根诱导率较低；同一IBA浓度下，随着活性炭浓度的增加，分化芽的生根率也随之降低，说明活性炭不利于分化芽的生根；当IBA浓度为0.5mg·L^-1和1.0mg·L^-1时，分化芽生根率较在无IBA具有显著差异；IBA浓度为0.5mg·L^-1诱导的生根率显著高于其他处理，且具有显著性(P<0.05)(图3)。综上所述，选取1/2MS+IBA(0.5mg·L^-1)为分化芽适宜培养基。

2.5植株驯化

试管苗被移栽至温室大棚进行硬化，第30d试管苗成活率高达96.6％以上，生长一致且健壮；经180天的培育后，试管苗基部长出1-4株分株苗，大小各异(图2-N)。

3结论

影响植物体细胞胚胎发生的主要因素是基因型和外植体。基因型是影响体胚发生的内在因素。此外，外植体的选择对体胚发生也至关重要，乌桕的成熟胚、葡萄的柱头和咖啡完全展开的叶片为外植体均获得体细胞胚；樟脑的未成熟胚对比叶子、子叶和花序是诱导体胚发生最佳材料。说明不同植物同一组织或同一植物不同组织的再生能力不一样。本试验以玉露叶片的不同部位进行愈伤组织诱导，研究得出玉露为较易诱导愈伤组织的植物，但上部叶与下部叶和中部叶愈伤组织诱导率具显著差异，其中，以上部叶片诱导率最高(88％)，导致同一叶片不同部位愈伤诱导率差异的原因可能与叶片不同部位内源激素水平含量和再生能力大小有关，除外植体影响体胚发生外，培养基中的成分(如大量元素、微量元素维生素和每个阶段的外源激素)和环境因素(如温度、湿度和光照条件)均是愈伤诱导的影响因子。2,4-D是诱导体细胞胚胎发生最为常用的生长素，然而本试验得出：2,4-D与NAA比较，2,4-D对愈伤组织诱导不具有显著性，甚至可能具有抑制作用。外植体在6-BA(1.0mg·L-1)和NAA(0.1mg·L-1)组合下对愈伤组织诱导具有显著性。诱导出的愈伤继续培养可获得大量的胚性愈伤，但在同一块愈伤组织上通过形态观察到体胚不同步化现象，这是由于同一外植体上体细胞胚的发育时间不同，或所处发育时期相同的体细胞胚的差距较大，也可能是养分供给不平衡或者体细胞胚本身同步性较差造成的。胚性愈伤转入光照环境进行成熟分化诱导过程中，胚性愈伤出现褐化现象需在胚性愈伤褐化之前转接至新鲜培养基中，否则会褐化死亡。但在暗培养条件下，胚性愈伤很少观察到褐化现象，这与暗培养条件下胚性愈伤氧化酶活性低从而减轻胚性愈伤褐化的缘故。分化芽的生根诱导随着活性炭浓度的增加，生根率相应的降低，这由于活性炭吸附了分化芽生长发育所需的营养物质和生长素。但大量研究发现活性炭对黄瓜和沙枣体胚发生的成熟却是有利的。

试验以上部叶为外植体进行体胚发生诱导，在适宜培养基中，叶片具有较高的胚性愈伤诱导。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）选取生长茂盛，幼嫩无病虫的叶片，对幼嫩叶片进行清洗消毒，用无菌滤纸吸干叶片表面水分后，将叶片切成1cm×1cm大小方块；

（2）叶片愈伤组织诱导：用刀片将幼嫩叶片均匀切成上部分叶、中部分叶和下部分叶三部分，选择上部分叶为外植体，接种至MS基本培养基中，MS基本培养基添加6-BA、NAA、2,4-D、蔗糖和琼脂，叶片背面朝下，培养条件为暗培养，温度为25±2℃；

（3）胚性愈伤组织诱导：将步骤（2）中培养后的组织接种至胚性愈伤诱导培养基中，以MS为基本培养基，培养基中添加分裂素6-BA、NAA、蔗糖和琼脂，并进行继代培养，培养条件为暗培养，温度为25±2℃；

（4）胚性愈伤组织成熟与分化：挑选胚性愈伤组织转移至成熟分化培养基中，成熟分化中添加6-BA和NAA，培养条件为光培养，光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；

（5）分化芽生根诱导：取胚性愈伤诱导出的分化芽，以分株或簇状形式接种至1/2MS生根培养基中，生根培养基中添加IBA，培养条件为光培养，光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；

（6）移栽驯化：分化芽生根30d后，挑选根系较好、叶片翠绿的再生植株，清洗掉根系上的培养基，移栽至已消毒的草炭土中，温室棚内进行驯化，白天温度22-27℃，夜间温度不低于15℃，空气湿度85%以上。

2.根据权利要求1所述的一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：步骤（1）中清洗消毒：用毛笔刷洗叶片上杂质，然后加入1ml吐温-20，自来水下冲洗30min后转移至超净工作台；75%酒精处理30s，无菌水清洗2遍；再用0.1% HgCl₂处理6min，无菌水清洗4遍。

3.根据权利要求1所述的一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：步骤（2）中6-BA、NAA、2,4-D、琼脂和蔗糖的量分别为1-2mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、6g/L和30g/L。

4.根据权利要求1所述的一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：步骤（3）中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mg/L、0.1mg/L、6g/L和30g/L。

5.根据权利要求1所述的一种冰灯玉露体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：步骤（5）中IBA的量为0.5mg/L。