CN115250913B - 一种盐肤木体细胞胚胎发生与植株再生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物生物技术领域，公开了一种盐肤木体细胞胚胎发生与植株再生方法。该方法以幼嫩种胚为外植体，具体包括：（1）外植体制备；（2）愈伤组织的诱导；（3）胚性愈伤组织诱导及增殖；（4）体细胞胚胎的分化；（5）植株再生。本方法探究出盐肤木体细胞胚胎发生各阶段的最适培养基配方及植株再生培养的最优条件，建立其稳定的体细胞胚胎发生及植株再生技术体系，有效解决了盐肤木体细胞胚胎诱导难的问题。本发明具有愈伤组织诱导率高、质量高、培养周期相对较短的优点，为盐肤木良种的快速繁殖提供了一种高效途径，也为盐肤木遗传转化及品种改良提供重要的技术平台。

Description

一种盐肤木体细胞胚胎发生与植株再生方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及以盐肤木幼嫩种胚为外植体，诱导出初代愈伤组织、胚性愈伤组织，进而从胚性愈伤组织中诱导出体细胞胚胎并使其再生成完整植株的方法。
背景技术
盐肤木(RhuschinensisMill.)，又名五倍子树，漆树科(Anacardiaceae)，盐肤木属(Rhus)，为五倍子蚜虫寄主植物，在幼枝和叶上形成虫瘿，即为五倍子，是鞣革、医药、塑料和墨水等制造业的重要工业原料。幼枝可作土农药。果泡水代醋用，生食酸咸止渴。种子可榨油。根、叶、花及果均可供药用。嫩枝、叶、花是很好的猪饲料。花洁白、气味芳香，秋叶红艳，可做园景树、行道树和庭荫树。盐肤木在湖北省分布在宜昌，武汉等狭小地带，蕴藏量小，有很大的发展前景。但是随着五倍子应用范围的进一步拓宽，其产量远不能满足市场需求，使优质盐肤木品种成为了制约五倍子产业发展的瓶颈。而常规的种植繁殖与扦插繁殖受到盐肤木自身的限制，且优良性状的盐肤木种质资源较少，因此严重限制了常规育苗技术的发展。
植物组织培养技术可以批量获得优质资源，且经植物体细胞胚胎发生途径获得再生植株具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，在植物基因工程等基础研究和植物繁育等应用研究中的用途越来越广泛。稳定高效的体胚再生体系的建立既为盐肤木良种快繁提供技术支撑，又是盐肤木遗传转化体系建立的必要前提，因此具有十分广阔的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种盐肤木体细胞胚胎发生与植株再生方法，该方法以盐肤木的幼胚为外植体，通过初代愈伤组织、胚性愈伤组织、体细胞胚胎的诱导获得大量盐肤木体细胞胚胎，再通过诱导萌发与植株再生获得大量具有优良性状的盐肤木再生苗，从而为良种快繁、遗传转化体系的建立提供重要依据。
本发明采用的技术方案为：一种盐肤木体细胞胚胎发生与植株再生方法，包括如下步骤：
(1)外植体的制备：取盐肤木授粉后6周的幼嫩种子为材料，经筛选、洗涤、灭菌后，剥取幼胚作为外植体；
(2)愈伤组织的诱导：取步骤(1)得到的外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上培养，得到初代胚性愈伤组织；
(3)胚性愈伤组织诱导及增殖：将步骤(2)中得到的初代胚性愈伤组织转接至诱导增殖培养基中进行诱导及增殖，得到盐肤木胚性愈伤组织；
(4)体细胞胚胎的诱导：挑选长势较好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚胎诱导培养基上培养，得到盐肤木体细胞胚；
(5)植株再生：将步骤(4)得到的盐肤木体细胞胚，接种于体细胞胚胎诱导培养基和生根培养基中诱导盐肤木体细胞胚萌发，获得再生植株，炼苗后移栽。
进一步优选地，步骤(1)所述的灭菌方式为75％酒精浸泡25-35s，无菌水冲洗4-6遍，0.1％升汞浸泡9-11min，无菌水冲洗5-6遍。
进一步优选地，步骤(2)所述的诱导培养基配方为MS+0.1-1mg/L 6-BA+1-3 mg/L2,4D+25-30g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8。
进一步优选地，步骤(2)所述诱导培养基还可以为MS+0.1-1mg/L 6-BA+25-30g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8。
进一步优选地，步骤(2)所述诱导培养基还可以为MS+1-3mg/L 2,4D+25-30 g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8。
进一步优选地，步骤(3)所述的诱导增殖培养基配方为1/2MS+0.1-2mg/L 6-BA+0.01-1mg/L NAA+25-30g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8；
进一步优选地，步骤(4)所述的体细胞胚胎诱导培养基配方为1/2MS+1-2 mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L NAA+35-45g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8；
进一步优选地，步骤(4)所述体细胞胚胎诱导培养基配方还可以为 MS+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.125-0.25mg/L NAA+35-45g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉， pH值为5.8。
进一步优选地，步骤(5)所述的生根培养基为1/2MS培养基+30-50g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8；移栽基质为泥炭土：蛭石：珍珠岩为2-4:1-2:1-2。
进一步优选地，步骤(2)-(5)中的培养条件为25±2℃、光照度1500lx、光照时间16h/d。
有益效果
本发明首次成功以盐肤木幼胚为材料，建立盐肤木胚性愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生技术途径，有效解决了其体细胞胚胎诱导难的问题，这是对前人研究盐肤木器官发生途径的补充和突破。
本发明具有体细胞胚胎诱导率高、质量高等优点，为盐肤木良种的快速繁殖提供了一种高效途径，对于盐肤木遗传转化体系的建立具有重要意义。与常规的组织培养方法相比，体细胞胚的发生具有繁殖效率高，遗传稳定、再生频率高的特点，可作为多数植物最理想的遗传转化受体系统，可缩短育种周期，为盐肤木遗传改良、分子育种搭建平台。
附图说明
图1为盐肤木幼胚诱导初代愈伤组织，其中a为盐肤木幼胚，b为初代愈伤组织，标尺为0.5cm；
图2为盐肤木胚性愈伤组织，其中a为诱导15d后的胚性愈伤组织，b为诱导30d后的胚性愈伤组织，标尺为1.0mm；
图3为盐肤木胚性愈伤组织的增值图，其中a为增殖前1g胚性愈伤组织，b 为增殖后的大量胚性愈伤组织，标尺为1.0cm；
图4为盐肤木不同时期的愈伤组织和体细胞胚胎，其中a为盐肤木非胚性愈伤组织，b为胚性愈伤组织，c为球形胚，d为心形胚，e为鱼雷胚，f为子叶胚， a1-f1分别为a-f对应的细胞学石蜡切片，标尺为100μm；
图5为植株再生图，其中a为体细胞分化，b为再生植株，c为移栽入基质的再生苗，标尺为0.5cm。
具体实施例
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步解释，值得注意的是，下述实施例仅为本发明的优化技术方案，并不能理解为对本发明的限制，本发明的保护范围应为权利要求记载的技术方案。本领域技术人员在此范围内等同替换改进也在本发明的保护范围之内
实施例1外植体灭菌条件的确定
(1)将盐肤木幼嫩种子摘下来够，挑选长势一致的种子用洗洁精搓洗干净后在流水下冲洗30min，然后将种子转移至超净工作台中；
(2)将盐肤木幼嫩种子用75％酒精浸泡30s进行杀毒灭菌，然后用无菌水冲洗5遍；
(3)将步骤(2)中的种子转移到无菌瓶中，加入没过种子的0.1％升汞进行震荡灭菌，然后用无菌水冲洗5遍即可；
(4)然后取步骤(3)得到的盐肤木的幼嫩种子中的幼胚，接种至愈伤组织诱导培养基中，7d后统计外植体的污染及褐化情况，结果见表1。
实施例1-1：步骤(3)中0.1％升汞灭菌时间为8min；
实施例1-2：步骤(3)中0.1％升汞灭菌时间为9min；
实施例1-3：步骤(3)中0.1％升汞灭菌时间为10min；
实施例1-4：步骤(3)中0.1％升汞灭菌时间为11min；
实施例1-5：步骤(3)中0.1％升汞灭菌时间为12min；
实施例1-6：步骤(3)中0.1％升汞灭菌时间为13min；
表1 0.1％升汞灭菌时间对外植体的影响
灭菌时间/min 污染率/％ 污染情况
8 80 有大量霉菌、细菌污染
9 25 有少量霉菌、细菌污染
10 0 零污染，外植体情况良好，且愈伤率高
11 0 零污染，外植体轻微褐化，且愈伤率降低
12 0 零污染，外植体全部褐化致死
13 0 零污染，外植体全部褐化致死
由图1和表1可知，去除种皮的盐肤木幼嫩种子最佳灭菌方案为：75％酒精消毒30s，无菌水清洗5次，0.1％升汞灭菌10min，无菌水清洗5次。这样的灭菌方案可达到零污染率，且外植体不会褐化影响后续愈伤组织的诱导。
实施例2植物生长调节剂对初代愈伤组织诱导率的影响
(1)取盐肤木幼嫩种子在洗洁精和流水下冲洗掉外种皮的油脂，然后转移无菌操作台中用75％酒精消毒30s，无菌水清洗5次，0.1％升汞灭菌10min，无菌水清洗5次进行灭菌，然后取其中的幼胚作为盐肤木外植体。
(2)用MS基本培养基，不同浓度的6-BA，不同浓度的2,4-D配制愈伤组织诱导培养基；
(3)将步骤(1)得到的盐肤木外植体接种至步骤(2)配制的愈伤组织诱导培养基中，在温度为25±2℃、光照度为1500lx、光照时间为16h/d下培养 15d后统计愈伤组织的诱导率以及愈伤组织的状态，培养基配方、诱导率以及愈伤组织状态见表2。
表2不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导率及状态的影响
Figure RE-GDA0003872729420000051
注：同一列中字母不同表示差异显著，邓肯检验法，(P<0.05)数据为平均值±标准差。
表2实验结果表明：当愈伤组织诱导培养基中只含有6-BA能够以盐肤木幼嫩种子为外植体诱导出初代愈伤组织，且当6-BA浓度为0.2mg/L时能够诱导出谈黄色表面光滑的初代愈伤组织，诱导率可达69.38±7.99％，但当6-BA的浓度进一步升高时，初代愈伤组织的诱导率显著下降，且愈伤组织也呈现水渍状，无法进行增殖；当愈伤组织诱导培养基中只含有2,4-D时也能够诱导出初代愈伤组织，且诱导率在36.6％-42.1％之间，但是诱导出的初代愈伤组织质地疏松，状态不佳；当愈伤组织诱导培养基中含有0.1-1mg/L的6-BA，0.5-3mg/L的2,4-D时能够诱导出状态较好的初代愈伤组织，其中MS+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.2mg/L 诱导出的初代愈伤组织呈谈黄色透明状，诱导率也高达84.57±2.66％，表明其为最适合幼胚诱导初代愈伤组织的培养基。
实施例3植物生长调节剂对胚性愈伤组织诱导和增殖的影响
(1)取盐肤木幼嫩种子在洗洁精和流水下冲洗掉外种皮的油脂，然后转移至无菌操作台中用75％酒精消毒30s，无菌水清洗5次，0.1％升汞灭菌10min，无菌水清洗5次，进行灭菌，然后取出种子中的幼胚作为盐肤木外植体；
(2)配制愈伤组织诱导培养基：在MS培养基中添加2,4-D 1mg/L、6-BA 0.2 mg/L、30g/L的蔗糖和8.0g/L的琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH 值为5.8；
(3)配制诱导增殖培养基：在1/2MS基本培养基中添加不同浓度的6-BA、不同浓度的NAA、30g/L的蔗糖、和8.0g/L的琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH值为5.8。
(4)将步骤(1)得到的盐肤木外植体接种至步骤(2)配制的愈伤组织诱导培养基中，在温度为25±2℃、光照度为1500lx、光照时间为16h/d下培养 15d后得到初代愈伤组织；
(5)将步骤(4)得到的初代愈伤组织接种至步骤(3)得到的诱导增殖培养基中，培养30d后得到胚性愈伤组织，并统计增殖率以及胚性愈伤组织的状态，诱导增殖培养基配方、胚性愈伤组织的增殖率以及状态见表3，胚性愈伤组织的诱导情况见图2，增殖情况见图3。
表3不同浓度激素对胚性愈伤组织增殖的影响
Figure RE-GDA0003872729420000061
Figure RE-GDA0003872729420000071
注：同一列中字母不同表示差异显著，邓肯检验法，(P<0.05)数据为平均值±标准差。
表3数据表明：相同浓度的6-BA下，随着NAA浓度的升高，愈伤增殖倍数呈倒U型趋势，当NAA浓度为0.5mg/L时，盐肤木胚性愈伤的增殖效果最好。当6-BA浓度为2mg/L时，愈伤组织增殖率随着NAA浓度(0.01、0.1、0.5、1mg/L) 增加先增加后减少，并且与其他6-BA浓度相比变化幅度更大。而当6-BA浓度为2mg/L、NAA浓度为0.5mg/L时，增殖倍数最高可达854.73％，且愈伤组织呈黄褐色，状态好。
如图2a所示，将初代愈伤组织接种至诱导增殖培养基15d后开始出现淡黄色、蓬松偏软的胚性愈伤组织，增殖培养30d后后出现黄褐色致密颗粒状的胚性愈伤组织。
如图3a所示，接种1g淡黄色的胚性愈伤在14号培养基组合中，增殖培养 30d后(图3b)胚性愈伤组织可达8.55g。结合胚性愈伤增值倍数和形态及后续的生长状况来看，14：1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L是最适合胚性愈伤组织增殖的诱导增殖培养基。
实施例4不同培养基配方对盐肤木体细胞胚胎诱导的影响
(1)取盐肤木幼嫩种子在流水下冲洗掉外种皮的油脂，然后转移至无菌操作台中用75％酒精消毒30s，无菌水清洗5次，0.1％升汞灭菌10min，无菌水清洗5次，进行灭菌，然后取出种子中的幼胚作为盐肤木外植体；
(2)配制愈伤组织诱导培养基：在MS培养基中添加2,4-D 1mg/L、6-BA 0.2 mg/L、30g/L的蔗糖和8.0g/L的琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH 值为5.8；
(3)配制诱导增殖培养基：在1/2MS基本培养基中添加不同浓度的6-BA、不同浓度的NAA、30g/L的蔗糖、和8.0g/L的琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH值为5.8；
(4)将步骤(1)得到的盐肤木外植体接种至步骤(2)配制的愈伤组织诱导培养基中，在温度为25±2℃、光照度为1500lx、光照时间为16h/d下培养 15d后得到初代愈伤组织；
(5)将步骤(4)得到的初代愈伤组织接种至步骤(3)得到的诱导增殖培养基中，培养30d后得到胚性愈伤组织；
(6)配制体细胞胚胎诱导培养基：在MS或1/2MS基本培养基中添加不同浓度的6-BA、不同浓度的NAA、不同浓度的蔗糖和浓度为8.0g/L的琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH值为5.8；
(7)选取步骤(5)中长势良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚胎诱导培养基上进行体细胞胚胎诱导，40d后得到盐肤木体细胞胚胎。
不同培养基类型及植物生长调节剂对体细胞胚胎诱导的影响见表4，不同浓度的额蔗糖对体细胞胚胎诱导影响见表5：
表4不同培养基类型及植物生长调节剂对体细胞胚胎诱导的影响
Figure RE-GDA0003872729420000081
Figure RE-GDA0003872729420000091
注：同一列中字母不同表示差异显著，邓肯检验法，(P<0.05)数据为平均值±标准差。
结果表明：在培养基中含有较高浓度的6-BA和NAA时，体细胞胚胎的诱导率不高，仅在序号7：1/2MS+6-BA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L有18.47％的体细胞胚胎诱导率外，其余培养基上均不能形成体细胞胚胎。
在改变基本培养基类型的前提下，降低6-BA和NAA浓度，发现在MS， NAA浓度为0.25mg/L，6-BA浓度为1mg/L时，诱导率最高14.58％±9.55(序号16)，在MS，NAA浓度为0.125mg/L，6-BA浓度为0.5mg/L时，诱导率仅有7.92％±5.91(序号19)，表明进行盐肤木体细胞胚胎诱导时可以选择上述三种培养基。
表5蔗糖浓度对体细胞胚胎诱导的影响
Figure RE-GDA0003872729420000092
Figure RE-GDA0003872729420000101
注：同一列中字母不同表示差异显著，邓肯检验法，(P<0.05)数据为平均值±标准差。
蔗糖在体细胞胚胎发生过程中能通过调节细胞内渗透压提高体细胞胚胎发生率，因此本研究探索了蔗糖浓度对体细胞胚胎发生的影响，结果如表5所示，添加蔗糖浓度为8％时，胚性愈伤组织迅速变黑死亡；当蔗糖浓度为7％时，胚性愈伤组织也会在生长几天后失水死亡；当蔗糖浓度为6％时，胚性愈伤组织逐渐失水干瘪，当蔗糖浓度为5％时，胚性愈伤没有明显的变化；当蔗糖浓度为4％时，盐肤木体细胞胚胎发生率为32.67±4.75％。表明体细胞胚胎诱导培养基的最佳配方为1/2MS，2mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，4％蔗糖(40g/L)和8g/L琼脂粉。
实施例5体细胞胚胎发生体系及植株再生
(1)配制培养基：
愈伤组织诱导培养基：MS培养基中，添加0.2mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、 30g/L蔗糖和8.0g/L琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH值为5.8；
诱导增殖培养基：1/2MS，添加浓度为2mg/L的6-BA，浓度为0.5mg/L的 NAA，浓度为30g/L的蔗糖和浓度为8.0g/L的琼脂粉，并在121℃的温度下灭菌20min，pH值为5.8；
体细胞胚胎诱导培养基：1/2MS，并添加浓度为0.5mg/L的NAA、浓度为 2.0mg/L的6-BA、浓度为40g/L的蔗糖和浓度为8.0g/L的琼脂粉，pH值为5.8；
生根培养基：1/2MS并添加+40g/L蔗糖和8.0g/L的琼脂粉，pH值为5.8；
(2)外植体的制备：取盐肤木幼嫩的种子，先用75％浓度的酒精消毒30s，用无菌水冲洗5次，再用0.1％浓度的升汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗5次，得到无菌盐肤木种子；在超净工作台上，剥掉盐肤木种子种皮，得到完整的盐肤木幼胚作为盐肤木外植体；
(3)愈伤组织的诱导：将步骤(2)得到的盐肤木外植体接种至步骤(1) 配制的愈伤组织诱导培养基上，诱导培养15d，获得状态良好的初代愈伤组织；
(4)胚性愈伤组织的增殖：挑选步骤(3)中长势良好的初代愈伤组织，接种至步骤(1)配制的诱导增殖培养基上，增殖培养30d后得到盐肤木胚性愈伤组织；
(5)体细胞胚胎的诱导：选取步骤(4)中长势良好的胚性愈伤组织，接种至步骤(1)配制的体细胞胚胎诱导培养基上，诱导培养40d后得到盐肤木体细胞胚胎(图4)；
(6)植株再生：将步骤(5)中得到的处于子叶胚时期的盐肤木体细胞胚胎在体细胞胚胎诱导培养基上进行继代培养，30d后可形成再生苗；再生苗在生根培养基中培养30d以生根；待再生苗生长至3-5cm左右时，转入泥炭土：蛭石：珍珠岩为2：1：1的基质中能稳定成活(图5)。

Claims (4)

1.一种盐肤木体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）外植体的制备：取盐肤木幼嫩种子，经筛选、洗涤、灭菌后，剥取幼胚作为外植体；
（2）愈伤组织的诱导：取步骤（1）得到的外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上培养，得到初代胚性愈伤组织；
（3）胚性愈伤组织诱导及增殖：将步骤（2）中得到的初代胚性愈伤组织转接至诱导增殖培养基中进行诱导及增殖，得到盐肤木胚性愈伤组织；
（4）体细胞胚胎的诱导分化：挑选长势较好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚胎诱导培养基上培养，得到盐肤木体细胞胚；
（5）植株再生：将步骤（4）得到的盐肤木体细胞胚，接种于体细胞胚胎诱导培养基和生根培养基中诱导盐肤木体细胞胚萌发，获得再生植株，炼苗后移栽；
其中，步骤（2）所述的诱导培养基为MS+0.1-1 mg/L 6-BA+1-3 mg/L 2,4D+25-30 g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8或者MS+0.1-1mg/L 6-BA+25-30g/L蔗糖+7.0-8.0g/L琼脂粉，pH值为5.8或者MS+1-3 mg/L 2,4D+25-30 g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8；
步骤（3）所述的诱导增殖培养基配方为1/2MS+0.1-2 mg/L 6-BA+0.01-1 mg/L NAA+25-30 g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8；
步骤（4）所述的体细胞胚胎诱导培养基配方为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30-40g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8或者MS+1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+30-40g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8或者MS+0.5 mg/L 6-BA+0.125 mg/L NAA+30-40g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8；
步骤（5）所述的生根培养基为1/2MS培养基+30-50 g/L蔗糖+7.0-8.0 g/L琼脂粉，pH值为5.8。
2.根据权利要求1所述的一种盐肤木体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：步骤（1）所述的灭菌方式为75%酒精浸泡25-35 s，无菌水冲洗4-6遍，0.1%升汞浸泡9-11 min，无菌水冲洗5-6遍。
3.根据权利要求1所述的一种盐肤木体细胞胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于：步骤（5）所述的移栽基质为泥炭土：蛭石：珍珠岩为2-4:1-2:1-2。
4.根据权利要求1所述的一种盐肤木体细胞胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于：步骤（2）-（5）中的培养条件为25±2℃、光照度1500 lx、光照时间16 h/d。
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