CN109757379B - 一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其包括播种、消毒、诱导培养、增殖培养、生根培养及炼苗的步骤，其具体是利用含有不同激素配比的培养基提供外植体在生根壮苗期间所需的因子，以提供良好的生根条件，促进苗健康茁壮，获得杉木的再生苗。其培养方法取材方便，成本低、操作简单，并具有扩繁速度快、繁殖系数高的特点，可为杉木遗传转化体系提供高效再生体系。

Description

一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法
技术领域
本发明属于植物培育繁殖技术领域，具体涉及一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法。
背景技术
杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook.）是我国南方地区最重要的常绿针叶树种之一。杉木木材因加工性能好、天然耐腐力强等优点，广泛用于建筑、家具和造纸等行业，是我国重要的商品用材树种。
目前，国内一些学者以杉木的胚、子叶和下胚轴等为外植体，经直接器官发生途径获得了再生植株，但其再生频率较低，均不足以作为遗传转化和规模化繁殖的基础平台。而以茎段为外植体对杉木进行的离体再生研究获得了再生植株，再生频率也达到了转基因操作技术的基本要求，但未获得转基因植株，其主要原因是褐化降低再生频率及定芽（腋芽）导致假阳性。可见，迫切需要建立全新的杉木转基因受体系统。
不定芽再生系统具有如下优点：（1）遗传稳定性好。由于不定芽系外植体越过脱分化产生愈伤组织的阶段直接分化而来，体细胞无性系变异小，能较好地保持母体（外植体）的优良性状；（2）周期短。不定芽再生途径省略了愈伤组织诱导与增殖过程，直接由外植体分化成芽，周期短，操作简便。杉木子叶再生系统形成的不定芽数量多且遗传稳定性好，加之子叶具有较大的微粒接收面积，既适于基因枪介导的遗传转化与应用研究，也适于农杆菌介导的遗传转化体系。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其取材方便，成本低、操作简单，并具有扩繁速度快、繁殖系数高等特点，可为杉木遗传转化体系提供高效再生体系。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其包括如下步骤：
1）播种：选取成熟饱满的种子，用自来水浸泡24 h后于室温（25±2℃）下播种于基质中；
2）消毒：种子萌发20天后，选取生长健壮的幼苗，用自来水清洗干净，去根后依次用75vol%酒精浸泡30-60s、0.1vol%升汞溶液浸泡5-7 min、无菌水冲洗5次；
3）诱导培养：将消毒后的幼苗取子叶切段作为外植体，接种到诱导培养基上培养30天，获得不定芽；所述诱导培养基的配方为：DCR+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.005 mg/L+6-BA1.0mg/L；
4）增殖培养：将步骤3）培养得到的不定芽经切割后转接到增殖培养基上培养35天，获得继代苗；所述增殖培养基的配方为：MS +6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.06mg/L；
5）生根培养：将步骤4）培养得到的继代苗接种到生根培养基上培养15天，获得生根苗；所述生根培养基的配方为：MS +NAA 1 mg/L+IBA 1 mg/L；
6）炼苗：将步骤5）培养得到的生根苗转到炼苗室进行炼苗。
所述再生方法还包括生根苗的移栽，其具体是在炼苗10天后，待根系由白色转变成灰白色时，将生根苗先于清水中漂洗去除根部的培养基，然后晾干根系的表面水分，再将生根苗栽入装有混合基质的容器中进行培养。
上述所用基质是将营养土、蛭石和珍珠岩按体积比2:2:1混合制得。
上述诱导培养、增殖培养及生根培养时的培养条件均为：光照速率80 μmol·m-2·s-1，光照时间16 h/d，培养温度25±2℃。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
（1）本发明选用温室萌发的杉木实生苗作为外植体的来源，其不仅具有取材简单、不受时间和数量限制的特点外，还具有省时省力的优点。
（2）本发明利用含有不同激素配比的培养基提供外植体在生根壮苗期间所需的因子，以提供良好的生根条件，促进苗健康茁壮，获得杉木的再生苗，其培养方法取材方便，成本低、操作简单，并具有扩繁速度快、繁殖系数高的特点，可以为杉木遗传转化后提供良好的再生体系。
附图说明
图1为实施例3消毒后接种在培养基上的杉木子叶。
图2为实施例3的再生过程，其中，A为外植体接入诱导培养基30d后生成的不定芽；B为切割不定芽接入增殖培养基后生成的继代苗；C为实施例3生根壮苗培养形成的生根苗完整植株；D为移栽成活的杉木苗。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
所用培养基的制备方法是将组成培养基的原料混合搅拌均匀后，将其pH值调节至5.8，然后装入锥形瓶中，在121℃高温下蒸汽灭菌20min后分装到培养皿中冷却，备用。
实施例1
一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其包括如下步骤：
1）播种：选取成熟饱满的种子，用自来水浸泡24 h后于室温（25±2℃）下播种于由营养土、蛭石和珍珠岩按2:2:1(v/v)混合制得的基质中；
2）消毒：种子萌发20天后，选取生长健壮的幼苗，用自来水清洗干净，去根后依次用75vol%酒精浸泡30s、0.1vol%升汞溶液浸泡5 min、无菌水冲洗5次；
3）诱导培养：将消毒后的幼苗取子叶切段作为外植体，接种到诱导培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养30天，获得不定芽；所述诱导培养基的配方为：DCR+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.005 mg/L+6-BA 1.0mg/L；
4）增殖培养：将步骤3）培养得到的不定芽经切割后转接到增殖培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养35天，获得继代苗；所述增殖培养基的配方为：MS +6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.06 mg/L；
5）生根培养：将步骤4）培养得到的继代苗接种到生根培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养15天，获得生根苗；所述生根培养基的配方为：MS +NAA 1 mg/L+IBA 1 mg/L；
6）炼苗：将步骤5）培养得到的生根苗转到炼苗室进行炼苗；
7）生根苗的移栽：在炼苗10天后，待根系由白色转变成灰白色时，将生根苗进行移栽，移栽时先将生根苗于清水中漂洗，去除根部的培养基，然后晾干根系的表面水分，再将生根苗栽入装有由营养土、蛭石和珍珠岩按2:2:1(v/v)混合制得的基质的容器中进行培养。
实施例2
一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其包括如下步骤：
1）播种：选取成熟饱满的种子，用自来水浸泡24 h后于室温（25±2℃）下播种于由营养土、蛭石和珍珠岩按2:2:1(v/v)混合制得的基质中；
2）消毒：种子萌发20天后，选取生长健壮的幼苗，用自来水清洗干净，去根后依次用75vol%酒精浸泡45s、0.1vol%升汞溶液浸泡6min、无菌水冲洗5次；
3）诱导培养：将消毒后的幼苗取子叶切段作为外植体，接种到诱导培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养30天，获得不定芽；所述诱导培养基的配方为：DCR+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.005 mg/L+6-BA 1.0mg/L；
4）增殖培养：将步骤3）培养得到的不定芽经切割后转接到增殖培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养35天，获得继代苗；所述增殖培养基的配方为：MS +6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.06 mg/L；
5）生根培养：将步骤4）培养得到的继代苗接种到生根培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养15天，获得生根苗；所述生根培养基的配方为：MS +NAA 1 mg/L+IBA 1 mg/L；
6）炼苗：将步骤5）培养得到的生根苗转到炼苗室进行炼苗；
7）生根苗的移栽：在炼苗10天后，待根系由白色转变成灰白色时，将生根苗进行移栽，移栽时先将生根苗于清水中漂洗，去除根部的培养基，然后晾干根系的表面水分，再将生根苗栽入装有由营养土、蛭石和珍珠岩按2:2:1(v/v)混合制得的基质的容器中进行培养。
实施例3
一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其包括如下步骤：
1）播种：选取成熟饱满的种子，用自来水浸泡24 h后于室温（25±2℃）下播种于由营养土、蛭石和珍珠岩按2:2:1(v/v)混合制得的基质中；
2）消毒：种子萌发20天后，选取生长健壮的幼苗，用自来水清洗干净，去根后依次用75vol%酒精浸泡1min、0.1vol%升汞溶液浸泡7min、无菌水冲洗5次；
3）诱导培养：将消毒后的幼苗取子叶切段作为外植体，接种到诱导培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养30天，获得不定芽；所述诱导培养基的配方为：DCR+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.005 mg/L+6-BA 1.0mg/L；
4）增殖培养：将步骤3）培养得到的不定芽经切割后转接到增殖培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养35天，获得继代苗；所述增殖培养基的配方为：MS +6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.06 mg/L；
5）生根培养：将步骤4）培养得到的继代苗接种到生根培养基上，在光照速率80 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h/d、培养温度25±2℃的条件下培养15天，获得生根苗；所述生根培养基的配方为：MS +NAA 1 mg/L+IBA 1 mg/L；
6）炼苗：将步骤5）培养得到的生根苗转到炼苗室进行炼苗；
7）生根苗的移栽：在炼苗10天后，待根系由白色转变成灰白色时，将生根苗进行移栽，移栽时先将生根苗于清水中漂洗，去除根部的培养基，然后晾干根系的表面水分，再将生根苗栽入装有由营养土、蛭石和珍珠岩按2:2:1(v/v)混合制得的基质的容器中进行培养。
效果验证
为进一步说明本发明以杉木子叶为外植体的高效再生方法的应用价值，分以下四组做对比试验：第一组采用实施例1所述培养方法；第二组采用实施例2所述培养方法；第三组采用实施例3所述培养方法；第四组将诱导培养基配方更换为DCR+6-BA 1.0mg/L+TDZ0.003mg/L+ NAA 0.1mg/L，增殖培养基更换为DCR+6-BA 1.0mg/L+TDZ 0.002mg/L +NAA0.1mg/L，生根培养基更换为1/4MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L，其他方式严格按照实施例3进行。观察上述四组组培苗的情况，并记录各组的发生不定芽子叶数、不定芽诱导率，结果见表1。
表1 四组杉木子叶不定芽诱导结果
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根据上表可知，采用本发明方法培育得到的杉木种苗，不定芽多，不定芽诱导率高，适用于杉木遗传转化，值得推广。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）播种：选取成熟饱满的种子，用自来水浸泡24 h后于室温下播种于基质中；
2）消毒：种子萌发20天后，选取生长健壮的幼苗，用自来水清洗干净，去根后依次用75vol%酒精浸泡30-60s、0.1vol%升汞溶液浸泡5-7 min、无菌水冲洗5次；
3）诱导培养：将消毒后的幼苗取子叶切段作为外植体，接种到诱导培养基上培养30天，获得不定芽；
4）增殖培养：将步骤3）培养得到的不定芽经切割后转接到增殖培养基上培养35天，获得继代苗；
5）生根培养：将步骤4）培养得到的继代苗接种到生根培养基上培养15天，获得生根苗；
6）炼苗：将步骤5）培养得到的生根苗转到炼苗室进行炼苗；
步骤1）中所用基质是将营养土、蛭石和珍珠岩按体积比2:2:1混合制得；
步骤3）中所述诱导培养基的配方为：DCR+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.005 mg/L+6-BA1.0mg/L；
步骤4）中所述增殖培养基的配方为：MS+ 6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.06 mg/L；
步骤5）中所述生根培养基的配方为：MS+NAA 1 mg/L+IBA 1 mg/L；
诱导培养、增殖培养及生根培养时的培养条件均为：光照强度80 μmol·m-2·s-1，光照时间16 h/d，培养温度25±2℃。
2.根据权利要求1所述的以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其特征在于：所述再生方法还包括生根苗的移栽，其具体是在炼苗10天后，待根系由白色转变成灰白色时，将生根苗先于清水中漂洗去除根部的培养基，然后晾干根系的表面水分，再将生根苗于基质中进行培养。
3.根据权利要求2所述的以杉木子叶为外植体的高效再生方法，其特征在于：所用基质是将营养土、蛭石和珍珠岩按体积比2:2:1混合制得。
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