CN110915654A

CN110915654A - 一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法

Info

Publication number: CN110915654A
Application number: CN201911198173.8A
Authority: CN
Inventors: 陈金慧; 郭玉琳; 施季森; 肖保荣; 郑仁华
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-03-27
Also published as: WO2021103166A1

Abstract

本发明公开了一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，属于植物组培技术领域。本发明所提供的方法具体为：以DCR为基本培养基，附加有浓度不超过8mg/L的亚精胺作为杉木体胚诱导培养基；通过杉木未成熟球果获得未成熟种胚，将其放在在愈伤诱导培养基上培养25～30天获得杉木胚性胚柄团；将所得杉木胚性胚柄团放入杉木体胚诱导培养基中，于培养箱中进行暗培养，诱导促进杉木体胚发生，23℃条件下，培养60～100天，即可得到比对照数目最高可达2倍以上的体胚，大大提高了杉木体胚的诱导效率，具有很好的实用性。

Description

一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，更具体地说，涉及一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法。

背景技术

杉木(Cunninghina lanceolata)隶属于杉科杉木属，是我国重要用材树种之一，其生长快、干形通直圆满，材质轻软细致，易加工，纹理美观，有特殊香气，不翘不裂，抗蛀耐腐，是建筑、家具、桥梁、造船、造纸及木纤维等工业的优良原材料。目前，主要通过三种途径繁殖杉木种苗：种子、扦插和传统组织培养[温亚锋.基于未成熟合子胚的杉木胚性组织诱导和继代的研究[D].福建农林大学，2011.]，但是良种种子产量、种子播种品质不稳定，第2代以上高级良种供应不足，且种子播种品质差，尤其是种子涩粒多，通常占重量的40％～60％[郑仁华.杉木遗传育种研究进展与对策[J].世界林业研究，2005(03)：63-65.]；而扦插育苗则受到母树穗条的多少、场地空间及生根率等方面的限制，其规模很难满足现代林业生产对杉木种苗的大量需求；此外，传统的组织培养根的诱导较为困难，诱导出的根数量少且弱，在一定程度上影响了苗木质量和造林的成功率。因此建立高效率的杉木未成熟胚的胚胎发生体系，有利于加快杉木速生优苗的产业化发展。

体细胞胚发生属于无性繁殖技术，生产出的种苗遗传背景差异小，苗木整齐。与扦插和传统组织培养相比，其规模更大、成本更低。然而，作为裸子植物的杉木，体胚的发生与被子植物的体细胞胚发生有着完全不同的途径和机理，成熟的种子以及由种子发育而来的植株，营养细胞转变为胚性细胞十分困难。但在针叶树种中，雌配子体受精后发育成种子的过程中有一部分珠心细胞处于未分化的阶段，在适当的培养条件下，可以利用裂生多胚特性，诱导体胚形成。Gupta等(1985，1995)报道过利用这一生物学特性，诱导出花旗松(Pseudotsuga menziesii)和湿地松(Pinuselliottii)的体胚，其大致可以分为四个步骤：胚性胚柄细胞团(ESM：Embryogenesissuspensor mass)的诱导、保持和增殖、体胚的成熟、萌发和植株再生，并证明该技术体系具有达到产业化的前景。

然而，目前虽有采用杉木未成熟胚诱导体胚发生的报道，但是只能在外植体上形成个别体细胞胚，存在诱导率低、数量少的问题，难以在生产上应用。因此建立高效率的杉木未成熟胚的胚胎发生体系，有利于加快杉木速生优苗的产业化发展。多胺是广泛分布于植物体内，对植物生长发育有多种调节功能的物质，一般植物体内有10多种多胺，包括腐胺(Put)、精胺(Spm)、亚精胺(Spd)和尸胺(Cad)等。研究发现，内源多胺含量的升高是植物体胚发生的前提，植物激素通过多胺介导影响体胚发生，但目前未见将亚精胺应用于杉木体胚发生的报导。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，能够提高杉木体胚诱导效率。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法：取杉木胚性胚柄团加入体胚诱导培养基中，于培养箱中进行暗培养，诱导促进杉木体胚发生；其中，体胚诱导培养基：以DCR为基本培养基，附加有浓度不超过8mg/L的亚精胺。

所述的体胚诱导培养基还包括：1mg/L VC，0.45g/L谷氨酰胺，0.5g/L水解酪蛋白，2～4g/L Ac，2.8g/L水晶洋菜，0.2g/L天冬酰胺，0.2g/L脯氨酸，100～200g/L PEG，1～5mg/L GA，2～8mg/LABA。

所述的亚精胺，其浓度为2～8mg/L。

所述的亚精胺，其浓度为4mg/L。

所述暗培养的培养温度为23℃，培养时间为60～100天。

所述的亚精胺浓度为2-4mg/L。

所述杉木胚性胚柄团的获取方法为：取杉木未成熟球果得到杉木种子，在超净工作台中让杉木种子先灭菌后，在显微镜下去除种皮，切开胚乳取出种胚，将种胚放入愈伤诱导培养基中，暗培养，培养温度为23℃，培养25～30天，即得杉木胚性胚柄团；其中，所述的愈伤诱导培养基为DCR培养基中加入0.5mg/L KT，0.5mg/L BA，1mg/L VC，1～2mg/L 2，4-D，0.45g/L谷氨酰胺，0.5g/L水解酪蛋白，2.5g/LAc，2.3g/L水晶洋菜。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：本发明所提供的利用亚精胺促进杉木体胚发生方法，是以DCR为基本培养基，附加有浓度不超过8mg/L亚精胺，取杉木胚性胚柄团接种到所述的体胚诱导培养基上，于培养箱中进行暗培养，培养温度为23℃，诱导促进杉木体胚发生，培养60～100天，即可得到比对照数目最高可达2倍以上的体胚，大大提高了杉木体胚的诱导效率，由此建立了高效率的杉木未成熟胚的胚胎发生体系，有利于加快杉木速生优苗的产业化发展，具有很好的实用性。

附图说明

图1为不同浓度亚精胺处理下杉木成熟子叶胚A发生数统计图；

图2为体视镜下不同培养时间不同浓度亚精胺处理下杉木体胚A发育状态图；a～d是添加4mg/L亚精胺在0、10、20、30天的胚性胚柄团发育过程，e～i分别是45d时添加0、2、4、6、8mg/L的亚精胺胚性胚柄团发育情况，a～d标尺为2毫米，e～i标尺为5毫米；

图3为不同浓度亚精胺处理下成熟子叶胚B发生数统计图；

图4为体视镜下不同培养时间不同浓度亚精胺处理下杉木体胚B发育状态图；a～d是添加2mg/L亚精胺在0、10、20、30天的胚性胚柄团发育过程，a～d标尺为2mm，e～i标尺为5mm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例中所使用的原材料为福建洋口林场随机采集的未成熟球果，并做好标记，通过未成熟合子胚诱导的胚性胚柄团(标记为A、B，随机来自不同的两棵杉木)为起始材料。

实施例1

母液配制：亚精胺易溶于水，称取1.0g亚精胺粉末于烧杯中用超纯水溶解，并定容至1L，配置成1mg/mL的亚精胺母液，最后将其转移到4℃冰箱中，用棕瓶保存备用。

胚性胚柄团诱导和增殖培养基：杉木胚性胚柄团诱导是杉木种子诱导形成愈伤的过程，培养基配方为DCR培养基中加入0.5mg/L KT，0.5mg/L BA，1mg/L VC，1～2mg/L 2，4-D，0.45g/L谷氨酰胺，0.5g/L水解酪蛋白，2.5g/LAc，2.3g/L水晶洋菜。

体胚诱导培养基：杉木体胚诱导是杉木愈伤诱导形成体胚的过程。培养基配方为DCR基本培养基中加入1mg/L VC，0.45g/L谷氨酰胺，0.5g/L水解酪蛋白，2～4g/L Ac，2.8g/L水晶洋菜，0.2g/L天冬酰胺，0.2g/L脯氨酸。100～200g/L PEG，1～5mg/L GA，2～8mg/LABA。

胚性胚柄团诱导与增殖：在超净工作台中让杉木种子先灭菌后，在显微镜下去除种皮，切开胚乳取出种胚，将胚放入愈伤诱导培养基中，胚和培养基要尽可能接触，这样有助于愈伤组织的形成。杉木愈伤继代周期为25～30天，暗培养，培养温度为23℃。

体胚诱导：将胚性胚柄团A和B分别加入不同浓度(0、2、4、6、8mg/L)的亚精胺体胚培养基中，以不添加外源亚精胺(0mg/L)培养基诱导的体胚材料为对照，每皿接种6块愈伤，至少3皿重复，暗培养，培养温度为23℃。

采用One WayANOVA、多重比较检验法进行数据统计和分析，分析软件为SPSS16.0，显著性水平设为α＝0.05，采用GraphPad对SPSS软件分析结果进行绘图。

(1)胚性胚柄团A的体胚发生

如图1可知，在60天时，随着浓度的增加，胚性胚柄团A成熟子叶胚的个数增加；在60d时，0～8mg/L亚精胺处理下平均每皿的子叶胚个数为5.3、7.67、11.3、11、9个，通过方差分析得知，4mg/L时，平均每皿成熟子叶胚的数量与对照组具有显著差异，其余各组间没有显著差异；在100天时，成熟子叶胚个数迅速增加，4mg/L亚精胺处理后子叶胚个数最多，平均每皿成熟子叶胚个数为25.3个，是对照组成熟子叶胚个数的1.90倍；其余浓度处理下的子叶胚数目与对照相比无显著差异。通过以上分析可知，4mg/L的多胺有助于胚性胚柄团A的体胚发生。如图2中，在30d时，4mg/L的亚精胺处理下杉木体胚与对照组(图2d)相比已经分化出子叶胚(图2d)，在45d时，各个亚精胺浓度处理下，均已经分化出子叶胚，4mg/L亚精胺处理后的子叶胚数量最多(图2g)。综述所诉，4mg/L的亚精胺能有效促进0183基因型体胚发生。

(2)胚性胚柄团B的体胚发生

由图3可知，在60天时，0～8mg/L的亚精胺平均每皿的子叶胚数量分别为14、22、18.6、14.6、13，其中2mg/L的亚精胺处理后平均每皿成熟子叶胚数量最高，但与对照组不具有显著差异，但与8mg/L的亚精胺处理后的子叶胚数相比具有显著差异，其余各组间没有显著差异；在100天时，2mg/L的亚精胺的成熟子叶胚个数与对照组和6～8mg/L的亚精胺都具有显著差异，子叶胚数量约为对照组的1.53倍，说明2mg/L亚精胺对胚性胚柄团B的体胚发生具有促进作用；而6～8mg/L的亚精胺会抑制体胚发生。如图4中，通过表型观察可知，2mg/L的亚精胺处理下的胚性胚柄团B体胚发生数较多(图4f)；而对照组体胚发生数少于2mg/L(图4e)，4mg/L亚精胺在30d时产生的柱状胚含量较多(图4d)。综上所述，2mg/L的亚精胺有助于杉木胚性胚柄团B的体胚发生。

Claims

1.一种利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，其特征在于，取杉木胚性胚柄团加入体胚诱导培养基中，于培养箱中进行暗培养，诱导促进杉木体胚发生；其中，体胚诱导培养基：以DCR为基本培养基，附加有浓度不超过8mg/L的亚精胺。

2.根据权利要求1所述的利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，其特征在于，所述的体胚诱导培养基还包括：1mg/L VC，0.45g/L谷氨酰胺，0.5g/L水解酪蛋白，2～4g/L Ac，2.8g/L水晶洋菜，0.2g/L天冬酰胺，0.2g/L脯氨酸，100～200g/L PEG，1～5mg/L GA，2～8mg/LABA。

3.根据权利要求2所述的利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，其特征在于，所述的亚精胺，其浓度为2～8mg/L。

4.根据权利要求1～3任一所述的利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，其特征在于，所述暗培养的培养温度为23℃，培养时间为60～100天。

5.根据权利要求1～3任一所述的利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，其特征在于，所述的亚精胺浓度为2-4mg/L。

6.根据权利要求1～3任一所述的利用亚精胺促进杉木体胚发生的方法，其特征在于，所述杉木胚性胚柄团的获取方法为：取杉木未成熟球果得到杉木种子，在超净工作台中让杉木种子先灭菌后，在显微镜下去除种皮，切开胚乳取出种胚，将种胚放入愈伤诱导培养基中，暗培养，培养温度为23℃，培养25～30天，即得杉木胚性胚柄团；其中，所述的愈伤诱导培养基为DCR培养基中加入0.5mg/L KT，0.5mg/L BA，1mg/L VC，1～2mg/L 2，4-D，0.45g/L谷氨酰胺，0.5g/L水解酪蛋白，2.5g/L Ac，2.3g/L水晶洋菜。