KR20190046554A

KR20190046554A - 체세포배 유래 자구를 인편번식 과정 없이 바로 재배하여 백합 개화구를 조기 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20190046554A
Application number: KR1020170140478A
Authority: KR
Inventors: 안병준; 강수지; 안영모
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2019-05-07

Abstract

본 발명은 백합 식물에서 배발생세포를 생물반응기 액체배양을 통해 증식하여 고체 배지에서 자구 재분화 및 비대하는 과정을 통해 백합 조직배양구를 대량생산하고, 이를 인편번식 과정없이 바로 순화재배 및 토경을 통하여 개화구를 생산하는 기술이다. 더욱 상세하게는 나팔나리, 동양계백합, 종간잡종나리 등 여러 백합류에서 체세포 배발생세포를 대량증식하고 이로부터 자구를 값싸게 대량생산한 후 이를 인편번식 없이 바로 순화재배 및 토경을 거쳐 개화구를 생산함에 있어서, (1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계 및 (2) 상기 대량 증식된 배발생세포 덩어리를 잘게 부스어 고체 배지에 고르게 치상하고 암배양 과정을 거쳐 자구를 대량생산하며, (3) 이를 온실 인공토에서 순화재배와 토양 양구 과정을 거쳐 개화구를 바로 생산하는 것이다. 본 기술의 핵심은 여러 종류의 백합에서 체세포배 유래 자구를 최소의 인력으로 대량생산함으로써 기내자구를 개화구 생산에 바로 이용하는 새로운 작형을 개발하는 것이다.

Description

체세포배 유래 자구를 인편번식 과정 없이 바로 재배하여 백합 개화구를 조기 생산하는 방법 {Methods for the rapid production of lily flowering bulbs through direct cultivation of somatic embryo-derived bulblets without the procedures of bulb scale vegetative propagation}

본 발명은 백합 식물에서 배발생세포를 생물반응기 액체배양을 통해 증식하여 고체 배지에서 자구 재분화 및 비대하는 과정을 통해 백합 자구를 대량생산하고, 이를 인편번식 과정없이 바로 순화재배 및 토경을 통하여 개화구를 생산하는 기술이다. 더욱 상세하게는 나팔나리, 동양계백합, 종간잡종나리 등 여러 백합류에서 체세포 배발생세포를 대량증식하고 이로부터 자구를 값싸게 대량생산한 후 이를 인편번식 없이 바로 순화재배 및 토경을 거쳐 개화구를 생산함에 있어서, (1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계 및 (2) 상기 대량 증식된 배발생세포 덩어리를 잘게 부스어 고체 배지에 고르게 치상하고 암배양 과정을 거쳐 자구를 대량생산하며, (3) 이를 온실 인공토에서 순화재배와 토양 양구 과정을 거쳐 개화구를 바로 생산하는 것이다. 본 기술의 핵심은 여러 종류의 백합에서 체세포배 유래 자구를 최소의 인력으로 대량생산함으로써 기내자구를 개화구 생산에 바로 이용하는 새로운 작형을 개발하는 것이다.

백합의 주요 품종들은 교배종으로서 대부분 인편번식을 이용하는 영양번식을 통해 증식되며 이렇게 얻은 자구를 3-4년간 비대시켜 개화구를 생산한다. 백합에는 20 여종의 바이러스가 피해를 주는 것으로 보고되고 있으며, 절화재배시 품질에 큰 영향을 미치는 것으로 Lily mottle virus (LMoV), Lily symptomless virus (LSV), Cucumber mosaic virus (CMV) 와 Tulip breaking virus (TBV) 등이 알려져 있다.

주요 절화백합인 동양계백합을 포함하여 대부분의 백합의 개화구의 생산은 메리스템배양을 통해 얻은 무병주 기본식물의 인편을 기내에서 조직배양을 통해 증식하는데, 조직배양구의 값이 비싸기 때문에 이를 2년 정도 순화재배를 통해 비대시킨 구주 10-12cm 정도의 구근에서 인편을 채취하여 인편자구를 얻는 인편번식 과정을 거치며, 이들 인편자구를 3년 정도 토양재배하여 개화구를 얻게 되는 복잡한 과정을 거치고 있다. 특히 바이러스 무병성 조직배양구를 2-3년 양구하여 인편번식에 이용하기까지 격리재배가 필요하지만 시설과 노력이 많이 들고 이 기간 중에 2차 바이러스 감염이 큰 문제가 되고 있다. 백합 조직배양은 인편을 배양하여 다수의 자구를 얻는 방법으로서 전 세계적으로 통용되고 있지만 인력에 의존하기 때문에 인도나 동남아 국가에서 생산하여 이용하고 있다. 국내에서도 인편조직배양에 관한 다수의 기술이 보고되고 있지만 기존 기술의 개선 정도이며, 탱크배양이나 저반부배양 방법이 개발되어 있으나 대량생산 효과가 입증되고 있지 않아 현재 이용되고 있지 않거나 소규모로 정부기관에서 이용되고 있을 뿐이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내외 기존 조직배양 기술과는 달리 주요 백합 품종의 구근 조직에서 배발생 캘러스를 유도하고, 이를 생물반응기를 이용한 액체배양을 통하여 대량 증식하며, 고체 배지에서 자구를 최소의 인력으로 자구를 대량생산함으로써 고품질의 조직배양구를 기존 방식 보다 훨씬 저가로 생산 공급함으로써 인편 영양번식을 통한 추가적인 증식 과정없이 백합의 개화구를 생산하는 새로운 생산 체계를 개발하고자 하였다. 따라서, 본 발명에서는 주요 백합 품종의 배발생세포 유도 및 증식 조건을 최적화하였으며, 배발생세포를 미세한 크기로 고체 배지에 치상하고 암배양하여 체세포배 재분화와 자구 형성시키는 방법을 개발하여 기내자구를 대량생산 할 수 있었으며, 이를 온실순화재배와 토경을 통해 우수한 품질의 개화구를 바로 생산함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 나팔나리, 동양계백합, 종간잡종나리 등을 포함하는 여러 백합류에서 체세포 배발생세포를 대량증식하고 이로부터 자구를 값싸게 대량생산한 후 이를 인편번식 없이 바로 순화재배 및 토경을 거쳐 개화구를 생산함에 있어서, (1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계 및 (2) 상기 대량 증식된 배발생세포 덩어리를 미세화하여 고체 배지에 고르게 치상하고 암배양 과정을 거쳐 자구를 대량생산하며, (3) 이를 온실 인공토에서 순화재배와 토양 양구 과정을 거쳐 개화구를 바로 생산하는 것이다. 본 기술의 핵심은 여러 종류의 백합에서 체세포배 유래 자구를 최소의 인력으로 대량생산함으로써 기내자구를 개화구 생산에 바로 이용하는 새로운 작형을 개발하는 것이다.

본 발명은 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스 유도 및 증식하여 고체배지에서 체세포배 유래 자구를 생력적으로 대량생산함으로써 조직배양구를 개화구 생산에 바로 이용하는 생산 체계를 제공하는 것이다. 기존의 생산 체계는 (1) 인편 조직배양을 통한 조직배양구 생산, (2) 2-3년에 걸친 조직배양구 순화재배, (3) 인편번식을 통한 인편자구 증식 및 3년에 걸친 토경을 통해 개화구를 생산하던 것에 반하여, 본 발명을 이용하면 (1) 체세포배 유래 자구 저가로 대량생산, (2) 자구 순화재배 및 2년의 토경을 통한 개화구 생산 과정으로 단축된다. 결과적으로, (1) 값싸고 바이러스 무병성 조직배양구 대량생산, (2) 2-3년에 걸친 인편 조직배양구 격리 순화재배 불필요, (3) 인편번식을 통한 증식 과정 불필요 효과를 기대할 수 있다. 따라서 백합의 조직배양구 대량번식 및 개화구 생산 체계를 혁신함으로써 원예산업에 기여하는 매우 유용한 발명이다.

도 1은 백합의 일반적인 구근 생산 체계와 본 발명이 제시하는 새로운 체계이다. 기존의 방법은 도면의 윗부분에서처럼 백합의 (1) 인편인편 조직배양을 통한 조직배양구 생산, (2) 2-3년에 걸친 조직배양구 순화재배, (3) 인편번식을 통한 인편자구 증식 및 3년에 걸친 토경을 통해 개화구를 생산하는 과정을 보여 주고 있다. 도면 아래의 본 발명 체계에서는 (1) 체세포배 유래 자구 저가로 대량생산, (2) 자구 순화재배 및 2년의 토경을 통한 개화구 생산 과정으로 단축된다. 결과적으로, (1) 값싸고 바이러스 무병성 조직배양구 대량생산, (2) 2-3년에 걸친 인편 조직배양구 격리 순화재배 불필요, (3) 인편번식을 통한 증식 과정 불필요 효과를 기대할 수 있다.
도 2는 국외와 국내의 백합 생산 체계를 보여 주고 있다. 위 그림은 네델란드의 전형적인 생산 체계로서 조직배양구는 인건비가 저렴한 아시아 국가에서 자구 당 0.25유로에 구입하여, 2년간의 순화재배, 인편 영양번식, 3년 간의 토경을 통한 개화구 생산 과정을 보여 준다. 아래 그림은 국내의 생산 과정으로 네델란드와 유사하다. 다만 국내에서는 정부 보조사업으로서 지자체 기술원에서 조직배양구를 생산하여 저가로 양구 농가에 공급하고 있다.
도 3a은 배발생세포의 생물반응기 배양을 나타낸다. 5리터형 생물반응기에서 배양 중인 다양한 백합류의 배발생세포 증식 과정을 보여 주고 있다. 생물반응기에서 배양된 배발생 캘러스괴 확대사진을 볼 수 있는데, 세포 덩어리는 전배체 상태를 보여 주고 있다. 도 3b에서는 증식된 배발생세포를 미세화하여 재분화 배지에서 치상하여 암배양하고 있는데, 배발생세포에서 체세포배 재분화에 이어 바로 자구가 형성되고 비대되고 있는 것을 볼 수 있는데 이러한 과정은 일일이 배양체 마다 사람 손에 의해 이식되는 기존 방식과는 다르다. 도 3c는 암배양 과정에서 생산된 자구의 수확 과정을 보여 준다. 자구들은 8주간의 저온처리를 거쳐 순화재배에 이용된다.
도 4a은 체세포배 유래 자구를 격리온실에서 순화재배한 동양계백합 유묘를 보여 주고 있으며, 도 4b는 순화재배 5개월 후의 소중구로서 구주 평균 6cm 크기로 비대한 모습을 보여 주고 있다.
도 5에서는 체세포배 유래 동양계백합 중구를 제주와 충남 서산 농가에서 실증재배하는 모습을 보여 주며 우소하며 정상적인 개화를 보여주고 있다.
도 6에서는 국내와 해외 (베트남 달랏) 재배농가에 체세포배 유래 자구를 시험 보급하고 있다.
도 7은 액체현탁 배양을 통한 배발생 캘러스 급속 증식 조건을 규명한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에서 사용된 MS(Murashige & Skoog) 배지는 3% 수크로스 및 0.3% 젤라이트를 포함한 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (1) 단계의 액체 배지는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 피클로람(picloram) 및 BA가 포함된 MS 배지일 수 있고,

바람직하게는 0.3~2.0 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~1.0 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.3~2.0 ㎎/l 피클로람(picloram) 및 0.1~1.0 ㎎/l BA가 포함된 MS 배지일 수 있 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 백합은 Lilium속 식물 (Lilium species)일 수 있고, 동양계백합 나팔나리 OT종간잡종 등을 포함하는데 바람직하게는 소르본느 (sorbonne), 시베리아 (Siberia), 리틀핑크 (Little Pink), 소노우화이트 (Snow White), 루시퍼 (Lucifer), 오리엔탈 트럼펫 종간잡종 계통 들을 포함하는 백합 품종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (2) 단계의 고체 배지는 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 본 발명은 백합 구근 조직에서 유도 및 증식된 배발생세포로부터 체세포배 재분화와 이어서 백합 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,

(1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내의 0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및

(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:

를 포함할 수 있고, 바람직하게는

(1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내의 0.3 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.15 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계 및

를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 백합 자구를 제공한다.

또한, 본 발명은 0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/l 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA가 포함된 MS 액체 배지를 유효성분으로 함유하는 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

(1) 품종별 배발생 캘러스 유도 조건 및 재분화능 확인

식물 재료

백합 동양계, 나팔나리계, 오리엔탈 트럼펫 종간잡종계 품종(소르본느 (sorbonne), 시베리아 (Siberia), 리틀핑크 (Little Pink), 소노우화이트 (Snow White), 루시퍼 (Lucifer), 오리엔탈 트럼펫 종간잡종 계통)의 배발생 캘러스 유도 효율과 재분화능을 확인하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 품종별로 구근을 절개하여 채취한 인편을 횡축으로 자른 1mm 두께의 절편체를 처리별 배지에 치상하였다. 백합 구근은 겉껍질을 제거한 뒤, 흐르는 물에 씻어낸 뒤 화뢰를 절취하여 70% 에틸알코올에 30초간 침지 처리하고, 1% NaClO 용액(Tween X를 1방울 첨가)에서 10분간 진탕 소독하였다. 멸균수로 3차례 이상 헹군 다음 횡축으로 1mm 두께로 썰어 치상하였다.

배지 조성

MS(Murashige & Skoog) 기본 배지에 3% 수크로스를 첨가하였으며 0.3% 젤라이트로 고형화한 배지를 페트리디시 당 25 ㎖ 분주하여 배양에 이용하였다. 품종별 배발생 캘러스 유도 조건을 구명하기 위하여 오옥신계 생장조절제로서 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram), 디캄바(dicamba)를 4 mg/L의 농도로 0.5 mg/L BA(benzyl adenine)와 함께 조합 처리하였다. 배양체들은 4주 간격으로 같은 배지에 계대배양 하였으며 12주 후 캘러스 형성 정도 및 배발생 캘러스 유도율을 조사하여 품종별 배발생 분화능을 판단하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재하였다.

(2) 배발생 캘러스 유도 및 증식을 위한 품종별 옥신 최적 요구도 조사

백합의 구근 절편체로부터 배발생 캘러스를 유도하는 최적 조건을 구명하기 위하여 본 실험을 수행하였다.

식물 재료

백합 3품종('Marco Polo’, Siberia, Casa blanca’)의 구근을 위와 같은 방법으로 처리하여 절편체를 얻어 처리별로 배지에 치상하였다.

배지조성

MS 기본배지(3% 수크로스, 0.3% gelite 첨가)에 2,4-D, 피클로람, 디캄바를 각각 1, 3, 6, 9mg/L, 시토키닌으로서 BA, 키네틴(kinetin), 디메틸알릴아미노퓨린(2ip)를 0.5 mg/L 조합 처리한 전체 12가지의 배지를 사용하여 최적 배발생 캘러스 유도 조건을 조사하였다. 배양체들은 4주 간격으로 같은 배지에 계대배양 하였으며 12주 후 캘러스 형성 정도 및 배발생 캘러스 유도율을 조사하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재하였다.

(3) 액체현탁 배양을 통한 배발생 캘러스 급속 증식 조건 구명

한천 배지 배양에서 얻어진 품종별 배발생 캘러스를 활용하여 액체배양 급속 증식 조건을 구명하고자 하였다. '마르코폴로(Marco Polo)' 백합의 배발생 캘러스 500mg 정도를 25㎖ 액체 배지를 넣은 250㎖ 플라스크에서 현탁배양을 실시하였다. MS 기본배지에 3% 자당이 함유된 액체 배지에 생장조절제를 달리하여 처리하였다. 사용한 생장조절제 처리는 피클로람을 0, 1.0, 3.0 mg/L, zeatin 0.3, 1.0, 3.0 mg/L 등 여섯 가지로 하였으며 피클로람 처리 배지에는 BA를 오옥신 농도의 절반을 첨가하였으며 처리별로 3 반복을 실시하였다. 배양체들은 매주 계대배양시 생체량을 측정하여 생체량 증가를 초기 생체중에 대한 백분율로 표시하여 조사하였다.

(4) 생물반응기를 이용한 배발생 캘러스 급속 증식

식물재료

시베리아(Siberia) 등 7 품종의 배발생세포를 5 리터 생물반응기에서 배양하였다. 배양체들은 일차적으로 플라스크를 이용한 현탁배양을 통하여 증식된 것으로서 5-10 g 정도를 생물반응기 초기배양에 이용하였다.

생물반응기 배양

5 리터 벌룬형(balloon type) 반응기에 MS 기본 액체 배지에 2,4-D를 0.25mg/L 또는 0.5 mg/L 첨가하여 이용하였으며 BA는 2,4-D의 1/2 농도를 사용하였다. 계대 배양은 5일 간격으로 적당량의 배지를 추가하였으며 배양의 측정은 Packed cell volume을 이용하였다.

(5) 식물체 재분화 및 자구 형성

생물반응기에서 배양된 전배체 상태의 세포괴를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS 재분화 한천 배지에 치상하여 식물체 재분화 및 자구 형성 정도를 조사하였다. 배발생세포들은 직경 5-30mm의 다양한 크기로 덩어리져 증식하기 때문에 이를 소형 블렌더를 3초씩 여러 차례 분쇄하여 2-3 mm 크기로 미세화한 후 치상하였다. 재분화 배지는 10×10cm 백합 용기(한국과학기기)에 100㎖씩 분주하여 이용하였다. 배발생세포 미세 덩어리들은 용기당 0.5-1.0g 정도를 표면에 치상하고 25에서 암배양을 하며 자구의 생성 정도를 조사하였다.

실시예 1. 백합 주요 품종의 배발생 캘러스 유도를 위한 최적 배양 조건 구명

백합 구근을 절편체로 이용하여 오옥신과 시토키닌을 조합하여 처리한 MS 배지에 치상하여 배양한 결과, 품종별로 배발생 캘러스가 다양한 빈도로 유도되었다(표 1). 일반 단자엽 식물의 경우 1-2 mg/L 2,4-D 첨가에 의하여 대부분 캘러스가 잘 유도되는 반면, 백합의 경우에는 피클로램에서 가장 캘러스 유도 효율이 높았으며 2,4-D의 경우에는 거의 유도되지 않거나 9 mg/L 농도에서 10%의 효율로 유도가 되었다. 전체적으로 발생 효율의 차이는 있었지만 실험에 사용된 3 품종 모두에서 피클로람 1-5 mg/L를 BA 0.5 mg/L와 함께 처리한 MS 기본배지(3% 자당, 0.3% 젤라이트)에서 배양하면 모든 품종에서 배발생 캘러스를 유도할 수 있었다.

실시예 2. 액체현탁 배양을 통한 배발생 캘러스 급속 증식 조건 구명

'마르코폴로(Marco Polo)' 백합의 배발생 캘러스 500mg 정도를 25㎖ 액체 배지를 넣은 250㎖ 플라스크에서 현탁배양을 실시하였다. MS 기본배지에 3% 자당이 함유된 액체 배지에 생장조절제를 피클로람을 0, 1.0, 3.0 mg/L, zeatin 0.3, 1.0, 3.0 mg/L 등 여섯 가지로 하였으며 피클로람 처리 배지에는 BA를 오옥신 농도의 절반을 첨가하였으며 처리별로 3 반복을 실시하였다. 생체량 증가를 피크로램을 첨가한 처리 보다 zeatin을 처리하였을 때 생체량이 현저하게 증가하였다. 이는 액체배양시 고농도의 피클로램 보다 오히려 시토키틴인 zeatin이 효과적일 수 있음음 보여 주고 있다. 고농도의 오옥신 처리가 배양체의 변이 발생 가능성을 높힌다는 것을 고려하였을 때 저농도의 피클로램이나 zeatin 1-3 mg/L가 증식에 효과적임을 알 수 있다(도 7)

실시예 3. 생물반응기를 이용한 배발생 캘러스 급속 증식

백합의 배발생 캘러스 액체현탁 배양을 대량 및 급속으로 하기 위하여 생물반응기를 이용한 급속증식을 시도하였다. '시베리아(Siberia)' 등 11 품종의 배발생세포를 생물반응기 배양을 통해 증식하였는데, 일차적으로 플라스크를 이용한 현탁배양을 통하여 5-10 g 정도의 배양체를 증식하며 이를 이용하여 생물반응기 배양을 통한 대량 증식을 실시하였다. 생물반응기의 air-lift를 통하여 극성을 제거한 상태에서 생장조절제 농도를 최적, 최소 농도로 유지하는 조건을 규명하였는데, 일반적으로 2,4-D 0.3-0.5 mg/L, BA 0.25 mg/L 조합처리가 품종에 따라 증식 정도는 다르지만 보편적으로 생장이 가장 좋게 나타났다. 도 3a에서 보듯이 생물반응기에서 배양되는 조직들은 원래 치상한 배발생 캘러스괴의 10-50배에 달하는 직경 2-3 cm의 세포괴를 형성하는데 이들 조직은 전형적인 배발생 캘러스의 집합체로서 3-5 mm의 세포괴가 엉성한 상태로 덩어리를 형성하며 약간의 물리적인 힘에 의해서도 부스러지는 특성을 가지고 있다. 실질적으로 이들 세포괴는 체세포 배발생의 전단계인 구형의 전배체가 증식되는 형태를 가지며, 이들은 재분화 배지에서 1-2 주 내에 배발생이 일어나 자엽형 성숙배를 형성하는 분화능이 매우 뛰어난 세포적 특성을 보여 주었다. 백합 일곱 품종의 배발생 캘러스를 생물배양기에서 증식해 본 결과, 대부분이 갈변화가 심하지 않은 상태에서 잘 증식되었다.

실시예 4. 식물체 재분화 및 자구 형성

생물반응기에서 배양된 동양계, 나팔나리계, OT종간잡종 계 등 11품종의 전배체 상태의 배발생세포괴를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS 재분화 한천 배지에 치상하여 식물체 재분화 및 자구 비대를 통해 자구를 생산하였다. 생장조절제가 함유되지 않은 MS 기본배지(3% 자당, 0.3% 젤라이트 함유)를 백합용기에 100㎖씩 분주하여 이용하였다. 배발생 캘러스괴를 2-3 mm 작은 세포괴로 쪼갠 다음 용기당 0.5-1.0g 정도를 표면에 치상하고 25에서 암배양을 하며 자구의 생성 정도를 조사하였다. 치상 후 2-3주 내에 배발생이 일어나 구형 및 자엽형 배가 형성되고, 이들 체세포배는 광 조건하에서는 성숙배의 엽초가 녹색으로 변하며 수 cm 이상 신장하며 기부가 구의 형태로 비대되는데 이들을 암조건에서 계속적으로 배양하면 엽초의 신장 없이 구가 비대하여 자구를 형성하였다. 도 5C에서 보여주듯이 다양한 배발생 과정, 즉 구형, 자엽형, 성숙배, 자구 형성 단계를 거치는 것이 확인되었으며, 보통 0.5 그램 배발생세포를 치상한 백합(Duchefa) 용기 당 50-100개의 자구를 얻을 수가 있었다. 이들 자구들은 배양실에서 배양 기간이 지속됨에 따라 직경 5~10 mm 크기의 자구로 비대시킬 수가 있었다(도 3b).

본 자구 생산 과정에서는 기존의 인편조직배양에서와 같이 절편체를 치상하고 생성된 자구의 이식도 일일이 사람 손에 의존하는 방식과 달리 미세 배발생세포괴를 분주하여 치상하고 암배양 기간 동안 방치하여 배양하기 때문에 인력이 최소로 소요되고 있어 백합의 번식 체계에 큰 기여를 할 수 있으리라 판단된다.

실시예 5. 체세포배 유래 자구의 순화재배 및 토경을 통한 개화구 생산

배발생세포 유래 조직배양 자구는 도 3c에서처럼 수확하여 8주 정도 저온처리를 거쳐 온실에서 순화재배를 통해 5개월 정도 지나면 중구를 생산할 수 있다. 도4a에서 보여 주듯이 파종상 또는 온실 베드에 백합상토에 깊이 3 cm 정도로 정식 또는 산파하며 2-3주 후부터 발아하여 생장하게 된다. 이때 백합양액 (원예특작과학원표준액)을 EC 1-2 mS/cm 정도로 희석하여 매주 시비하고 살균제와 살충제를 관행적으로 주1회 정도 스프레이 또는 관주 처리하며 정밀 관리하면 도 4b에서 보듯이 매우 건실한 중구를 생산할 수 있다. 표 에서 보듯이 직경 5 mm 정도의 소구에서 평균 구주 6 cm의 소중구를 얻을 수 있으며, 자구 크기를 직경 10 mm 이상으로 비대시킨 자구를 재배하면 10-12 cm 이상의 중구를 얻을 수 있음이 확인되었다. 순화재배된 중구는 온실 또는 노지의 토경을 통해 재배하면 재배 지역 또는 환경에 따라 동양계백합은 2-3년, 나팔나리는 당년에 개화구를 생산할 수 있다. 제주와 충남 서산에서 마르코폴로 동양계백합의 농가 실증 시험에서 세포배양 유래 자구에서 정상적이고, 바이러스 무병성인 개화를 균일하게 얻을 수 있음이 반복 확인되었고, 나팔나리의 경우에도 춘천 그리고 해외에서는 베트남 달랏 고랭지 시험에서 당년에 개화 및 개화구 생산이 가능함이 확인되었다. 본 연구에서 확인된 것은 체세포배 유래 자구를 순화재배 및 토경을 하면 백합 종류에 따라 당년 또는 2-3년에 걸쳐 인편번식 증식 과정없이 바이러스가 없는 개화구를 얻을 수 있음이 확인되었다. 기존의 관행적인 방법은 인편 조직배양구를 2-3년 비대하여 중구 이상의 무병구를 얻은 후 인편번식을 통해 10배 정도 증식하여 토경을 통해 개화구를 생산하는데 조직배양구의 생산 비용이 비싸고 (화란의 스리랑카 조직배양구 구입 가격은 350원) 조직배양구 양구 기간이 1-2년이 더 필요하며, 이를 인편번식하는 과정이 더 소요된다.

Claims

백합 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 이용하여 백합 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,
(1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및
(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:
를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 액체 배지는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 피클로람(picloram) 및 BA가 포함된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 액체 배지는 0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/l 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA가 포함된 MS 배지인 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 액체 배지에서 대량 증식은 생물반응기 내에서 수행되며, 상기 액체 배지는 0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지인 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 백합의 품종은 마크 보르트(Mark Voort), 메리 크리스마스(Merry Christmas), 이레드 프랑스(Iled France), 루부레(Louvre), 스트롱 골드(Strong Gold), 홀랜디아(Hollandia), 케스 넬리스(Kees Nelis), 다이너스티(Dynasty), 골든 아펠도른(Golden Apeldoorn), 미스 엘레강스(Miss elegance), 시도브(Seadov), 헌트빌레(Hunt Ville), 레오비저(Leovisser), Negrita(네그리타), 골든 퍼레이드(Golden parade) 또는 오렌지 엠페러(Orange emperor)인 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 고체 배지는 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 배지인 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 백합 구근 조직으로부터 배발생 캘러스의 유도는 0.5~1 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.2~0.6 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.5~1 ㎎/l 피클로람(picloram) 및 0.2~0.6 ㎎/l BA가 포함된 MS 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 백합 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터에서 유도된 체세포배를 이용하여 백합 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,
(1) 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내의 0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및
(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:
를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합 자구를 대량생산하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 백합 자구.
0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/l 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA가 포함된 MS 액체 배지를 유효성분으로 함유하는, 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물.
0.3~0.5 ㎎/l 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/l BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지를 유효성분으로 함유하는, 백합 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내에서 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물.