KR101636726B1

KR101636726B1 - 생물반응기 액체배양을 통한 배발생 캘러스 급속증식 및 고체 배지에서의 재분화를 통한 튤립 자구 대량생산 방법

Info

Publication number: KR101636726B1
Application number: KR1020140090877A
Authority: KR
Inventors: 안병준
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2016-07-06
Also published as: KR20160010064A

Abstract

본 발명은 튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서, (1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및 (2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 튤립 자구 및 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 피클로람(picloram) 및 BA가 포함된 MS 배지를 유효성분으로 함유하는 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물에 관한 것이다.

Description

생물반응기 액체배양을 통한 배발생 캘러스 급속증식 및 고체 배지에서의 재분화를 통한 튤립 자구 대량생산 방법{Method for mass production of tulip bulblet through liquid culture of tulip embryogenic callus in bioreactor and regeneration on solid media}

본 발명은 생물반응기 액체배양을 통한 배발생 캘러스 급속증식 및 고체 배지에서의 재분화를 통한 튤립 자구 대량생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서, (1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및 (2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 튤립 자구 및 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 피클로람(picloram) 및 BA가 포함된 MS 배지를 유효성분으로 함유하는 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물에 관한 것이다.

튤립은 대표적인 구근화훼류로서 전 세계적으로 매년 50억구 이상 식재되며 대부분 네델란드에 의해 전 세계에 공급되고 있다. 튤립의 증식은 영양번식에 의해 이루어지는데 주로 자연 분구에 의존하며 증식률은 연 2.5배로 극히 낮은 편이다. 네덜란드에서는 모구를 넓은 면적에 재배하며 구근을 생산하는 오랜 기술적 체계를 가지고 있어 독점적으로 전 세계에 구근을 공급하고 있다. 백합과 같은 다른 구근화훼류에서는 인편번식이나 조직배양을 통해 자구를 증식하여 증식률을 높일 수 있으나, 튤립은 인편으로부터 자구의 증식이 거의 이루어지지 않으며 조직배양을 통한 증식도 쉽지가 않다. 일부 연구에서 튤립 구근 일부를 2,4-D 등 오옥신이 함유된 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하고 자구 또는 식물체를 재생하는 보고들이 있으나 실용적 수준의 기술로 활용된 경우는 거의 없는 편이다.

한편, 한국등록특허 제0586495호에서는 '튤립 구근인편으로부터 고빈도의 배발생 캘러스 형성 및 그로부터 효율적인 재분화방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '생물반응기 액체배양을 통한 배발생 캘러스 급속증식 및 고체 배지에서의 재분화를 통한 튤립 자구 대량생산 방법'에 관해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내외 기존 조직배양 기술과는 달리 주요 튤립 품종의 구근 조직에서 배발생 캘러스를 유도하고, 이를 생물반응기를 이용한 액체배양을 통하여 대량 증식하며, 고체 배지에서 자구를 대량생산함으로써 튤립의 구근을 대량생산하는 새로운 생산 체계를 개발하고자 하였다. 따라서, 본 발명에서는 주요 튤립 품종의 배발생 캘러스 유도 조건을 구명하며, 이들 배발생 캘러스의 액체배양을 통한 증식 조건을 최적화하였으며, 배발생 캘러스를 고체 배지에 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 조건을 최적화함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서, (1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및 (2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 튤립 자구를 제공한다.

또한, 본 발명은 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지를 유효성분으로 함유하는 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물을 제공한다.

본 발명은 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 최적화된 액체 배지에서 대량 증식시키는 방법을 통해 최종적으로 튤립 구근을 대량생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 기존의 조직 배양 기술이 적용되기 힘들었던 튤립에 있어서 효과적인 대량번식체계의 개발에 기여할 수 있으므로, 원예산업상 매우 유용한 발명이다.

도 1은 튤립 (Golden Apeldoorn) 캘러스 배양을 나타낸다. (A) 치상 2주 후의 튤립 구근 전식물체, (B) 배양 6주 후 캘러스가 유도된 전식물체, (C) 전형적인 비배발생 형태의 캘러스, (D) 배발생 캘러스.
도 2는 튤립 (Golden Apeldoorn) 캘러스의 체세포 배발생 및 식물체 재분화를 나타낸다. (A) 재분화 배지에 이식된 캘러스의 체세포 배발생 및 구상 배, (B) 성숙한 자엽형 배의 발달, (C) 배발달 진전에 따른 소식물체 재생, (D) 체세포배 유래 튤립 기내 유묘.
도 3은 액체현탁 배양의 배지 생장조절제 조성에 따른 '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)' 튤립 배발생 캘러스의 생체중 증가를 나타낸다.
도 4는 배발생 캘러스의 현탁배양을 나타낸다. (A) 플라스크를 이용한 일차 배발생 캘러스 현탁배양, (B) 5리터형 생물반응기 배양, (C) 10리터형 생물반응기 배양, (D) 생물반응기에서 전배체 상태로 배양중인 튤립 배발생 캘러스, (E) 식물재분화를 위해 생물반응기에서 수확된 배발생 캘러스괴, (F) 생물반응기에서 배양된 배발생 캘러스괴 확대사진, 세포 덩어리는 전배체 상태를 보여 주며 재분화 배지에서 바로 배발생이 일어남.
도 5는 배발생 캘러스로부터 자구 형성을 나타낸다. (A) 생물반응기에서 배양되어 재분화배지에 치상된 배발생 캘러스괴, (B) 체세포 배발생을 통하여 분화된 여러 단계의 배상체, (C,D) 체세포배가 발달한 마이크로 자구들, (E) 암배양을 통해 형성되는 자구, (F) 자구가 형성되고 비대되는 정치배양.
도 6은 튤립 품종별 배발생 캘러스에서 유래한 자구 형성 결과를 나타낸다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,

(1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및

(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:

를 포함하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 MS(Murashige & Skoog) 배지는 2~4% 수크로스 및 0.2~0.4% 젤라이트를 포함한 배지일 수 있고, 바람직하게는 3% 수크로스 및 0.3% 젤라이트를 포함한 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (1) 단계의 액체 배지는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 피클로람(picloram) 및 BA가 포함된 MS 배지일 수 있고,

바람직하게는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지일 수 있고,

가장 바람직하게는 0.3 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.15 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.3 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.15 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 튤립은 Tulipa속 식물 (Tulipa species)일 수 있고, 바람직하게는 마크 보르트(Mark Voort), 메리 크리스마스(Merry Christmas), 이레드 프랑스(Iled France), 루부레(Louvre), 스트롱 골드(Strong Gold), 홀랜디아(Hollandia), 케스 넬리스(Kees Nelis), 다이너스티(Dynasty), 골든 아펠도른(Golden Apeldoorn), 미스 엘레강스(Miss elegance), 시도브(Seadov), 헌트빌레(Hunt Ville), 레오비저(Leovisser), Negrita(네그리타), 골든 퍼레이드(Golden parade) 또는 오렌지 엠페러(Orange emperor)인 튤립 품종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (2) 단계의 고체 배지는 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (1) 단계의 튤립 구근 조직으로부터 배발생 캘러스의 유도는 0.5~1 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.2~0.6 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.5~1 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.2~0.6 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지에서 수행할 수 있고, 바람직하게는 1 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.5 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 1 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.5 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 본 발명은 튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터에서 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,

(1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내의 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및

(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:

를 포함할 수 있고, 바람직하게는

(1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내의 0.3 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.15 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및

를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 액체 배지를 유효성분으로 함유하는 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지를 유효성분으로 함유하는, 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내에서 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

(1) 품종별 배발생 캘러스 유도 조건 및 재분화능 확인

① 식물 재료

튤립 품종('Mark Voort', 'Merry Christmas', 'Iled France', 'Louvre', 'Strong Gold', 'Hollandia', 'Kees Nelis', 'Dynasty', 'Golden Apeldoorn')의 배발생 캘러스 유도 효율과 재분화능을 확인하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 품종별로 구근을 절개하여 채취한 화뢰를 횡축으로 자른 1mm 두께의 절편체를 처리별 배지에 치상하였다. 튤립 구근은 겉껍질을 제거한 뒤, 흐르는 물에 씻어낸 뒤 화뢰를 절취하여 70% 에틸알코올에 30초간 침지 처리하고, 1% NaClO 용액(Tween X를 1방울 첨가)에서 10분간 진탕 소독하였다. 멸균수로 3차례 이상 헹군 다음 횡축으로 1mm 두께로 썰어 치상하였다.

② 배지 조성

MS(Murashige & Skoog) 기본 배지에 3% 수크로스를 첨가하였으며 0.3% 젤라이트로 고형화한 배지를 페트리디시 당 25 ㎖ 분주하여 배양에 이용하였다. 품종별 배발생 캘러스 유도 조건을 구명하기 위하여 오옥신계 생장조절제로서 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram), 디캄바(dicamba)를 4 mg/L의 농도로 0.5 mg/L BA(benzyl adenine)와 함께 조합 처리하였다. 배양체들은 4주 간격으로 같은 배지에 계대배양 하였으며 12주 후 캘러스 형성 정도 및 배발생 캘러스 유도율을 조사하여 품종별 배발생 분화능을 판단하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재하였다.

(2) 배발생 캘러스 유도 및 증식을 위한 품종별 옥신 최적 요구도 조사

튤립의 구근 절편체로부터 배발생 캘러스를 유도하는 최적 조건을 구명하기 위하여 본 실험을 수행하였다.

① 식물 재료

튤립 4 품종('Ile de France', 'Negrita', 'Golden parade', 'Merry Christmas')의 구근 화뢰를 위와 같은 방법으로 처리하여 절편체를 얻어 처리별로 배지에 치상하였다.

② 배지조성

MS 기본배지(3% 수크로스, 0.3% gelite 첨가)에 2,4-D, 피클로람, 디캄바를 각각 1mg/L, 시토키닌으로서 BA, 키네틴(kinetin), 디메틸알릴아미노퓨린(2ip)를 0.5 mg/L 조합 처리한 전체 9가지의 배지를 사용하여 최적 배발생 캘러스 유도 조건을 조사하였다. 배양체들은 4주 간격으로 같은 배지에 계대배양 하였으며 12주 후 캘러스 형성 정도 및 배발생 캘러스 유도율을 조사하였다. 그 결과는 하기 표 2 및 표 3에 기재하였다.

(3) 액체현탁 배양을 통한 배발생 캘러스 급속 증식 조건 구명

한천 배지 배양에서 얻어진 품종별 배발생 캘러스를 활용하여 액체배양 급속 증식 조건을 구명하고자 하였다. '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)' 튤립의 배발생 캘러스 500mg 정도를 25㎖ 액체 배지를 넣은 250㎖ 플라스크에서 현탁배양을 실시하였다. MS 기본배지에 3% 자당이 함유된 액체 배지에 생장조절제를 조합처리하였다. 오옥신으로서 2,4-D, 피클로람, NAA(naphthaleneacetic acid)를 각 0.3 또는 1.0 mg/L 첨가하였으며 BA는 오옥신 농도의 절반으로 9가지 배지를 사용하였으며 처리별로 3 반복을 실시하였다. 배양체들은 매주 계대배양시 생체량을 측정하여 생체량 증가를 초기 생체중에 대한 백분율로 표시하여 조사하였다.

(4) 생물반응기를 이용한 배발생 캘러스 급속 증식

① 식물재료

메리 크리스마스(Merry Christmas) 등 7 품종의 화뢰에서 유도된 배발생 캘러스를 10 리터 생물반응기에서 배양하였다. 배양체들은 일차적으로 플라스크를 이용한 현탁배양을 통하여 증식된 것으로서 5-10 g 정도를 생물반응기 초기배양에 이용하였다.

② 생물반응기 배양

10 리터 벌룬형(balloon type) 반응기에 MS 기본 액체 배지에 2,4-D를 0.25mg/L 또는 0.5 mg/L 첨가하여 이용하였으며 BA는 2,4-D의 1/2 농도를 사용하였다. 계대 배양은 5일 간격으로 적당량의 배지를 추가하였으며 배양의 측정은 Packed cell volume을 이용하였다.

(5) 식물체 재분화 및 자구 형성

생물반응기에서 배양된 전배체 상태의 세포괴를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS 재분화 한천 배지에 치상하여 식물체 재분화 및 자구 형성 정도를 조사하였다. 재분화 배지는 10×10cm 듀체파 용기에 100㎖씩 분주하여 이용하였다. 배발생 캘러스괴를 2-3 mm 작은 세포괴로 쪼갠 다음 용기당 0.5-1.0g 정도를 표면에 치상하고 25℃에서 암배양을 하며 자구의 생성 정도를 조사하였다.

실시예 1. 튤립 주요 품종의 배발생 캘러스 유도를 위한 최적 배양 조건 구명

튤립 구근을 절편체로 이용하여 오옥신과 시토키닌을 조합하여 처리한 MS 배지에 치상하여 배양한 결과, 품종별로 배발생 캘러스가 다양한 빈도로 유도되었다(표 1 및 표 2). '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)', '홀랜디아(Hollandia)' 그리고 '다이너스티(Dynasty)'인 세 품종을 이용한 예비실험에서 골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)과 홀랜디아(Hollandia)에서는 2,4-D에 의해 고 효율로 배발생 캘러스가 유도된 반면, 다이너스티(Dynasty)에서는 디캄바를 처리한 배양에서 높은 유도 효율로 보였으며, 홀랜디아의 경우 피클로람이 첨가된 배지에서 전체 캘러스 유도율이 가장 높았지만 2,4-D 처리 배지에서 배발생율은 가장 높아 품종에 따른 배양 반응이 다름을 알 수 있었다(데이터 미제시). 8 품종을 이용한 실험에서도 ‘마크 보르트(Mark Voort)' 품종에서는 4mg/L 2,4-D를 처리한 배지에서 배발생 캘러스 유도 빈도가 가장 높았지만, '메리 크리스마스(Merry Christmas)'와 ‘홀랜디아(Hollandia)'에서는 피클로람이 가장 효과가 좋게 나타났다(표 1). 일반 단자엽 식물의 경우 1-2 mg/L 2,4-D 첨가에 의하여 대부분 캘러스가 잘 유도되는 반면, 튤립의 경우에는 초대배양에서 3-6 mg/L의 옥신계 생장조절제가 캘러스 유도에 적합한 것으로 확인되었는데, 다만 튤립의 배양이 매우 까다로워 이들 조건에서 많은 조직이 갈변화 내지는 고사하게 됨으로 계대배양 시에는 생장조절제의 농도를 0.5-1.0 mg/L 낮추는 것이 유도된 캘러스의 갈변화를 방지하고 증식이 가능함이 확인되었다(표 2). 품종에 따른 최적 조건을 규명하기 위한 실험에서 '이레드 프랑스(Ile de France)' 품종의 경우 1 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 2iP 조합에서 갈변화 및 고사하는 절편체가 가장 적은 반면, 캘러스 유도율은 40%에 달한 반면, 생체중의 증가는 1 mg/L 피클로람 + 0.5 mg/L 키네틴 조합에서 거의 6배를 보였다. 'Negrita'와 '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)' 품종에서도 유사한 결과를 보였지만, '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)'의 경우에는 1 mg/L 피클로람 + 0.5 mg/L BA 처리에서 최고의 캘러스 유도와 함께 생체중의 증가를 보였다. '메리 크리스마스(Merry Christmas)'에서는 0.5 mg/L 디캄바 + 0.25 mg/L 키네틴에서 최고의 캘러스 유도율과 생체중 증가가 확인되었다. 전체적으로 발생 효율의 차이는 있었지만 실험에 사용된 16 품종 모두에서 피클로람 또는 2,4-D 1-5 mg/L를 BA 0.5 mg/L와 함께 처리한 MS 기본배지(3% 자당, 0.3% 젤라이트)에서 배양하면 모든 품종에서 배발생 캘러스를 유도할 수 있었으며, 유도된 캘러스의 갈변화 방지를 위해서는 피클로람 또는 2,4-D 0.5-1 mg/L를 오옥신 절반의 농도의 BA와 함께 처리한 경우가 바람직하였다.

실시예 2. 튤립 캘러스의 형태적 특성 및 식물체 재분화

도 1에서 보듯이 튤립 구근 절편체에서 유도되는 캘러스는 배발생과 비배발생 캘러스가 혼재되어 유도되는데, 비배발생 캘러스는 팽창된 세포들로 인해 표면이 거칠고 부스러지기 쉬운 일반적 특성을 보이는 반면, 배발생 캘러스는 분열조직과 배조직의 특성인 치밀하고 구형의 세포괴가 덩어리져 증식하는 모습을 보여 주고 있었다. 일부 배양체에서는 캘러스 유도 조건에서도 배가 발달하여 구상 및 자엽형배가 발생하는 경우도 흔히 볼 수가 있었다. 배발생 캘러스들은 생장조절제가 첨가되지 않은 MS 한천 배지에서 배발생 과정을 통하여 식물체로 쉽게 재생되었다(도 2).

실시예 3. 액체현탁 배양을 통한 배발생 캘러스 급속 증식 조건 구명

배발생 캘러스는 한천 배지에서도 증식될 수 있지만 액체현탁배양을 통하여 동조적으로 대량 증식할 수 있어 발생에 있어 동조적이며, 계대배양이 용이하여 실용적 측면에서도 인력이 최소로 소요되는 장점이 있다. 한천 배지에서 유도된 배발생 캘러스를 250㎖ 플라스크를 이용한 회분 배양(batch culture) 방식 세포현탁 배양을 통하여 증식하기 위하여 '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)' 튤립의 배발생 캘러스 500mg 정도를 25㎖ 액체 배지를 넣은 250㎖ 플라스크에서 현탁배양을 실시하였다. MS 기본배지에 3% 자당이 함유된 액체 배지에 오옥신으로서 2,4-D, 피클로람, NAA를 각 0.3 또는 1.0 mg/L 첨가하였으며 BA는 오옥신 농도의 절반으로 9가지 배지를 조합처리하여 사용하며 처리별로 생장량의 증가를 조사하였다(도 3). 배양 초기에는 비배발생 캘러스가 혼재하여 배양되지만 배양이 지속됨에 따라 비배발생 캘러스들은 세포가 팽창하여 지속적으로 씻겨 나가 나중에는 조직이 치밀한 분열조직 특성을 갖는 배발생 캘러스괴의 형태로 급속 증식이 되며, 이들 세포들은 각각 배발생이 가능하기 때문에 작은 플라스크에서도 수많은 식물체를 배양하는 효과를 가질 수 있었다. 캘러스 유도 단계에서 1-5 mg/L의 옥신이 첨가된 고농도 캘러스 유도배지에서 유도된 배발생 캘러스의 증식에 효과적인 액체배양 조건을 구명한 결과, 피클로람과 BA가 각각 0.3 mg/L, 0.15 mg/L 함유된 배지에서 튤립 조직배양에서 흔히 나타나는 갈변화 없이 생체중이 가장 빠르게 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로는 2,4-D/BA가 1.0/0.5 mg/L 함유된 처리에서 생체중 증가가 빠른 것으로 나타났으며, 이들의 농도가 낮아질수록 생장 속도가 저하하는 것을 볼 수 있었다. NAA의 경우에는 0.3 mg/L의 낮은 농도에서는 초기 배양 속도가 빨랐으나 배양 3주 후부터는 생장 속도가 크게 저하하며 갈변화가 심하게 나타난 반면, 1.0 mg/L의 높은 농도에서는 배발생 캘러스의 증식이 매우 더디고 갈변화가 심한 결과를 보였다. 배발생 캘러스의 증식은 오옥신이 첨가된 배지에서 급속하게 일어나지만 이 과정은 유전적으로 불안정하여 체세포변이가 발생할 수 있기 때문에 최소 농도의 옥신을 사용하는 것이 중요하며 배양 기간을 최소화하는 것이 중요하였다. 본 발명을 통하여 0.3 mg/L의 피클로람 배지에서 배발생 캘러스가 급속 증식되며 갈변화 현상을 최소화시킬 수 있음이 확인되었다.

실시예 4. 생물반응기를 이용한 배발생 캘러스 급속 증식

튤립의 배발생 캘러스 액체현탁 배양을 대량 및 급속으로 하기 위하여 생물반응기를 이용한 급속증식을 시도하였다. '메리 크리스마스(Merry Christmas)' 등 7 품종의 배발생 캘러스를 이용하여 생물반응기 배양 실험을 실시하였는데, 일차적으로 플라스크를 이용한 현탁배양을 통하여 5-10 g 정도의 배양체를 증식하며 이를 이용하여 생물반응기 배양을 통한 대량 증식을 실시하였다. 생물반응기의 air-lift를 통하여 극성을 제거한 상태에서 생장조절제 농도를 최적, 최소 농도로 유지하는 조건을 규명하였는데, 일반적으로 2,4-D 0.3-0.5 mg/L, BA 0.25 mg/L 조합처리가 품종에 따라 증식 정도는 다르지만 보편적으로 생장이 가장 좋게 나타났다. 도 4D-F에서 보듯이 생물반응기에서 배양되는 조직들은 원래 치상한 배발생 캘러스괴의 10-50배에 달하는 직경 2-3 cm의 세포괴를 형성하는데 이들 조직은 전형적인 배발생 캘러스의 집합체로서 3-5 mm의 세포괴가 엉성한 상태로 덩어리를 형성하며 약간의 물리적인 힘에 의해서도 부스러지는 특성을 가지고 있다. 실질적으로 이들 세포괴는 체세포 배발생의 전단계인 구형의 전배체가 증식되는 형태를 가지며, 이들은 재분화 배지에서 1-2 주 내에 배발생이 일어나 자엽형 성숙배를 형성하는 분화능이 매우 뛰어난 세포적 특성을 보여 주었다. 튤립 일곱 품종의 배발생 캘러스를 생물배양기에서 증식해 본 결과, 대부분이 갈변화가 심하지 않은 상태에서 잘 증식되었으며, 특히 '메리 크리스마스(Merry Christmas)'와 '골든 아펠도른(Golden Apeldoorn)' 품종은 증식이 잘 되는 것으로 확인되었다.

실시예 5. 식물체 재분화 및 자구 형성

생물반응기에서 배양된 전배체 상태의 세포괴를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS 재분화 한천 배지에 치상하여 식물체 재분화 및 자구 형성 정도를 조사하였다. 생장조절제가 함유되지 않은 MS 기본배지(3% 자당, 0.3% 젤라이트 함유)를 듀체파 사각 용기에 100㎖씩 분주하여 이용하였다. 배발생 캘러스괴를 2-3 mm 작은 세포괴로 쪼갠 다음 용기당 0.5-1.0g 정도를 표면에 치상하고 25℃에서 암배양을 하며 자구의 생성 정도를 조사하였다. 치상 후 2-3주 내에 배발생이 일어나 구형 및 자엽형 배가 형성되고, 이들 체세포배는 광 조건하에서는 성숙배의 엽초가 녹색으로 변하며 수 cm 이상 신장하며 기부가 구의 형태로 비대되는데 이들을 암조건에서 계속적으로 배양하면 엽초의 신장 없이 구가 비대하여 자구를 형성하였다. 도 5C에서 보여주듯이 다양한 배발생 과정, 즉 구형, 자엽형, 성숙배, 자구 형성 단계를 거치는 것이 확인되었으며, 보통 0.5 그램 배발생 캘러스를 치상한 듀체파(Duchefa) 용기 당 50-100개의 자구를 얻을 수가 있었다. 이들 자구들은 배양실에서 배양 기간이 지속됨에 따라 직경 5~10 mm 크기의 자구로 비대시킬 수가 있었다.

튤립은 백합과 같은 구근화훼류와는 달리 구근번식이 쉽지가 않고 기내 인편번식을 통한 증식도 매우 어려워 품종 평균 연 2.5배 증식하는 자연 증식에 의존하는 구근생산 과정을 고려할 때, 본 발명을 통해 개발된 기술, 즉 배발생 캘러스를 유도하여 대량으로 증식하고 이를 고체 배지에서 자구로 형성시키는 기술이 튤립의 번식 체계에 큰 기여를 할 수 있으리라 판단된다.

결론적으로 튤립 16 품종을 이용한 배발생 캘러스 유도, 증식 및 자구 형성 실험에서, 튤립의 구근 내에 있는 화뢰를 절편체로 하여 피클로람 또는 2,4-D 1-5 mg/L를 BA 0.5 mg/L와 함께 처리한 MS 기본배지(3% 자당, 0.3% 젤라이트)에서 배양하면 모든 품종에서 배발생 캘러스를 유도할 수 있었으며, 유도된 캘러스의 갈변화 방지를 위해서는 피클로람 또는 2,4-D 0.5-1 mg/L를 오옥신 절반의 농도의 BA와 함께 처리한 경우가 바람직하였으며, 이들 배발생 캘러스를 BA 0.5 mg/L를 포함하고, 피클로람 또는 2,4-D 농도를 0.3 mg/L로 낮춘 액체현탁 배양에서 갈변화 없이 증식할 수 있었다. 또한 이들을 생물반응기에서 배양하여 급속도로 증식한 후 생장조절제가 포함되지 않은 고체 재분화배지에서 배발생 과정을 거쳐 고효율로 자구를 생산할 수 있었다. 이 기술을 통하여 대부분의 튤립 품종에서 자구의 급속 생산이 가능하며 구근 생산 및 육종에 활용될 수 있으리라 판단된다.

Claims

튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,
(1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및
(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:
를 포함하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 액체 배지에서 대량 증식은 생물반응기 내에서 수행되며, 상기 액체 배지는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지인 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 튤립의 품종은 마크 보르트(Mark Voort), 메리 크리스마스(Merry Christmas), 이레드 프랑스(Iled France), 루부레(Louvre), 스트롱 골드(Strong Gold), 홀랜디아(Hollandia), 케스 넬리스(Kees Nelis), 다이너스티(Dynasty), 골든 아펠도른(Golden Apeldoorn), 미스 엘레강스(Miss elegance), 시도브(Seadov), 헌트빌레(Hunt Ville), 레오비저(Leovisser), Negrita(네그리타), 골든 퍼레이드(Golden parade) 또는 오렌지 엠페러(Orange emperor)인 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 튤립 구근 조직으로부터 배발생 캘러스의 유도는 0.5~1 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.2~0.6 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지; 또는 0.5~1 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.2~0.6 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법.
제1항에 있어서, 튤립 구근 조직 유래의 배발생 캘러스로부터에서 유도된 체세포배를 이용하여 튤립 자구를 대량생산하는 방법에 있어서,
(1) 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내의 0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지에서 대량 증식시키는 단계; 및
(2) 상기 대량 증식된 배발생 캘러스를 생장조절제가 들어 있지 않은 MS(Murashige & Skoog) 재분화 한천 고체 배지에서 배양하여 체세포 배발생을 통하여 자구를 형성시키는 단계:
를 포함하는 것을 특징으로 하는 튤립 자구를 대량생산하는 방법.
삭제
0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지; 또는 0.3~0.5 ㎎/ℓ 피클로람(picloram) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA가 포함된 MS 액체 배지를 유효성분으로 함유하는, 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물.
0.3~0.5 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 0.1~0.3 ㎎/ℓ BA(benzyl adenine)가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 액체 배지를 유효성분으로 함유하는, 튤립 구근 조직으로부터 유도된 배발생 캘러스를 생물반응기 내에서 대량 증식하기 위한 액체 배지 조성물.