CN106234222B - 一种山桐子叶片组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山桐子叶片组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体选择及处理；(2)愈伤组织诱导培养；(3)分化增殖培养；(4)壮苗培养；(5)生根培养；(6)移栽。相对于现有技术，本发明的山桐子叶片组织培养方法，在短期内生产大量优质种苗，使用较少的外植体，繁殖速度快，增殖系数和生根率高，繁殖效率高。

Description

一种山桐子叶片组织培养方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养快速繁殖的方法，具体为山桐子叶片为外植体的组织培养方法。
背景技术
山桐子(Idesia polycarpa Maxim.)别名椅、水冬瓜、水冬桐、椅树、椅桐、斗霜红。大风子科、山桐子属落叶乔木，树皮淡灰色，不裂；小枝圆柱形，细而脆，黄棕色，有明显的皮孔，冬日呈侧枝长于顶枝状态，枝条平展，近轮生，树冠长圆形，当年生枝条紫绿色，有淡黄色的长毛；冬芽有淡褐色毛，花单性，雌雄异株或杂性，黄绿色，有芳香，花瓣缺，排列成顶生下垂的圆锥花序，花序梗有疏柔毛，果梗细小，种子红棕色，圆形。生于海拔400-2500米的低山区的山坡、山洼等落叶阔叶林和针阔叶混交林中。山桐子为多功能树种，既可观赏也是良好的生物油料树种，为了扩大繁殖，国内外学者已经开展了扦插、嫁接和以芽、根等为外植体的组培快繁研究。在现有繁殖技术中，组织培养的方法已有报道，但报道中研究采用当年生嫩枝的芽为外植体的芽生芽方式进行组培繁殖，使用外植体多，增殖系数偏低，繁殖效率不高等问题。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供一种山桐子叶片组织培养方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明公开了一种山桐子叶片组织培养方法，包括以下步骤
(1)外植体选择及处理：采用当年生山桐子的当年生嫩叶片为外植体，经70％酒精消毒20-25秒，再用0.1％的升汞溶液灭菌7-9分钟，用无菌水冲洗3-5次；
(2)愈伤组织诱导培养：在超净的工作台上，将消毒的外植体接种在诱导愈伤组织培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-2000lx下,每日光照16小时，温度25-27℃、湿度为60％，培养50天，长成愈伤组织；
所述的诱导愈伤组织培养基为：每升基本培养基含：玉米素(ZT)0.2-0.8毫克、6-苄基嘌呤(6-BA)0.5-1.0毫克、α-萘乙酸(NAA)0.1-0.2毫克、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5-1.0毫克；
(3)分化增殖培养：将从(2)步中培养的愈伤组织，转接于含有分化增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖；所述的分化增殖培养基为：每升基本培养基含：玉米素1.0-1.5毫克、6-苄基嘌呤1.0-1.5毫克、α-萘乙酸0.08-0.1毫克；
(4)壮苗培养：将(3)步中培养的试管苗，接种于含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养；所述的壮苗培养基为：每升基本培养基含：玉米素0.5-1.0毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸0.1-0.2毫克；
(5)生根培养：将(4)步中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶，接种于含有生根培养基的三角瓶中，进行生根培养10-15天；所述的生根培养基为：每升基本培养基含：α-萘乙酸0.3-0.5毫克、吲哚乙酸(IAA)0.5-0.8毫克和维生素C50-100毫克；
(6)移栽：将(5)步中生长的生根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土体积比为泥炭：黄心土＝1：1的基质中，浇透水，保持温度28℃左右，相对湿度85％以上，前15天遮光70％，后逐渐见光，55天后，全光照。
作为优选，步骤(2)所述诱导愈伤组织培养基中基本培养基为：每升基本培养基中含有：硝酸钾1550-1900mg，硝酸铵1350-1650mg，磷酸二氢钾140-170mg，硫酸镁300-370mg，二水氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg，四水硫酸锰22.3mg，七水硫酸锌8.6mg，二水钼酸钠0.25mg，五水硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，七水硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸钠37.3mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖30000mg，卡拉胶6500mg。
作为另一种优选，步骤(3)所述分化增殖培养基中基本培养基为：每升基本培养基中含有：四水硝酸钙375-560mg，硝酸铵270-400mg，硫酸钾650-990mg，七水硫酸镁250-370mg，磷酸二氢钾120-170mg，二水氯化钙75-95mg，四水硫酸锰22.4mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉胶6500mg。
作为另一种优选，步骤(4)所述壮苗培养基中基本培养基为：每升基本培养基中含有：四水硝酸钙375-560mg，硝酸铵270-400mg，硫酸钾650-990mg，七水硫酸镁250-370mg，磷酸二氢钾120-170mg，二水氯化钙75-95mg，四水硫酸锰22.4mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉胶6500mg。
作为另一种优选，步骤(5)所述生根培养基中基本培养基为：每升基本培养基中含有：四水硝酸钙375-560mg，硝酸铵270-400mg，硫酸钾650-990mg，七水硫酸镁250-370mg，磷酸二氢钾120-170mg，二水氯化钙75-95mg，四水硫酸锰22.4mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉胶6500mg。
作为另一种优选，步骤(4)所述壮苗培养的时间为30天。
作为另一种优选，所述步骤(2)愈伤组织诱导培养和步骤(3)分化增殖培养之间，还包括将培养的愈伤组织用溶液浸泡2天，所述溶液中成分为：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
技术效果：相对于现有技术，本发明的山桐子叶片组织培养方法，在短期内生产大量优质种苗，使用较少的外植体，繁殖速度快，增殖系数和生根率高，繁殖效率高。
具体实施方式
实施例1
山桐子叶片的离体培养所用的基本培养基配方如表1、表2
表1每升基本培养基中含有物质种类和质量(诱导愈伤组织培养)
表2每升基本培养基中含有物质种类和质量(分化增殖、壮苗和生根培养基)
愈伤组织培养：每升基本培养基(表1)+ZT 0.2mg+BA0.5mg+NAA0.1mg+2,4-D0.5mg；
分化增殖培养：每升基本培养基(表2)+ZT 1.0mg+BA1.0mg+NAA0.08mg；
壮苗培养：每升基本培养基(表2)+ZT 0.5mg+BA0.5mg+NAA0.1mg；
生根培养：每升基本培养基(表2)+NAA0.3mg+IAA0.8mg+VC50mg。
将上述培养基注入三角瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1Kg/cm2)20分钟，待用。
1、采用经筛选的多年生山桐子当年生嫩叶为外植体，经70％酒精消毒20-25秒，再用0.1％的升汞溶液消毒7-9分钟，用无菌水冲洗3-5次；
2、在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在经消毒的含有形成愈伤组织培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10天后,再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-2000lx下，每日光照16小时，温度25-27℃、湿度为60％，培养50天，形成愈伤组织；
3、将从步骤2中愈伤组织，剪切，转接于含有分化增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖，一个周期30天的繁殖倍数为8.5，生长高度达4.9cm，视繁殖生产需要达500瓶时进入下一步；
4、将步骤3中培养的试管芽苗，剪切，接种于经消毒的含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养，30天后进入下一步；增值系数达8.5。
5、将步骤4中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶，接种于含有生根培养培养基的三角瓶中，进行生根培养10-15天；
6、将步骤5中生长的带根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄土体积比为泥炭：黄心土＝1：1的基质中，浇透水，保持温度25℃左右，相对湿度85％以上，前15天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达95.2％，55天左右，全光照，可实现山桐子的规模化生产。
实施例2
本实施例按实施例1的步骤进行操作，只是培养基的重量配比和原料组分不同，本实施例所用的基本培养基配方如表3、表4，增殖及壮苗培养35天的增殖系数达8.6，高生长达4.7cm，生根率为94.3％。
表3每升基本培养基中含有物质种类和质量(诱导愈伤组织培养)
表4每升基本培养基中含有物质种类和质量(分化增殖、壮苗和生根培养基)
愈伤组织培养：每升基本培养基(表3)+ZT0.8mg+BA 1.0mg+NAA 0.2mg+2,4-D1.0mg；
分化增殖培养基：每升基本培养基(表4)+ZT 1.5mg+BA 1.5mg+NAA 0.1mg；
壮苗培养：每升基本培养基(表4)+ZT 1.0mg+BA 1.0mg+NAA 0.2mg；
生根培养：每升基本培养基(表4)+NAA 0.5mg+IAA 0.5mg+VC 100mg。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于所述步骤(2)愈伤组织诱导培养和步骤(3)分化增殖培养之间，还包括将培养的愈伤组织用溶液浸泡2天，所述溶液中成分为：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
该方法增殖系数达10.6，生根率为98.9％。
实施例4
与实施例2相同，不同之处在于所述步骤(2)愈伤组织诱导培养和步骤(3)分化增殖培养之间，还包括将培养的愈伤组织用溶液浸泡2天，所述溶液中成分为：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
该方法增殖系数达10.2，生根率为99.2％。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种山桐子叶片组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体选择及处理：采用当年生山桐子的当年生嫩叶片为外植体，经70％酒精消毒20-25秒，再用0.1％的升汞溶液灭菌7-9分钟，用无菌水冲洗3-5次；
(2)愈伤组织诱导培养：在超净的工作台上，将消毒的外植体接种在诱导愈伤组织培养基的三角瓶中，先将其置于黑暗条件下10天后，再置于普通日光灯为光源、光照强度为1500-2000lx下，每日光照16小时，温度25-27℃、湿度为60％，培养50天，长成愈伤组织；
所述的诱导愈伤组织培养基为：每升培养基含：玉米素0.2-0.8毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸0.1-0.2毫克、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.0毫克；其基本培养基为：每升基本培养基中含有：硝酸钾1550-1900mg，硝酸铵1350-1650mg，磷酸二氢钾140-170mg，硫酸镁300-370mg，二水氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg，四水硫酸锰22.3mg，七水硫酸锌8.6mg，二水钼酸钠0.25mg，五水硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，七水硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸钠37.3mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖30000mg，卡拉胶6500mg；
(3)分化增殖培养：将从(2)步中培养的愈伤组织，转接于含有分化增殖培养基的三角瓶中，进行增殖培养，不断增殖；所述的分化增殖培养基为：每升培养基含：玉米素1.0-1.5毫克、6-苄基嘌呤1.0-1.5毫克、α-萘乙酸0.08-0.1毫克；
(4)壮苗培养：将(3)步中培养的试管苗，接种于含有壮苗培养基的三角瓶中，进行壮苗培养；所述的壮苗培养基为：每升培养基含：玉米素0.5-1.0毫克、6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸0.1-0.2毫克；
(5)生根培养：将(4)步中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-4片叶，接种于含有生根培养基的三角瓶中，进行生根培养10-15天；所述的生根培养基为：每升培养基含：α-萘乙酸0.3-0.5毫克、吲哚乙酸0.5-0.8毫克和维生素C50-100毫克；
(6)移栽：将(5)步中生长的生根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土体积比为泥炭：黄心土＝1：1的基质中，浇透水，保持温度28℃，相对湿度85％以上，前15天遮光70％，后逐渐见光，55天后，全光照；
所述分化增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基中基本培养基均为：每升基本培养基中含有：四水硝酸钙375-560mg，硝酸铵270-400mg，硫酸钾650-990mg，七水硫酸镁250-370mg，磷酸二氢钾120-170mg，二水氯化钙75-95mg，四水硫酸锰22.4mg，七水硫酸锌8.6mg，硼酸6.2mg，五水硫酸铜0.25mg，二水钼酸钠0.25mg，七水硫酸亚铁34.1mg，乙二胺四乙酸钠46.6mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 0.5mg，VB5 0.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖22000mg，卡拉胶6500mg。
2.根据权利要求1所述的山桐子叶片组织培养方法，其特征在于，步骤(4)所述壮苗培养的时间为30天。
3.根据权利要求1所述的山桐子叶片组织培养方法，其特征在于，所述步骤(2)愈伤组织诱导培养和步骤(3)分化增殖培养之间，还包括将培养的愈伤组织用溶液浸泡2天，所述溶液中成分为：吡哆醇5mg/L+甘氨酸1mg/L+蔗糖8g/L。
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