KR100889342B1 - 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 체세포배발생을 이용한 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 번식방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 백합나무의 번식방법에 있어서, 백합나무 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계, 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 상기 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키키는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법에 관한 것이다.
백합나무, 체세포배

Description

체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법{Propagation Method of Liriodendron tulipifera Using Somatic Embryogenesis Technique}
본 발명은 체세포배발생을 이용한 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 번식방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 백합나무의 번식방법에 있어서, 백합나무 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계, 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 상기 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키키는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법에 관한 것이다.
체세포배는 일명 인공종자배라고도 하며, 유도란 정자와 난세포의 수정으로 발생되는 일반 종자배와는 달리 수정 과정 없이 접합자배(zygotic embryo)의 형태와 기능이 유사한 체세포배를 기내에서 발생시키는 기술을 뜻한다.
이러한 체세포배 발생 기술을 이용하면 동일한 유전자형을 지닌 인공종자배를 무한정으로 생산하는 것이 가능해져 원하는 임목을 단 시간내에 대량생산이 가능해져 궁극적으로는 임목의 클론화를 달성할 수 있다. 또한 이 기술은 유전 형질 전환 등에도 필수적으로 적용되는데 그것은 형질전환 후 이 기술을 이용하면 형질전환체로의 재분화가 매우 용이하기 때문이기도 하다.
임목에 관한 체세포배 발생의 경우 Citrus 및 date palm종의 주심조직을 이용한 것이 최초이며 1970년과 1980년대에 이 기술의 적용대상은 주로 활엽수종에 국한되어 왔다. 활엽수종의 경우 1년생 초본식물이나 작물에 비해서 체세포배 발생이 힘든 것으로 알려져 있으며 지금까지 30가계, 60종, 80속 이상에서 기초 연구실험 결과가 보고되고 있으나 사실상 대부분 실용적인 측면보다는 기초연구에 그치고 있는 실정이다. 한편, 침엽수종의 경우 Hakman 등 (1985)이 Norway spruce 의 미숙배로부터 처음으로 배발생조직을 보고한 이래 침엽수종의 체세포배 발생 기술은 상당히 발전되어 현재에는 실용화뿐만 아니라 특허권 획득을 위한 연구까지 활발히 진행되고 있다.
이 분야의 연구가 활발한 국가는 미국, 캐나다 및 서유럽 일부 국가인데 특히 웨이어하우져 유전공학연구소에서는 더글러스 훠(Pseudotsuga mensiezii), 테다소나무(Pinus taeda) 및 독일가문비(Picea abies) 로부터 세포배양 기술을 이용해 다량의 체세포배 발생, 인공종자의 종피 연구 및 자동화 시스템을 이용한 식물체 생산 등으로 실용화 단계까지 진입한 상태이고 또한 500여 유전자형의 더글러스 전나무의 배발생조직을 이용한 형질전환 연구도 활발히 진행중이다.
지금까지 연구된 침엽수종은 Abies속, Picea속, Pinus속 등에서 많은 연구가 이루어졌고 그중 Picea속 수종에서 가장 발달된 체세포배 발생 기술이 개발되어 거의 산업화 수준까지 도달해 있다. 한편 백합나무의 체세포배 발생 연구의 첫 사례 는 1986년 Merkle과 Sommer가 미숙한 상태의 종자배로부터 배발생조직을 유도하는데 성공하였고, 그러한 조직으로부터 완전한 식물체의 재분화를 증명해 보였다. 그 후 이에 관련된 몇몇의 체세포배 발생 기술 개발에 관한 연구가 이루어졌는데 특히 1987년에는 Merkle과 Sommer가 백합나무의 원형질체 (식물세포벽을 제거한 세포) 수준에서 식물체 재분화까지 기술이 발전하게 되었다. 최근의 연구는 2001년에 Dai 등이 잡종 백합나무(Liriodendron tulipifera × L. chinense)의 배발생조직 세포를 4cm 정도 크기의 종이필터에 배양하여 약 1,400여개의 체세포배를 발생시켜 묘목 대량생산의 가능성을 보여 줬다. 반면 이 수종에 대한 국내연구는 매우 미진한데 이 등(2003)은 배발생조직 유도를 위한 백합나무의 미숙종자 채취시기에 관한 연구가 있고 손 등(2005)은 배발생조직 발생을 위한 모수 유전자형 및 배양시 관계하는 빛(light)의 상호관계에 관한 연구결과만 언급할 뿐 체세포배 발생을 위한 구체적인 실험데이터는 제시되지 않고 있다. 특히 위의 두 연구보고에서는 백합나무의 배발생조직 증식 및 체세포배 발생시 가장 중요한 데이터가 되는 환원질소원, ABA 그리고 삼투압에 관한 연구는 전혀 이루어지지 않아 차후 체세포배 발생을 통한 묘목의 대량생산을 위한 기술개발에는 크게 미흡한 실정이다.
또한 위의 두 보고서에는 본 발명에서 제시한 다량의 체세포배 발생 및 폿트묘의 대량생산에 관한 사진자료의 제시가 전혀 이루어지지 않아 상대적으로 본 발명이 갖는 기술적 개발의 의미가 더욱 크다고 할 수 있다.
따라서 본 발명에서는 미숙배로부터 유도한 배발생조직을 재료로부터 체세포배를 발생시킨 다음 발아시켜 완전한 폿트묘 육성을 위한 기술 개발에 있다.
본 발명은 백합나무 번식방법에 있어서, 실생 번식외에 배발생조직으로부터 체세포배 발생 후 성숙 및 발아과정을 통하여 완전한 폿트묘를 생산이 가능한 백합나무 번식방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 백합나무의 번식방법에 있어서, 백합나무 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계, 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 상기 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키키는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법을 제공한다.
백합나무의 종자결실은 종자임성이 매우 저조하여 국내에서는 백합나무의 묘목생산을 위해 부득히 외국으로부터 종자를 수입 해야만 하는 실정이다.
본 발명은 백합나무 번식방법에 있어서, 실생 번식외에 배발생조직으로부터 체세포배 발생 후 성숙 및 발아과정을 통하여 완전한 백합나무 번식방법을 제공할 수 있어 백합나무의 묘목생산을 위해 외국으로부터 종자의 수입을 현저히 감소시킬 수 있다.
본 발명은 백합나무의 번식방법에 있어서, 백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도하는 단계, 상기 유도된 백합나무 배발생조직을 증식하는 단계, 상기 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 상기 유도된 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법을 나타낸다.
이하 본 발명을 각각의 공정에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다.
제1단계 : 백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도하는 단계
본 발명에서 백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도시 LM배지(Litvay, J.D.; Verma, D.C.; Johnson, M.A. Influence of a loblolly (Pinus taeda L.) culture medium and its components on growth and somatic embryogenesis of the wild carrot (Darcus carota L.). Plant Cell Reports 4:325-328, 1985)에 수크로스(sucrose), 겔라이트(gelrite), 카제인(casein hydrolysate), 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D), 벤질 아데닌(Benzyl adenine, BA)을 첨가하고, 상기 수크로스, 겔라이트, 카제인, 2,4-D 및 BA가 첨가된 LM 배지에 백합나무 미숙종자를 배양시켜 배발생조직을 유도할 수 있다.
본 발명에서 백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도시 LM배지에 수크로스 2∼4％, 겔라이트 0.3∼0.5％, 카제인 900∼1000mg/L, 2,4-다이클로로페 녹시아세틱산(2,4-D) 1∼3mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.2∼0.3mg/L를 첨가하여 pH가 5.5∼6.0인 배지에 백합나무 미숙종자를 22∼25℃에서 3∼4주(week) 배양시켜 배발생조직을 유도할 수 있다.
본 발명에서 백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도시 LM배지에 수크로스 3％, 겔라이트 0.4％, 카제인 1000mg/L, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 2.0mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.25mg/L를 첨가하여 pH를 5.5로 맞춘 배지에 백합나무 미숙종자를 22∼25℃에서 4주(week) 배양시켜 배발생조직을 유도할 수 있다.
제2단계 : 유도된 백합나무 배발생조직을 증식하는 단계
1/2LM 배지에 수크로스, 겔라이트, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D), 벤질 아데닌(BA)을 첨가하고, 상기 수크로스, 겔라이트, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D), 벤질 아데닌(BA)이 첨가된 1/2LM 배지에 상기 제1단계에서 유도된 백합나무 배발생조직을 계대배양하여 백합나무 배발생조직을 증식시킬 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스 10∼20g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 1∼3mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.2∼0.3mg/L을 첨가하고, 상기 수크로스 10∼20g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 1∼3mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.2∼0.3mg/L이 첨가된 1/2LM 배지에 제1단계에서 유도된 백합나무 배발생조직을 계대배양하여 백합나무 배발생조직을 증식시킬 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스, 겔라이트, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D), 벤질 아데닌(BA)을 첨가하고, 상기 수크로스, 겔라이트, 2,4-D 및 BA가 첨가된 1/2LM 배지에 L-글루타민, 카사미노산 중에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 첨가한 배지에 상기 제1단계에서 유도된 백합나무 배발생조직을 계대배양하여 백합나무 배발생조직을 증식시킬 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스 10∼20g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 1∼3mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.2∼0.3mg/L을 첨가하고, 상기 수크로스 10∼20g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 1∼3mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.2∼0.3mg/L이 첨가된 1/2LM 배지에 L-글루타민 250mg/L∼1000mg/L, 카사미노산 250mg/L∼1000mg/L 중에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 첨가한 배지에 상기 제1단계에서 유도된 백합나무 배발생조직을 계대배양하여 백합나무 배발생조직을 증식시킬 수 있다.
제3단계 : 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계
(1)1/2LM 배지에 수크로스, 겔라이트를 첨가하고, 상기 수크로스, 겔라이트를 첨가한 1/2LM 배지에 상기 제2단계에서 증식된 배발생조직을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 체세포배를 유도할 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％를 첨가하고, 상기 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％를 첨가한 1/2LM 배지에 상기 제2단계에서 증식된 배발생조직 4∼6mg을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 22∼25℃에서 7∼9주(week) 동안 체세포배를 유도할 수 있다.
(2)1/2LM 배지에 수크로스, 겔라이트, 아브시스산(abscisic acid, ABA)을 첨가하고, 상기 수크로스, 겔라이트, 아브시스산이 첨가된 1/2LM 배지에 상기 제2단계에서 증식된 배발생조직을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 체세포배를 유도할 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 아브시스산(ABA) 0.2∼2.0mg/L를 첨가하고, 상기 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 아브시스산(ABA) 0.2∼2.0mg/L이 첨가된 1/2LM 배지에 상기 제2단계에서 증식된 배발생조직 4∼6mg을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 22∼25℃에서 7∼9주(week) 동안 체세포배를 유도할 수 있다.
(3)1/2LM 배지에 수크로스, 겔라이트, 카사미노산(casamino acid)을 첨가하고, 상기 수크로스, 겔라이트, 카사미노산이 첨가된 1/2LM 배지에 상기 제2단계에서 증식된 배발생조직을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 체세포배를 유도할 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 카사미노산 400∼500mg/L를 첨가하고, 상기 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 카사미노산 400∼500mg/L이 첨가된 1/2LM 배지에 상기 제2단계에서 증식된 배발생조직 4∼6mg을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 22∼25℃에서 7∼9주(week) 동안 체세포배를 유도할 수 있다.
4. 상기 유도된 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키는 단계
1/2LM 배지에 수크로스, 겔라이트를 첨가한 발아배지에 상기 제3단계에서 유도된 체세포배를 발아시키되, 발아초기 1주 동안은 500룩스(lux) 이하에서 발아시키고, 발아 2주∼3주에는 1000∼3000룩스의 빛조건에서 발아시켜 유도된 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시킬 수 있다.
1/2LM 배지에 수크로스 10∼30g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％를 첨가한 발아배지에 상기 제3단계에서 유도된 체세포배를 6∼8주(week) 동안 발아시키되, 발아초기 1주 동안은 500룩스(lux) 이하, 바람직하게는 100∼500룩스에서 발아시키고, 발아 2주∼3주에는 1000∼3000룩스의 빛조건에서 발아시켜 유도된 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시킬 수 있다.
상기 제4단계를 거쳐 식물체로 분화된 백합나무 어린 식물체는 인공상토에 이식한 후, 25±1℃, 16시간 광주기의 배양조건으로 최초 2주간은 1일 간격으로 관수를 실시하여 습도 90％ 이상 유지하고, 2주 후에는 3∼4일마다 관수를 실시하여 습도 90％ 이상 유지하면서 4∼8주(week) 동안 토양이식 및 순화시킬 수 있다.
상기에서 인공상토는 피트모스(peatmoss), 펄라이트(pearlite), 버미큘라이트(vermiculite)가 혼합된 것을 사용할 수 있다.
상기에서 인공상토는 피트모스, 펄라이트, 버미큘라이트가 1:1:1의 부피비로 혼합된 것을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법에 있어서, 백 합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도하기 전에 백합나무 미숙종자는 하기 (1) 내지 (4)단계의 살균과정을 거친 것을 사용할 수 있다.
(1)계면활성제를 첨가한 정제수에 백합나무 미숙종자를 넣어 세척시킨 후 정제수로 씻어내는 단계,
(2)상기 1단계를 거친 백합나무 미숙종자를 에탄올에 침지하여 계속적으로 흔드는 단계,
(3)상기 2단계 후 트리톤엑스-100(TritonX-100)이 첨가된 NaClo 용액을 첨가하여 살균하는 단계,
(4)상기 3단계 후 멸균증류수로 백합나무 미숙종자를 세척하는 단계.
상기 (1)단계에서 계면활성제는 백합나무 미숙종자 중량 대비 50∼100％를 넣어 백합나무 미숙종자를 세척할 수 있다.
상기 (1)단계에서 계면활성제는 트윈 20(tween 20)을 사용할 수 있다.
상기 (2)단계는 70％ 에탄올에 백합나무 미숙종자를 3분간 침지시킬 수 있다.
상기 (3)단계는 1％ NaClo 용액 100중량부에 대하여 트리톤엑스-100(TritonX-100) 0.1∼1중량부를 1％ NaClo 용액에 첨가한 것에 백합나무 미숙종자를 첨가하여 10분간 살균할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위 가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
하기 (1)단계 내지 (11)단계를 통해 백합나무 미숙종자로부터 백합나무 어린 식물체를 얻었다.
(1)종자의 채취
본 발명에서는 배발생조직을 유도하기 위해 미숙종자의 종자배를 사용하였으며 재료는 2004년 7월 중순경 수원에 소재하는 국립산림과학원 유전자원부 구내에 서식하고 있는 성숙목에서 채취하였다. 종자생성은 매우 높으나 종자의 충실율이 10% 이하로 아주 저조하고 이로 인해 종자의 발아율 또한 매우 낮다. 따라서 종자채종이 매우 어려웠기 때문에 개체목의 구분 없이 수십 개의 종자를 채취하였다. 채취한 종자는 사용 시까지 4℃에서 냉장보관 하였다.
(2) 배양을 위한 표면살균
백합나무의 종자는 구과내에 40여개의 미숙종자가 들어 있는데 일반 활엽수종의 종자와는 달리 구과내에서 서로 유합된 상태로 과육으로 두껍게 싸여 있어 수술용칼 (21호)로 먼저 대략 한개의 종자로 분리시킨 다음 표면살균을 실시하였다. 종자소독은 먼저 분리한 종자를 삼각후라스크에 넣고 계면활성제인 tween 20을 백합나무 종자 중량 대비 70％를 첨가하여 흔들어 세척시킨 후 수돗물로 완전히 씻어낸 다음 무균배양대내에서 다음과 같은 순서로 표면살균을 실시하였다.
1) 70% 에탄올로 3분간 침지하여 계속적으로 흔들어 주고,
2) 1％ NaClo 용액 100중량부에 대하여 트리톤엑스-100(TritonX-100) 0.5중량부를 1％ NaClo 용액에 첨가한 것을 첨가하여 10분간 살균한 다음,
3) 멸균증류수로 3-4차례 세척하였다.
(3) 배발생조직 유도를 위한 배지조성 및 조제
배발생조직을 유도하기 위한 배지로는 LM배지(Litvay et al., 1985) 사용하여 3% sucrose, 0.4% gelrite를 첨가하여 고체배지로 제조하여 사용하였다.
여기에 카제인(casein hydrolysate)을 1,000mg/L을, 식물생장조절물질로서 2.0mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)와 0.25mg/L Benzyl adenine (BA)를 첨가하였고 pH는 5.7로 맞추었다. 배지의 분주는 87×15㎜ 크기의 플라스틱 페트리디쉬 (Sterline사 제품)에 20㎖정도 분주하여 하룻밤 정도 굳힌 후 사용하였다.
(4) 배발생조직의 유도 및 증식
미숙종자로부터 배발생조직 유도는 암소에서 실시하는데 배양 3-4주 후면 배발생조직 발생이 시작되는 것을 관찰할 수 있으며 계속 두면 증식을 지속한다. 배양 6-7주 후면 조직이 증식을 거듭하여 새로운 배지로 옮겨줄 만큼 조직이 생장하게 된다. 이때 배발생조직의 발생 배지와는 조성을 다소 변형을 시켜 배양을 계속하게 되는데 증식배지의 조성은 염류의 양을 반으로 줄인 1/2LM배지에 20g/L sucrose, 0.4％ gelrite, 2.0mg/L 2,4-D 및 0.25mg/L BA가 첨가된 배지로 옮겨주면 된다. 그 후로는 2주 간격으로 동일조성의 배지로 계대배양하여 체세포배 발생을 위한 시험재료의 충분한 양이 될 때까지 증식시킨다.
(5) 체세포배 발생
배발생조직이 충분히 증식이 되면 이 조직을 이용하여 체세포배 발생단계로 넘어간다. 체세포배 발생을 위한 배지조성은 1/2LM배지에 40g/sucrose, 0.4％ gelrite가 첨가된 배지에 약 5mg의 배발생조직을 필터페이퍼위에 배양하는 방식으로 체세포배를 발생시킨다. 배양은 암소에서 실시하고 체세포배 유도 정도는 배양 8주 후 조사하였다.
(6) 배발생조직 증식에 영향하는 환원질소원의 종류 및 농도 효과
배발생조직 증식은 250mg/L L-glutamine 과 250mg/L casamino acid를 첨가한 처리구에서 가장 높은 2.6배의 조직증식율을 보였다. 따라서 차후 배발생조직 증식은 1/2LM배지에 20g/L sucrose, 0.4% gelrite, 2.0mg/L 2,4-D 및 0.25mg/L BA가 첨가된 배지에 250mg/L L-glutamine 과 250mg/L casamino acid 첨가가 효과적인 것으로 나타났다(도 7 참조).
(7) 배발생조직으로부터 체세포배 발생에 영향을 미치는 ABA 농도 효과
체세포배 발생에 영향하는 ABA농도를 구명하기 위해 0-20mg/L 까지 배지에 첨가하여 본 결과 가장 많은 수의 체세포배 발생은 0.5mg/L ABA 첨가시 조직 10mg당 650.5개로 나타나 가장 최적 ABA농도로 나타났으며 2.0mg/L 농도 이상에서는 ABA 독성으로 인하여 체세포배 발아율은 점차 감소하였다(도 8 참조).
(8) 체세포배 발생에 영향을 미치는 환원 질소원의 종류 및 농도 효과
체세포배 발생시 환원질소원의 효과를 구명한 결과 500mg/L casamino acid를 첨가하였을때 가장 높은 체세포배 발생수(223.3/15mg 조직)를 보여 배발생조직 증식때와는 달리 casamino acid의 단독 첨가가 매우 효과적인 것으로 나타났다. 반면 1000mg/L 카제인을 첨가시에는 가장 저조한 체세포배 발생수를 보여 첨가된 환원질소원의 종류 및 농도에 따라 체세포배 발생정도는 많은 영향을 받는 것으로 알 수 있다(도 9 참조).
(9) 체세포배 발생에 영향을 미치는 삼투압제 종류 및 농도 효과
삼투압제로 사용된 sucrose 및 maltose를 농도별 처리하여 체세포배 정도를 비교한 결과 4％ sucrose 첨가시 가장 높은 체세포배 발생수(317/24mg 조직)를 보여 최적의 삼투압제로 나타났으며 4％ sucrose의 이하 혹은 그 이상의 농도에서는 체세포배 발생수가 점차 감소함을 확인하였다. 또한 maltose 첨가시에는 농도와는 관계없이 전체 농도에서 체세포배는 전혀 발생되지 않아 백합나무의 체세포배 발생시에는 maltose는 전혀 효과가 없는 것을 밝혀냈다(도 10 참조).
(10)체세포배의 발아 및 식물체 형성
체세포배 유도 6-8주 후면 대체로 완전히 성숙되기 때문에 이때부터 체세포배 발아를 실시하면 된다. 필터페이퍼 위에서 유도된 체세포배를 핀셋으로 하나씩 집어 1/2LM배지에 20g/L sucrose, 0.4％ gelrite가 첨가된 발아배지로 이식하게 된다. 발아처리는 초기 1주 정도는 500lux 이하의 저광도상에서 배양하여 암소에서 유도된 체세포배가 서서히 고광도 조건에 적응하도록 하였다. 발아 2주 후에는 작은 자엽, 하배축신장 및 뿌리 발달이 이루어지는데 이때 발아체를 3000lux의 강한 빛조건으로 옮겨 충분히 광합성이 이루어지도록 하였다. 4주정도의 광조건하에서 배양을 계속한 후 식물체 생장이 지속적으로 이루어지면 13×13×13cm 크기의 투명 플라스틱 배양통으로 식물체를 이식시켰다.
(11) 토양이식 및 순화
체세포배로부터 발아하여 재분화되어 어린 식물체(약 5∼8cm 내외)는 배양통에서 꺼내어 뿌리에 묻은 아가성분(젤라이트)을 수돗물로 조심스럽게 씻어내고 인공상토(피트모스:펄라이트:버미큘라이트, 1:1:1, v:v:v)를 담은 플라스틱 화분 (높이 7cm×지름 7.5 cm)으로 이식하였다. 이식 후에는 투명비닐과 그위로는 투명아크릴판으로 순화통을 덮은 후 진공 스프레이를 이용해 충분하게 관수하였다. 순화과정은 배양실조건(25±1℃, 16시간 광주기)에서 최초 2주간은 1일 간격으로, 그 후로는 3-4일마다 관수를 실시하여 고습도(90% 이상) 환경을 유지하도록 하였다. 이식 6주 후부터는 비닐을 제거하고 아크릴판을 조금씩 열어 점차 습도를 낮추어 주 며 외부환경에 적응토록 하였으며 8주 후에는 완전히 아크릴판을 제거하였다.
(12) 폿트묘 육성
순화과정을 거친 발육과정이 좋은 순화묘를 온실로 옮겨 외부환경에 완전히 적응토록 하였다. 4-6주 후면 식물체 생장이 더욱 왕성해져서 보다 큰 화분으로 이식할 필요가 있는데 이때 큰 플라스틱화분(높이 20cm×지름 13cm)으로 이식시켜 더욱 길이생장을 촉진시켰다.
한편 도 1은 백합나무 미숙종자로부터 유도한 배발생 조직의 사진이고, 도 2는 백합나무의 배발생조직에서 발생중인 체세포배(somatic embryo)의 사진이고, 도 3은 백합나무 체세포배의 발아 2주 후 사진이고, 도 4는 백합나무 체세포배의 발아 6주 후 사진이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
이 발명으로 우선 단 시간내에 생장 및 재질이 우수한 형질을 가진 백합나무 의 대량생산이 가능해졌으며 차후에는 병충해 등에 강한 백합나무의 신품종 육종에도 동일하게 이 기술을 적용시킬 수 있다. 아울러 이 기술의 개발로 유전자조작 등의 첨단 생물공학 기법을 임업에 적용하는 것이 가능해졌으며 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성증진 등의 산림자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 백합나무 미숙종자로부터 유도한 배발생 조직의 사진이다.
도 2는 백합나무의 배발생조직에서 발생중인 체세포배(somatic embryo)의 사진이다.
도 3은 백합나무 체세포배의 발아 2주 후 사진이다 .
도 4는 백합나무 체세포배의 발아 6주 후 사진이다.
도 5는 백합나무의 체세포배가 발아하여 완전한 식물체로 육성한 사진이다.
도 6은 백합나무의 체세포배로부터 재분화된 식물체가 온실에서 육성중인 폿트묘 사진이다.
도 7은 배발생조직 증식에 영향하는 환원질소원의 종류 및 농도 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 배발생조직으로부터 체세포배 발생에 영향을 미치는 ABA 농도 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 체세포배 발생에 영향을 미치는 환원 질소원의 종류 및 농도 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 체세포배 발생에 영향을 미치는 삼투압제 종류 및 농도 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims (10)

  1. 백합나무의 번식방법에 있어서,
    백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도하는 단계,
    1/2LM 배지에 수크로스 20g/L, 겔라이트 0.4％, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 2mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.25mg/L와; L-글루타민 250mg/L 및 카사미노산 250mg/L이 추가로 첨가된 배지에 상기 유도된 백합나무 배발생조직을 넣어 유도된 배발생조직을 증식시키는 단계,
    1/2LM 배지에 수크로스 30∼50g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, 카사미노산 500mg/L를 첨가한 배지에 상기의 증식된 백합나무 배발생조직 4∼6mg을 필터페이퍼 위에 배양하는 방식으로 22∼25℃에서 7∼9주(week) 동안 체세포배를 유도하는 단계,
    상기 유도된 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법.
  2. 제1항에 있어서, LM배지에 수크로스 2∼4％, 겔라이트 0.3∼0.5％, 카제인 900∼1000mg/L, 2,4-다이클로로페녹시아세틱산(2,4-D) 1∼3mg/L, 벤질 아데닌(BA) 0.2∼0.3mg/L를 첨가하여 pH가 5.5∼6.0인 배지에 백합나무 미숙종자를 22∼25℃에서 3∼4주(week) 배양시켜 배발생조직을 유도하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법.
  3. 삭제
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  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 1/2LM 배지에 수크로스 10∼30g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％를 첨가한 발아배지에 유도된 체세포배를 6∼8주(week) 동안 발아시키되, 발아초기 1주 동안은 500룩스(lux) 이하에서 발아시키고, 발아 2주∼3주에는 3000룩스의 빛조건에서 발아시키는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법.
  9. 제1항에 있어서, 유도된 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화된 어린 식물체는 인공상토에 이식한 후, 25±1℃, 16시간 광주기의 배양조건으로 최초 2주간은 1일 간겨겨으로, 그 후로는 3∼4일마다 관수를 실시하여 습도 90％ 이상 유지하면서 4∼8주(week) 동안 토양이식 및 순화시키는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법.
  10. 제1항에 있어서, 백합나무 미숙종자를 배양하여 배발생조직을 유도하기 전에 백합나무 미숙종자는 하기 (1) 내지 (4)단계의 살균과정을 거치는 것을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법.
    (1)계면활성제를 첨가한 정제수에 백합나무 미숙종자를 넣어 세척시킨 후 정제수로 씻어내는 단계,
    (2)상기 1단계를 거친 백합나무 미숙종자를 에탄올에 침지하여 계속적으로 흔드는 단계,
    (3)상기 2단계 후 트리톤엑스-100(TritonX-100)이 첨가된 NaClo 용액을 첨가하여 살균하는 단계,
    (4)상기 3단계 후 멸균증류수로 백합나무 미숙종자를 세척하는 단계.
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