KR101535556B1

KR101535556B1 - 백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법

Info

Publication number: KR101535556B1
Application number: KR1020130079625A
Authority: KR
Inventors: 김용욱; 문흥규
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2015-07-09
Also published as: KR20150006187A

Abstract

본 발명은 백합나무 체세포배의 초저온 저장 및 배발생조직 유도 방법에 관한 것으로, 구체적으로 백합나무 체세포배를 탈수하여 초저온 저장하고, 이를 해동한 다음 2,4-D가 첨가된 배지에서 배양하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 백합나무의 체세포배를 안전하게 오랫동안 보전할 수 있으며, 필요시 체세포배로부터 배발생조직을 용이하게 수득할 수 있다. 이에 따라, 본 발명을 체세포배를 이용한 형질전환 기술에 적용하여, 기존 형질전환의 문제점을 개선할 수 있을 것으로 기대되며, 나아가 향후 생물공학 기술을 적용시켜 내충성 등이 우수한 백합나무의 대량증식 및 보급에 응용할 수 있을 뿐만 아니라 궁극적으로는 영양계임업(clonal forestry)의 확립, 임목 품종화 및 산림자원화에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법{Development of technique of embryogenic tissue induction from somatic embryo in yellow poplar(Liriodendron tulipifera)}

본 발명은 백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법에 관한 것으로, 구체적으로 백합나무 체세포배를 탈수하고 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)이 첨가된 배지에서 배양함으로써 체세포배로부터 배발생 조직을 유도하는 방법에 관한 것이다.

캐나다 및 뉴질랜드와 같은 임업선진국가에서는 이미 오래전에 경제적으로 부가가치가 높은 침엽수종을 선발, 육종 및 대량생산을 위해 생물공학을 응용한 체세포배 유도기술을 개발하였고, 이를 통해 신품종육성 및 보급을 위한 많은 연구가 이루어져 현재는 실용적인 보급단계까지 이른 상태이다.

이러한 체세포배 유도기술을 이용한 대량생산의 실용화를 달성하기 위해서는 가장 먼저 육종목표가 되는 우량 침엽수종의 종자를 배양하여 '배발생 조직'이란 특이한 형태의 조직 유도가 선행되어야 하며, 그 후 이러한 조직을 재료로 한 체세포배 유도 단계를 거쳐 식물체까지 생산이 이루어진다.

배발생 조직 라인은 통상적으로 새로운 배지로 계대배양을 통해 증식 및 유지시킨다. 그러나 오랜 기간 동안 식물호르몬이 첨가된 배지에서 계대배양을 계속하게 되면, 본연의 배발생 능력이 상실되어 차후 체세포배 유도 정도가 저하되거나 혹은 그로부터 유도된 체세포배의 식물체 재분화능이 떨어지는 등 조직노화 징후를 보인다. 이를 방지하기 위해 액체질소 등을 사용하여 배발생 조직을 초저온 저장하는 방법이 있다. 그러나 배발생 조직을 초저온 저장하는 방식은 먼저 초저온 보존액으로 배발생 세포 내의 수분을 탈수처리 한 다음 액체질소 속으로 집어넣어 보존하게 되는데, 초저온 저장 시 동결보존재로 첨가하는 DMSO(Dimethylsulphoxide)의 독성으로 인해 차후 액체질소보존에서 상온으로의 회복 후 체세포변이 발생 가능성이 매우 높으며 세포동결을 위해서는 값비싼 동결장비를 필요로 하는 단점이 있다. 그리고 초저온 저장된 세포를 온수에서 해동하는 동안 저장 튜브 내ㅇ외의 압력차이로 인해 외부의 온수가 유입되어 튜브 속의 세포가 오염될 가능성이 매우 높다. 반면 그러한 액상의 배발생 세포 대신 체세포배를 이용하면 배발생 세포를 이용하는 방식보다 전처리과정이 간단하고, 세포동결을 위한 동결기와 같은 값비싼 장비를 필요치 않으며 또한 초저온저장 시 DMSO의 첨가가 필요 없어 상대적으로 체세포배 변이발생 가능성이 훨씬 낮다. 또한 배발생 세포의 경우 초저온 저장 시에는 많은 조직의 양을 필요로 하는 반면 체세포배는 상대적으로 한 번에 많은 양으로 유도가 가능하기 때문에 초저온 저장을 위한 재료확보 시에는 시간 및 경비를 크게 줄일 수 있다.

그러나 이 기술을 활용하기 위해서는 초저온 저장 후 체세포배로부터 배발생 조직 유도가 가능한 기술개발이 꼭 이루어져야 한다.

체세포배를 이용한 초저온 저장에 관한 연구는 소수의 활엽수종에서만 보고되고 있고(Bajai 1995), 침엽수종의 경우 Bomal 과 Tremblay(2000)가 두 종류의 가문비 수종(Picea mariana, P. glauca)의 체세포배를 초저온 저장한 후 식물체 재분화 및 배발생 조직의 유도 가능성을 보고하고 있어서 실질적인 체세포배의 초저온저장 연구의 초석을 마련했다고 볼 수 있다. 백합나무의 경우 체세포배가 아닌 배발생 조직을 이용한 초저온 저장에 관한 보고(Vendrame 등, 2001) 단 1편만 있을 뿐 현재까지 체세포배로부터 배발생 조직의 유도 등에 관한 연구는 아직 없는 실정이다. 쌍자엽식물의 경우 탈수(혹은 건조)시킨 알파파의 체세포배를 상온에서 1년가량 어떠한 활력 손실 없이 보존이 가능하며(Senaratna et al. 1990), 당근 체세포배의 경우 또한 수크로오스(sucrose) 처리 및 상대습도 45%로 건조처리 후 4℃에서 8개월간 저온저장이 가능하다고 보고하고 있다(Lecouteux et al. 1991). 액체질소를 이용한 초저온 저장의 형태에는 유리화(vitrification), 캡슐화-유리화 및 탈수화법 등이 있으나 어떤 방법을 적용하더라도 핵심은 액체질소 저장 후 상온으로 재생 시 높은 빈도의 배발생 조직 유도율을 획득하는 것이다.

이에 본 발명자는 백합나무를 대상으로 하여 체세포배로부터 배발생 조직을 유도하기 위한 최적의 방법 및 조건을 개발하고자 하였다.

Bajaj YPS. 1995. Cryopreservation of somatic embryos. In: Bajaj YPS, ed. Biotechnology in agriculture and forestry: Somatic embryogenesis and synthetic seed I. Berlin: Springer-Verlag, 221-229. Bomal C, Tremblay F.M. 2000. Dried cryopreserved somatic embryos of two Picea species provide suitable material for direct plantlet regeneration and germplasm storage. Ann. Bot. 86:177-183. Vendrame WA, Holliday CP, Montello PM, Smith DR, Merkle SA 2001. Cryopreservation of yellow-poplar and sweetgum embryogenic cultures. New For. 21: 283-292.

본 발명의 주된 목적은 백합나무의 체세포배로부터 배발생 조직을 유도하기 위한 효과적인 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 백합나무의 체세포배를 20 내지 30℃의 온도 및 75 내지 83%의 상대습도로 유지되는 밀폐된 공간에 위치시키고, 20 내지 180분간 유지하여 탈수시키는 단계; 및 탈수된 체세포배를 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)이 1 내지 3㎎/ℓ로 첨가된 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법을 제공한다.

식물체의 체세포배를 안전하게 장기보관하기 위해서는 초저온 저장이 필요하며, 초저온 저장 시 체세포배에 가해지는 물리적 충격이나 스트레스를 줄이기 위해 탈수과정을 거쳐야 한다. 이에 본 발명은 탈수과정을 거친 백합나무의 체세포배로부터 배발생 조직을 효과적으로 수득할 수 있는 방법을 제공함으로써, 백합나무의 유전자원 보존을 보다 안전하고 효과적으로 실시할 수 있게 한다.

탈수시킨 백합나무 체세포배로부터 효과적으로 배발생 조직을 유도하기 위해서는 여러 가지 요소가 고려될 수 있으나, 적절한 탈수 조건 및 식물호르몬의 농도가 특히 중요하다.

이중 탈수 조건으로는 탈수 시 공기의 상대습도, 온도 및 시간에 따른 변수가 있으며, 이들 조건에 따라 배발생 조직 유도 효과가 달라질 수 있다.

상대습도를 조절할 수 있는 다양한 포화염용액을 사용하여 탈수 실험을 실시한 결과, 약 79%의 상대습도로 조절할 수 있는 (NH₄)₂SO₄의 포화용액을 사용한 경우에 최종 배발생조직 유도 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. 이를 기준으로 하여 ㅁ4%의 범위인 75 내지 83%의 상대습도 조건이면, 초저온 저장 이후 백합나무 체세포배로부터 배발생조직을 효과적으로 수득할 수 있을 것으로 판단된다. 보다 바람직하게는 77 내지 81%의 상대습도 조건인 것이 좋다.

탈수 시 온도를 달리한 결과, 같은 포화염용액을 사용하더라도 배발생 조직 유도 효과가 전혀 달라질 수 있는 것으로 나타났으며, 약 25℃에서 탈수하는 것이 효과적인 것으로 나타났다. 이를 기준으로 하여 20 내지 30℃의 온도 조건이면 배발생 조직을 효과적으로 수득할 수 있을 것으로 판단되며, 보다 바람직하게는 23 내지 27℃에서 탈수하는 것이 좋다.

탈수 시간 또한 배발생 조직 유도 효과에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 30 내지 180분간 탈수하면 배발생 조직을 유도할 수 있고, 이중에서도 약 30분간 탈수하는 것이 가장 효과적인 것으로 나타났다. 이를 기준으로 20 내지 180분의 탈수 시간이면 배발생 조직을 효과적으로 수득할 수 있을 것으로 판단되며, 보다 바람직하게는 20 내지 60분간 탈수하는 것이 좋다.

상기와 같은 조건에 따라 백합나무 체세포배를 탈수하고 탈수시킨 체세포배로부터 배발생 조직을 유도하기 위해서는 적절한 배지와 2,4-D의 처리가 중요하다. 2,4-D는 식물호르몬의 일종으로, 사용량에 따라 제초제가 될 수도 있고 생장조절제의 역할을 할 수도 있다. 따라서 식물체에 따라 적절한 농도로 처리하는 것이 매우 중요하다. 본 발명에 따르면 0.5 내지 5㎎/ℓ의 2,4-D 농도에서 배발생 조직이 유도되는 것으로 나타났으며, 2㎎/ℓ의 농도에서 가장 효과적인 것으로 나타났다. 이에 따라 1 내지 3㎎/ℓ의 2,4-D 농도를 사용하면 탈수시킨 백합나무 체세포배로부터 효과적으로 배발생 조직을 유도할 수 있을 것으로 판단된다. 2,4-D의 처리는 배발생 조직 유도 시에 사용하는 배지에 첨가하는 방법으로 달성할 수 있다.

본 발명에서 배발생 조직 유도 시 사용하는 배지는 가장 보편적으로 사용되며 쉽게 제작 또는 구입할 수 있는 MS 배지를 기초로 하는 것이 바람직하다.

MS(Murashige and Skoog) 배지는 일반적으로 다음과 같은 조성으로 제작되며, 각 성분의 양은 0.5 ~ 1.5배의 사이에서 사용 가능하다.

MS medium : Ammonium nitrate 1,650㎎/ℓ, Boric acid 6.2㎎/ℓ, Calcium chloride anhydrous 332.2㎎/ℓ, Cobalt chloride·6H₂O 0.025㎎/ℓ, Cupric sulfate·5H₂O 0.025㎎/ℓ, Na₂-EDTA 37.26㎎/ℓ, Ferrous sulfate·7H₂O 27.8㎎/ℓ, Magnesium sulfate 180.7㎎/ℓ, Manganese sulfate·H₂O 16.9㎎/ℓ, Molybdic acid (sodium salt)·2H₂O 0.25㎎/ℓ, Potassium iodide 0.83㎎/ℓ, Potassium nitrate 1900㎎/ℓ, Potassium phosphate monobasic 170.0㎎/ℓ, Zinc sulfate·7H₂O 8.6㎎/ℓ.

본 발명에서는 이러한 MS 배지조성물을 40 내지 60%(w/v)로 함유하며, 2,4-D와 함께 벤질아데닌(Benzyl adenine), 카사미노산(casamino acid), 글루타민(glutamine), 수크로오스(sucrose)를 추가로 함유하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 배지에 함유되는 각 성분의 농도는 2,4-D의 경우 상기 제시한 바와 같이 1 내지 3㎎/ℓ, 벤질아데닌(Benzyl adenine)은 0.1 내지 0.5㎎/ℓ, 카사미노산(casamino acid)는 100 내지 500㎎/ℓ, 글루타민(glutamine)은 100 내지 500㎎/ℓ, 수크로오스(sucrose)는 1 내지 5%(w/v)인 것이 바람직하다. 또한 반고형 배지로 제조하여 사용하는 것이 바람직하며 이를 위해 젤란검(gellan gum) 0.1 내지 0.3%(w/v) 더 첨가하는 것이 좋다.

본 발명에 따르면, 탈수과정을 거친 백합나무의 체세포배로부터 배발생 조직을 효과적으로 수득할 수 있으며, 이에 따라 초저온 저장방법을 사용하여 백합나무의 유전자원 보존을 보다 안전하고 효과적으로 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 체세포배 형질전환 기술에 적용하면 기존 형질전환의 문제점을 개선할 수 있을 것으로 기대되며, 나아가 향후 생물공학 기술을 적용시켜 내충성 등이 우수한 백합나무의 대량증식 및 보급에 응용할 수 있을 뿐만 아니라 궁극적으로는 영양계임업(clonal forestry)의 확립, 임목 품종화 및 산림자원화에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 백합나무 체세포배 및 발아체로부터 배발생 조직을 유도하는데 있어서 2,4-D의 농도에 따른 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 포화염용액 종류에 따른 배발생 조직 유도 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 포화염용액 종류, 탈수 온도 및 시간에 따른 배발생 조직 유도 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 (NH₄)₂SO₄ 포화염용액(상대습도 79% 발생) 사용 시 탈수 시간에 따른 배발생 조직 유도 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 백합나무 체세포배와 발아체로부터 배발생 조직이 유도된 모습을 촬영한 사진이다.
도 6은 백합나무 체세포배의 탈수처리를 위해 체세포배를 12-well plate 내에 치상한 모습을 촬영한 사진이다.
도 7은 포화염용액의 종류에 따라 탈수 처리된 체세포배의 모습을 촬영한 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 식물재료 준비 >

경기 수원에 위치한 국립산림과학원 산림유전자원부 내에 자생중인 약 40년생 백합나무의 구과를 7월말 경 채취하여 종자를 분리하였으며, 종자를 70% 에탄올로 1분간 처리한 다음 2% NaClO 용액에 10분 정도 침지하고 멸균증류수로 수차례 세척하여 소독하였다.

< 배발생 조직 유도 및 증식 >

배발생 조직 유도를 위한 배지로 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지에 2.0㎎/ℓ 2,4-D, 0.25㎎/ℓ BA, 1,000㎎/ℓ casein hydrolysate 및 3.0% sucrose를 첨가하고 0.2% gellan gum(Sigma)을 첨가하여 제조한 반고형 배지를 사용하였다. 먼저 종자를 양분하고 절단면을 배지에 직접 접하는 방식으로 배양하였고, 25±2℃ 암소에서 8주 동안 배지교환 없이 배양하였다. 배발생 조직 유도 후 증식을 위해 동일한 배지를 사용하였고, 3 ~ 4주 간격으로 새로운 배지를 이식하였다.

< 체세포배 유도 >

배발생 조직으로부터 체세포배를 유도하기 위해, 먼저 증식중인 조직을 15㎎/㎖의 농도로 맞추어 액체배지(1/2MS + 4.0% sucrose)에 현탁하였다. 1회용 피펫으로 2㎖(15㎎/㎖)의 세포현탁액을 취해 체세포배 유도배지(1/2MS + 4.0% sucrose + 500㎎/ℓ casamino acid + 0.4% gelrite) 위에 곧바로 뿌려준 뒤 세포가 배지전면에 고루 흩어지도록 잘 흔든 다음 5분정도 정체시켰다. 그 후 페트리디쉬를 기울여 흘러내리는 액체배지를 무균피펫을 이용하여 모두 제거하였다. 배양조건은 24±2℃, 암소에서 8주 정도로 하였으며, 새로운 배지의 교환 없이 연속배양법으로 이루어졌다.

< 발아체 유도 >

체세포배 유도배지에서 8주정도의 유도배양 과정을 통해 발생된 체세포배를 핀셋으로 집어 발아체 유도배지(1/2MS + 2% sucrose + 0.4% gelrite)로 옮긴 다음, 24±2℃의 광배양(3,000lux) 조건 하에서 배양하여 체세포배로부터 발아체를 유도하였다.

< 체세포배의 탈수처리 >

우선 체세포배 유도 과정을 통해 발생한 체세포배를 회수하기 위해 배양된 조직을 핀셋으로 일일이 골라냈다.

체세포배의 탈수처리는 12 well로 구성된 multi-well plate를 이용하여 수행하였으며, 6개의 well에 각 well당 6 ~ 7개 정도의 체세포배를 담고 그 옆 칸에 상대습도를 조절하기 위한 용액(증류수 또는 포화용액 5종류)을 1 ~ 1.5㎖ 정도로 넣어주었다. 그 후 랩 필름으로 밀봉하고 4℃ 혹은 23 ~ 25℃에서 30분 ~ 7일간 보관하여 탈수가 이루어지도록 하였다.

상대습도 조절 용액으로는 증류수(상대습도 100% 발생), Na₂HPO₄(상대습도 97% 발생), Na₂CO₃(상대습도 88% 발생), (NH₄)₂SO₄(상대습도 79% 발생), NH₄NO₃(상대습도 63% 발생), K₂CO₃(상대습도 43% 발생)를 사용하였다.

< 체세포배로부터 배발생 조직 유도 >

체세포배를 배발생조직 유도배지(1/2MS + 0.5 ~ 5.0㎎/ℓ 2,4-D + 0.25㎎/ℓ BA + 250㎎/ℓ casamino acid + 250㎎/ℓ glutamine + 3.0% sucrose + 0.2% gellan gum)에 치상하여 25℃의 암소에서 배양하였다.

< 2,4-D 농도에 따른 배발생 조직 유도 효과 >

2,4-D의 농도를 달리하여 체세포배로부터 배발생 조직을 유도한 결과, 도 1에서와 같이 2.0㎎/ℓ 2,4-D 처리구에서 55.6%로 가장 높았으며, 35.9%를 보인 0.5㎎/ℓ 2,4-D 처리구에서 가장 낮았다. 발아체로부터 배발생 조직을 유도한 경우에는 60.9%를 보인 2.0㎎/ℓ 2,4-D 처리구에서 가장 높았으며, 최저는 0.5㎎/ℓ 2,4-D 처리구(57.2%)로 나타났다.

< 체세포배의 탈수 정도에 따른 배발생 조직 유도 효과 >

각 포화용액의 종류{증류수(상대습도 100% 발생), Na₂HPO₄(상대습도 97% 발생), Na₂CO₃(상대습도 88% 발생), (NH₄)₂SO₄(상대습도 79% 발생), NH₄NO₃(상대습도 63% 발생), K₂CO₃(상대습도 43% 발생)}에 따른 상대습도의 조절을 통해 체세포배의 탈수정도를 다르게 하여 배발생 조직을 유도한 결과(이때 2,4-D의 농도는 2.0㎎/ℓ로 동일하게 처리, 탈수 온도는 25℃로 고정), 도 2에서와 같이 (NH₄)₂SO₄(상대습도 79%)를 사용하였을 경우가 23.2%로 가장 높은 배발생 조직 유도율을 나타냈다.

< 탈수 시 포화용액 종류 및 온도에 따른 배발생 조직 유도 효과 >

각 포화용액을 사용하여 탈수할 때, 온도를 4℃, 25℃로 다르게 하여 배발생 조직 유도 효과를 확인하였다. 이때 4℃의 경우 2일간 탈수하였고, 25℃의 경우 30분간 탈수하였다.

도 3에서와 같이, (NH₄)₂SO₄(상대습도 79%) 용액을 사용하여 25℃에서 30분간 탈수시켰을 때 가장 높은 배발생 조직 유도율(11.1%)을 보였지만, 같은 포화용액을 사용한 경우라도 4℃에서 2일간 탈수시켰을 경우에는 배발생 조직이 전혀 유도되지 않았다. 또한 NH₄NO₃(상대습도 63% 발생)와 K₂CO₃(상대습도 43% 발생) 포화용액에서는 온도 및 탈수기간에 관계없이 전혀 배발생 조직이 유도되지 않았다.

< 탈수 시간에 따른 배발생 조직 유도 효과 >

최적의 배발생 조직 유도율을 보인 (NH₄)₂SO₄(상대습도 79%) 용액을 기준으로 탈수 시간에 따른 배발생 조직 유도 효과를 조사하였다(이때 2,4-D의 농도는 2.0㎎/ℓ로 동일하게 처리, 탈수 온도는 25℃로 고정).

도 4에서와 같이, 30분 탈수 시에 3.6%로 가장 높았으며, 24시간 탈수 시에는 전혀 배발생 조직이 유도되지 않았다.

본 발명에서와 같이 식물체의 조직 등을 이용하여 연구하는 경우 각각의 실험을 수행할 당시의 조건들이 미묘하게 달라질 수 있으며, 이러한 차이로 인해 실험결과 전체적으로 낮아지거나 높아질 수 있다. 예를 들어, 2,4-D 농도를 달리한 실험에서는 배발생 조직 유도율이 30 ~ 60% 정도로 비교적 높게 나타났으나, 탈수 온도 및 시간을 달리한 실험에서는 상대적으로 낮은 유도율이 나타난 것을 볼 수 있다. 이는 아마도 늦게 수행된 실험일수록 더 오래된 종자를 사용해야 하기 때문에 발생하는 현상인 것으로 판단된다. 따라서 이러한 점을 감안하여 본 실시예의 실험결과를 분석하는 경우 동시에 수행된 실험의 결과들만을 비교해야 할 것이다.

Claims

백합나무의 체세포배를 20 내지 30℃의 온도 및 75 내지 83%의 상대습도로 유지되는 밀폐된 공간에 위치시키고, 20 내지 180분간 유지하여 탈수시키는 단계; 및
탈수된 체세포배를 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)이 1 내지 3㎎/ℓ로 첨가된 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법.
제 1항에 있어서,
상기 배지는
MS(Murashige and Skoog) 배지조성물 40 내지 60%(w/v), 2,4-디클로로페녹시아세트산 1 내지 3㎎/ℓ, 벤질아데닌(Benzyl adenine) 0.1 내지 0.5㎎/ℓ, 카사미노산(casamino acid) 100 내지 500㎎/ℓ, 글루타민(glutamine) 100 내지 500㎎/ℓ, 수크로오스(sucrose) 1 내지 5%(w/v) 및 젤란검(gellan gum) 0.1 내지 0.3%(w/v)를 함유하는 것을 특징으로 하는 백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법.
제 1항에 있어서,
상기 체세포배를 23 내지 27℃의 온도 및 77 내지 81%의 상대습도로 유지되는 밀폐된 공간에 위치시키고, 20 내지 60분간 유지하여 탈수시키는 것을 특징으로 하는 백합나무 체세포배 배발생 조직 유도 방법.