KR100720338B1

KR100720338B1 - 체세포배 유도법에 의한 낙엽송의 번식 방법

Info

Publication number: KR100720338B1
Application number: KR1020050107153A
Authority: KR
Inventors: 김용욱; 문흥규
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-11-09
Filing date: 2005-11-09
Publication date: 2007-05-22
Also published as: KR20070049889A

Abstract

본 발명은 체세포배 유도법에 의한 낙엽송의 번식 방법에 관한 것으로, 낙엽송의 미숙종자배를 배양 배지에 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계와, 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 체세포배의 발아 단계, 식물체로의 분화 단계 및 재분화된 발아식물체의 인공배양토에서 환경순화 단계를 포함하는 낙엽송의 번식 방법이다.

본 발명에 의하면 향후 내충성 등 우수 침엽수종의 대량증식 및 보급에 응용할 수 있을 뿐만 아니라 더 나아가 영양계 임업(clonal forestry)의 확립 및 임목 품종화에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

낙엽송, 체세포배 유도, 미숙종자배

Description

체세포배 유도법에 의한 낙엽송의 번식 방법 {Propagation Method of Japanese larch(Larix leptolepis) through Somatic Embryogenesis Technique}

도 1은 본 발명에 사용한 낙엽송의 미숙구과 사진이다.

도 2는 유도된 배발생조직을 더욱 증식시킨 사진이다.

도 3은 체세포배 유도를 위해서 고안된 진공-필터배양 기구 사진이다.

도 4는 옥신 및 싸이토키닌 처리에 따른 체세포배 유도 비교 사진이다(윗줄 좌: 무처리, NAA, IBA, 아랫줄 좌: BA, 우: Kinetin).

도 5는 엡시식산 및 젤라이트가 첨가된 배지에서 유도중인 체세포배 사진이다.

도 6은 유도된 체세포배 중 발아처리에 사용될 자엽단계의 배만을 정선한 사진이다.

도 7은 발아배지에서 체세포배가 발아중인 소식물체의 사진이다.

도 8은 침엽, 하배축 및 뿌리형성이 이루어진 발아식물체 사진이다.

도 9는 60°사면 배지에서 더욱 생장중인 식물체 사진이다.

도 10은 발아묘를 인공토양으로 이식된 체세포배 유래 폿트묘의 사진이다.

도 11은 온실에서 환경순화된 2년생의 체세포배 유래 낙엽송 묘목의 사진이 다.

본 발명은 체세포배 유도법에 의한 낙엽송의 번식 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 낙엽송의 미숙종자배를 배양하여 체세포배 유도법으로 식물체를 발아시켜 폿트묘까지 이식하는 낙엽송의 번식 방법에 관한 것이다.

낙엽송{Larix leptolepis (Sieb. et Zucc.) Gordon}은 일본잎갈나무라고도 불리는 일본 원산의 낙엽 침엽교목으로 1904년에 일본으로부터 도입되었으며, 수고 30m, 지름 1m까지 자라는 주요한 우리나라 조림 수종 중의 하나로 현재 우리나라에서는 표고 1,250m 이하의 해변을 제외한 중부이남 지역에 식재되고 있다. 또한, 낙엽송은 극양수로 유시(幼時)생장이 빠르며 30년생일 경우 ha당 259m³의 목재를 생산한다. 목재용도는 건축, 토목, 합판용재로 널리 이용되며 수피는 염색제, 탄닌 등으로 이용된다.

그러나 낙엽송의 종자결실 풍·흉년은 5~7년 주기로 심하며 생산된 종자의 발아율은 40% 정도로 낮은 편이다. 우리나라에는 270 ha의 낙엽송 채종원이 조성되어 있으나 종자생산량이 매우 적다. 이렇게 매우 낮은 종자생산은 우선 20년 이상 임목의 성숙기간이 경과해도 종자결실을 위한 구과 형성이 충분히 잘 이루어지지 않고 자화형성이 이른 봄에 이루어져 동해(凍害)를 받아 충분한 수분(受粉)이 이루어지지 않기 때문이다.

낙엽송 종자를 생산하기 위한 종래기술은 먼저 우수한 형질을 지닌 임목을 선발한 후 수형목끼리 교배하여 양친으로부터 좋은 형질을 물려받은 종자생산이 가능한 채종원을 조성하여 다량의 개량종자를 생산하는 것이었다. 또한, 접·삽목과 같은 영양번식의 기술도 개발하여 왔는데 그중 삽목 방법이 현재 가장 많이 이용되고 있다. 그러나 유전검정을 통하여 선발된 클론은 이미 상당한 수령에 도달해 있어 삽목 발근율은 현저히 감소하며, 또한 많은 양의 삽수 조달이 힘들므로 단기간 내 대량의 우량한 묘목을 얻기는 힘들다. 최근에는 종자에서 발아한 실생묘로부터 삽수를 채취하여 증식하기도 하는데 이는 종자의 다양한 유전적 구성으로 인하여 클론 간에 많은 발근율 차이를 보여 일정한 양의 발근묘를 지속적으로 생산할 수 없다. 그리고 삽목기술은 하나의 모수에서 다량의 삽수채취가 가능하고 좁은 공간에서도 다량의 삽목묘 생산이 가능하지만 모수의 수령이 높아질수록 삽수의 발근율은 현저히 감소하고 또한 발근이 되더라도 새로운 줄기유도가 힘들다는 단점이 있다.

최근 이러한 단점을 극복하기 위해 조직배양 기술을 통한 우량개체의 번식의 기술개발이 꾸준히 이루어지고 있는데 그중 체세포배 유도방법을 이용한 식물체 번식법이 현재 임업선진국에서 가장 많이 이용하는 방법 중 하나이다. 또한, 이 기술에다가 해충과 질병 및 환경 스트레스에 대하여 저항성이 있는 유전자를 세포내로 삽입시켜 신품종 개발에도 응용하고 있다.

체세포배 유도 기술은 시험관 내에서 인위적으로 배(胚)를 유도한 다음 그로부터 발아시켜 식물체를 만드는 일종의 식물 대량복제 기술로 이용되고 있다. 임목에 관한 체세포배 유도는 Litz가 1985년 감귤나무 및 종려나무의 주심조직을 이용한 것이 시초이며, 1970∼80 년대 이 기술의 적용대상은 주로 활엽수종에 국한되어 왔다.

침엽수종에 대한 체세포배 연구는 Hakman(1985)이 독일가문비나무(Picea abies)의 미숙 종자배로부터 체세포배를 처음으로 유도하였으며(Hakman I. and S. von Arnold, 1985. J. Plant Physiol. 121: 149-158.), 지금까지 연구된 침엽수종은 전나무속 (Schuller A., Reuther G. and Geier T. 1989. Org. Cult. 17: 53-58), 독일가문비나무속 (Dunstan, D.I. et al., 1991. Plant Sci. 76: 219-228; Lelu, M.A. and C.H. Bornman, 1990. Plant Physiol. Biochem. 28: 785-791; Roberts, D.R. et al., 1991. J. Plant Physiol. 138: 1-6), 소나무속 (Jones, N.B. and J. van-Staden, 1995. J. Plant Physiol. 145: 519-525; Klimaszewska, K. et al., 1997. Can. J. For. Res. 27: 538-550) 및 Larch속 (Kim Y.W. et al., 1999. Plant Cell Tiss,. Org. Cult. 55: 95-101; Klimaszewska, K. et al., 1997. Can. J. For. Res. 27: 538-550; Label, P. and M.A. Lelu, 1994. Plant Growth Reg. 15: 175-182) 등의 수종에서 많은 연구가 이루어졌다. 현재는 독일가문비나무속의 수종, 라디아타소나무 및 테다소나무등의 수종 등에서 가장 진보한 체세포배 유도 기술 개발이 이루어져 거의 산업화 수준까지 도달해 있다. 현재 미국(Westvaco Co.) 캐나다(Silvagenic Co.와 Laurentian Forestry Centre) 및 뉴질랜 드(Forest Research Institute와 Carter Holt Harvey Ltd.)와 같은 임업 선진국가에서는 체세포배 기술을 이용하여 새로운 우수 침엽수종 품종을 산업적인 규모로 대량 생산하고 있다.

체세포배의 장점으로는 식물체의 형성시 줄기 및 뿌리형성이 동시에 발생하여 액아 배양 및 엽속 배양과 같이 줄기와 뿌리발생을 위한 개개의 식물생장 조절물질의 처리가 필요치 않아서 기존의 증식방법보다 월등한 생산효율을 지니는 장점을 지닌다. 특히 침엽수종의 경우 기존의 증식방법인 종자배 배양이나 침엽배양으로는 줄기분화가 어느 정도 가능하나 차후에 줄기신장 및 뿌리유도는 상당히 힘들어 결국 식물체의 대량증식은 불가능하게 된다. 또한, 체세포배 유도기술은 임목의 무성번식 기술에도 적용할 수 있는데 특히 인공종자 기술과 결합하면 클론 임목의 대량생산 연구에 큰 잠재력을 가진다.

낙엽송(Larix)속 수종의 체세포배 유도 연구는 Nagmani와 Bonga(1985)가 유럽낙엽송(L. decidua)의 배유(female gametophyte) 조직으로부터 배발생조직을 유도한 것이 시초이며 그 후 L. laricina, L.ㅧleptoeuropaea, L. occidentalis 및 낙엽송 등의 수종에서 체세포배 유도를 이용한 식물체재분화에 관한 연구가 이루어졌다. 또한, 낙엽송의 체세포배 유도에 관한 Kim(Kim Y.W. et al., 1999. Plant Cell Tiss,. Org. Cult. 55: 95-101) 등의 보고는 배발생조직 1그램당 최대 23.6개 정도로 체세포배 유도수가 매우 낮아 그 체세포배 생산효율이 매우 낮다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 제안된 것으 로, 본 발명의 목적은 낙엽송의 번식에 있어서, 낙엽송의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 얻은 후 그 조직으로부터 체세포배 유도시 기존의 방법보다는 더욱 효과적인 기술을 개발하고, 또한 체세포배로부터 식물체로 발아시켜 폿트묘까지 이식하는 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 낙엽송의 배발생조직을 재료로 하여 가장 효율적인 체세포배 유도를 위해 활성탄처리, 필터진공배양 개발, 엡시식산 농도, 젤라이트 농도 등의 요인들을 구명하고, 성숙한 체세포배를 발아시켜 최종적으로는 폿트묘까지 재분화가 가능한 낙엽송 번식 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 낙엽송의 번식 방법에 있어서, 낙엽송의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계, 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 체세포배의 발아 단계, 식물체로의 분화 단계 및 재분화된 발아식물체의 인공배양토에서 환경순화 및 포지 이식단계를 포함하는 낙엽송의 번식 방법을 포함한다.

이하 상기 번식방법에 사용되는 배지의 구체적인 조성을 바람직한 실시예를 들어 설명하기로 한다.

상기 번식 방법에 있어서, 배발생조직의 유도에서 배지는 바람직하게는 통상의 1/2LM배지에 10~80g/수크로즈, 0.5~5.0㎎/ℓ 2,4-D, 0.5~5.0㎎/ℓ BAP, 100~1,000㎎/ℓ L-글루타민 및 0.4~1.0%의 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0~7.0 범위 를 만족하는 고체 배지를 사용하는 것이 좋다.

상기 번식 방법에 있어서, 배발생조직의 증식에서 배지는 바람직하게는 통상의 1/2LM배지에 10~80g/수크로즈, 0.5~5.0㎎/ℓ 2,4-D, 0.5~5.0㎎/ℓ BAP, 100~1,000㎎/ℓ L-글루타민 및 0.4~1.0%의 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체 배지를 사용하는 것이 좋다.

상기 번식 방법에 있어서, 체세포배 유도 단계에서 세포현탁액을 필터로 여과하고 상기 필터를 체세포배 유도 배지 위에 치상하는 필터진공 배양장치를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 번식 방법에 있어서, 체세포배 유도에서 사용되는 배지는 바람직하게는 통상의 1/2LM배지에 10~80g/ℓ 슈크로우져, 100~1,000㎎/ℓ L-글루타민, 100~1,000㎎/ℓ 카제인, 60∼80μM 엡시식산 0.4~1.0%의 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체 배지를 사용하는 것이 좋다.

상기 번식 방법에 있어서, 체세포배 유도에서 배발생조직을 0.1~2.0%의 활성탄이 첨가된 배지에서 5~10일 동안 전처리를 하는 것이 좋다.

상기 번식 방법에 있어서, 체세포배를 발아하기 위한 배지로는 바람직하게는 통상의 내지는 1/2LM배지에 10~80g/ℓ 수크로스, 0.4~1.0%의 젤라이트가 첨가되고 pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체 배지를 사용하는 것이 좋다.

이때 바람직한 체세포배의 배양은 소정 기간 22~28℃ 정도의 암소에서 배양하는 단계와, 암소 배양 이후 300~3,000룩스 범위 내에서 광도를 증가시켜 배양하는 단계를 포함하도록 한다.

상기 번식 방법에 있어서, 발아된 식물체의 재분화 단계에 사용되는 배지로는 통상의 내지는 1/2LM배지에 10~80g/ℓ 수크로스, 0.4~1.0%의 젤라이트가 첨가되고 pH 5.0~7.0 범위를 만족하며 소정 경사를 가지도록 굳힌 배지가 들어있는 시험관에 이식하여 생장시키는 것이 좋다.

상기 번식 방법에 있어서, 환경순화단계는 발아식물체의 길이가 5∼6㎝ 이상인 것을 선별하여 인공 흙이 담긴 플라스틱 폿트에 이식하여 22~28℃ 정도, 300~3,000룩스의 조건에서 순화한 후, 활착된 폿트묘를 비닐 폿트로 옮겨 심어 온실에서 더욱 활착 및 생장시키는 것이 좋다.

본 발명은 기존의 방법보다는 훨씬 효과적인 체세포배 유도방법에 그 주안점을 두었는데, 특히 본 발명에서는 체세포배를 유도하기 전에 활성탄(Activated charcoal)이 첨가된 배지에서 배발생조직의 전처리 효과, 퍼넬(funnel)을 이용한 필터진공 배양법, 식물생장조절물질 첨가의 효과, 세포농도의 효과, 고농도의 엡시식산(Abscisic acid, ABA), 삼투압제 및 젤라이트(gelrite)등의 물질 처리를 하여 체세포배 유도의 적정화를 밝힌 후 체세포배의 발아 및 식물체 재분화 등에 관한 일련의 식물체 재분화에 의한 번식 방법을 제시하였다.

본 발명에서 미숙종자는 충북 충주에 위치한 낙엽송클론 채종원에서 미숙구과를 채취하고 미숙배만을 분리하여 사용할 때까지 4℃에서 냉장보관 하고, 사용 시에 세척 및 표면살균하여 사용한다.

본 발명에서 미숙배로부터 배발생조직을 유도하기 위한 배양 배지로는 LM(Litvay, J.D. et al., 1985. Plant Cell Rep. 4: 325-328) 배지를 원래 배지 조 성과는 달리 약간 변형시켜 사용할 수 있다(표1). 미숙배를 배양할 때는 멸균한 종자의 종피를 제거하여 배유조직(female gametophyte)은 버리고, 종자만을 배양하고 계대 배양을 통해 증식시킨다. 체세포배 유도를 하기 전의 배발생 조직은 최초 계대 배양 후 3일이 지난 조직을 사용하고, 체세포배 유도는 필터진공 배양법을 이용한다.

또한, 체세포배 유도배지에 식물생장조절물질인 옥신(NAA, IBA), 싸이토키닌(BA, Kinetin)을 적정량 첨가하여 체세포배 유도 효과를 증가시킬 수 있다.

흡착성이 강하고 탄소물질로 구성된 활성탄은 식물조직배양시 분비하는 페놀성 등의 독성물질 및 배발생조직 증식 중에 계속하여 첨가하는 식물생장조절물질 등을 흡수하여 체세포배 유도를 촉진하는 기능이 있다. 또한, 엡시식산은 체세포배가 유도되어가는 동안에 조직 내의 저장 단백질, 트리글리세라이드(Triglyceride) 및 지질 등의 저장물질 증가를 촉진하고 유도된 체세포배의 조숙발아 억제를 위해 첨가하는 식물생장조절물질로서 침엽수종 체세포배를 유도할 경우에 꼭 필요하다. 배발생조직의 활성탄 전처리는 엡시식산 농도 전체에서 무처리에 비해 최대 3.6배에서 최저 2.4배 높은 체세포배 유도수의 차이를 보여 활성탄 전처리가 매우 필수적인 단계임을 알 수 있다.

체세포배를 유도하기 위한 엡시식산이 첨가된 배지로 주로 고형 배지를 많이 사용하는데 이때 침엽수종의 경우, 고형형성을 위해 아가(한천)보다 더욱 정제되어 독성이 매우 낮은 젤라이트를 사용하도록 한다. 젤라이트의 농도는 0.6∼1.0%로, 간접적인 배발생조직의 탈수를 촉진시켜 조직으로부터 체세포배가 분화될 수 있도 록 한다. 본 발명에 의하면 엡시식산 농도가 증가할수록 유도수도 점차 증가하므로, 동일농도의 젤라이트에서는 엡시식산 농도가 높을수록 체세포배 유도수가 높은 경향을 나타내는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명에서 배발생조직으로부터 유도한 체세포배중 자엽단계의 체세포배만을 해부현미경하에서 선발하여 체세포를 발아시킬 수 있다. 발아체의 길이가 4㎝ 이상이 되면 60°기울기로 굳힌 배지가 들어 있는 시험관으로 이식하고, 발아식물체의 길이가 5∼6㎝ 이상이 되면 시험관에서 식물체를 꺼내어 인공흙이 담긴 플라스틱 폿트로 이식하여 환경순화 단계를 실시한다. 또한, 활착된 폿트묘는 비닐 폿트로 옮겨 심어 온실에서 더욱 생장시킬 수 있다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실험 및 실시예를 통해 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기에서 설명한 실시 예에만 국한되지 않는다.

[실시예 1] 식물재료 채취 및 살균

본 발명에서는 미숙종자는 충북 충주에 위치한 낙엽송클론 채종원에서 '94년 6월24일부터 8월6일까지 1주 간격으로 클론 구분없이 풍매 미숙구과를 채취하여 미숙배만을 분리, 배양하였다. 채취한 미숙 종자는 사용할 때까지 4℃에서 냉장보관 하였다. 미숙구과 멸균은 95% 에탄올에 2분간 침지 후 6% NaClO용액에 10분간 표면살균한 다음 멸균증류수로 1회 세척하였다. 그 다음 구과를 배양 직전에 95% 에탄올에 잠시 침적한 후 화염에 3-4초 동안 표면살균한 다음 구과로부터 미숙종자를 분리하였다(도 1).

[실시예 2] 배지조성 및 조제

본 발명에서는 미숙배로부터 배발생조직을 유도하기 위한 배양 배지는 LM(Litvay, J.D. et al., 1985. Plant Cell Rep. 4: 325-328) 배지를 원래 배지 조성과는 달리 약간 변형시켜 사용하였으며(표1), 배지에는 20g/ℓ슈크로우져, 2.0㎎/ℓ 2,4-D, 1.0㎎/ℓ BAP를 공통으로 첨가하였다. 산도는 5.7로 조정하고 0.4%의 젤라이트를 첨가하여 고체 배지로 조제하였고 1,000㎎/ℓ L-글루타민은 배지의 열소독이 끝난 후 배지의 온도가 50℃ 정도로 식었을 때 따로 첨가하였고, 배지 분주는 87㎜×15㎜ 크기의 플라스틱 페트리디쉬(녹십자)에 15㎖ 정도 분주하여 상온에서 하룻밤 정도 굳힌 후 사용하였다.

[표 1] 낙엽송 체세포배 유도에 사용된 배지의 성분 조성표

Medium : Components	LM
Inorganic salts(mg/L)
NH₄NO₃	1650
H₃BO₃	31
CaCl₂	16.6
CoCl₂·6H₂O	0.125
CuSO₄·5H₂O	0.5
C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O	37.3
FeSO₄·7H₂O	27.8
MgSO₄	903.39
MnSO₄·H₂O	21.0
NaMoO₄·2H₂O	1.25
KI	4.15
KNO₃	1900
KH₂PO₄	340
ZnSO₄·7H₂O	43
Vitamines(mg/L)
myo-inositol	100
Nicotinic acid	0.5
Pyridoxine·HCl	0.1
Thiamine·HCl	0.1

[실시예 3] 배발생조직의 유도 및 증식

미숙배를 배양할 때는 멸균한 종자의 종피를 제거 후 배유조직(female gametophyte)은 버리고 종자배만을 배양하였고 배지의 표면에 길이방향으로 접하도록 수평으로 치상하여 25℃, 암소의 배양조건하에서 4주마다 동일조성의 새로운 배지로 이식하였다.

유도한 배발생조직의 증식은 염류의 양을 반으로 줄인 1/2LM배지에 20g/슈크로우져, 2.0㎎/ℓ 2,4-D, 1.0㎎/ℓ BAP, 1,000㎎/ℓ L-글루타민, 0.4% 젤라이트가 첨가된 배지에서 1주마다 계대 배양을 하면서 증식시켰다(도 2).

[실시예 4] 필터 진공배양 장치를 이용한 체세포배 유도

체세포배 유도를 하기전의 배발생 조직은 최초 계대 배양 후 3일이 지난 조직을 사용하였다. 먼저, 배발생조직은 액체 배지 ㎖당 30㎎의 비율로 전자저울로 무게를 측정한 후 200㎖ 용량의 삼각플라스크에 넣고 그에 상응하는 액체배지(1/2LM+20g/ℓ 슈크로우져)를 첨가하였다. 그 다음에는 1회용 멸균된 플라스틱 피펫으로 흡입과 배출을 되풀이하는 방법으로 조직을 잘게 부수어 큰 덩이가 없는 미세한 세포현탁액을 준비하였다. 체세포배 유도는 필터진공 배양법을 이용하였는데 먼저, Buchner 퍼넬을 1ℓ 용량의 진공 가지 플라스크 위쪽에 공기가 새지 않도록 단단히 고정시킨 후 5.5㎝ 크기의 종이필터(Whatman 2번)를 퍼넬 중앙에 놓고 약 3㎖(90㎎조직 포함)의 세포현탁액을 뽑아 종이필터 위로 고루 뿌려주었다. 그런 다음 진공펌프를 가동시켜 4∼5초 동안 진공상태를 만들어주어 종이필터에 있는 액체를 퍼넬을 통하여 아래로 모두 배출시키고 세포만 필터 위에 남게 한 다음 그 필터 는 체세포배 유도배지(1/2LM+60g/ℓ 슈크로우져+60μM+0.6% 젤라이트) 위에 치상하는 방법으로 체세포배 유도를 시작하였다(도 3). 배양 환경은 25℃, 암소에서 약 6주간 배양하였고 그 기간 동안에는 새로운 체세포배 유도배지로 계대 배양은 하지 않았다.

[실시예 5] 옥신 및 싸이토키닌 종류별 첨가시 체세포배 유도 효과

체세포배 유도배지에 식물생장조절물질인 옥신(NAA, IBA) 및 싸이토키닌(BA, Kinetin)을 공히 0.2㎎/ℓ를 첨가하여 체세포배 유도 효과를 조사하였다. 그 결과 옥신류인 0.2㎎/ℓ IBA첨가하였을 경우에 1g 조직당 425개의 가장 많은 수의 체세포배를 유도하였으며(표 2), 그 다음은 옥신류인 NAA(300개/1g조직) 첨가하였을 경우에 효과적이었다. 그러나 싸이토키닌류인 BA와 Kinetin을 첨가하였을 때는 체세포배 유도가 전혀 이루어지지 않고 배발생조직만 증식되어 체세포배 유도에는 싸이토키닌류의 첨가가 비효과적인 것으로 나타났다(도 4).

[표 2] 옥신 및 싸이토키닌 종류별 첨가시 체세포배 유도 효과

식물생장조절물질 (㎎/ℓ)	체세포배 유도 수 (/1g조직 당)
무첨가	241
NAA	300
IBA	425
BA	0
Kinetin	0

또한, 체세포배 유도에 가장 효과적인 L-글루타민과 카제인의 농도는 각각 500㎎/ℓ, 250㎎/ℓ이며, L-글루타민 250㎎/ℓ＋카제인 250㎎/ℓ일 때, 1g 조직당 470개의 체세포배를 유도하였다(표 3).

[표 3] L-글루타민과 카제인 농도별 첨가시 체세포배 유도 효과

처리구 (㎎/ℓ)	체세포배 유도 수 (/1g조직 당)
0	159
250 G^a	322
500 G	389
1,000 G	248
250 CA^b	81
500 CA	74
1,000 CA	26
250 G + 250 CA	470
500 G + 500 CA	447

G^a: 글루타민, CA^b: 카제인

[실시예 6] IBA 농도별 첨가시 체세포배 유도 효과

이 실험은 실시 5에서 나온 결과에서 가장 효과적인 IBA를 여러 농도로 첨가하여 본 결과로서 체세포배 유도에 가장 효과적인 IBA농도는 0.2㎎/ℓ이며 1g 조직당 1,062개의 체세포배를 유도하였다 (표 4). 그리고 0~1.0㎎/ℓ IBA 농도에서는 대체로 많은 수의 체세포배가 유도되었지만 2.0㎎/ℓ이상의 고농도에서는 그 유도수가 점차 감소하였고 오히려 억제됨을 알 수 있다.

[표 4]IBA 농도별 첨가시 체세포배 유도 효과

IBA 농도 (㎎/ℓ)	체세포배 유도 수 (/1g조직 당)
0	790
0.1	841
0.2	1,062
0.5	753
1.0	985
2.0	642
5.0	382

[실시 예 7] 세포농도별 체세포배 유도 효과

최대 체세포배 유도수는 1g조직으로부터 884개를 유도한 세포농도가 액체배지 ㎖당 20㎎일 때였으며 그 다음으로는 30㎎(807개/1g조직)농도에서 나타났다(표 5). 그러나 5㎎/㎖의 농도에서는 가장 낮은 유도수를 보였고 75㎎/㎖의 농도 이상일 때는 조직의 과잉증식으로 인하여 도리어 체세포배의 유도가 억제됨을 알 수 있다.

[표 5] 세포농도별 체세포배 유도 효과

세포 농도 (㎎/㎖)	체세포배 유도 수 (/1g조직 당)
5	61
10	474
20	884
30	807
50	666
75	170
100	144

[실시 예 8] 활성탄 처리 및 엡시식산 농도별 체세포배 유도 효과

흡착성이 강하고 탄소물질로 구성된 활성탄의 기능은 식물조직배양시 분비하는 페놀성 등의 독성물질 및 배발생조직 증식 중에 계속적으로 첨가한 식물생장조절물질 등(예: 2,4-D, BA)을 흡수하여 체세포배 유도를 촉진하는 기능을 가진다. 또한 엡시식산의 기능은 체세포배가 유도되어가는 동안에 조직 내의 저장 단백질, 트리글리세라이드(Triglyceride) 및 지질 등의 저장물질 증가를 촉진하고 유도된 체세포배의 조숙발아 억제를 위해 첨가하는 식물생장조절물질로서 침엽수종 체세포배 유도할 경우에 꼭 필요하다. 따라서 체세포배 유도시 배발생조직을 1.0 %의 활성탄이 첨가된 배지에서 1주 동안 전처리를 하였다.

본 발명에서 최적 체세포배 유도를 위한 배발생조직의 활성탄 첨가배지에서의 전처리 효과 및 엡시식산 농도별 첨가의 효과를 조사한 바 배발생조직의 활성탄 전처리는 엡시식산 농도 전체에서 무처리에 비해 최대 3.6배(40μM 엡시식산)에서 최저 2.4배(80μM 엡시식산)가 높은 체세포배 유도수의 차이를 보여 활성탄 전처리 가 매우 필수적인 단계임을 알 수 있다. 또한 엡시식산 농도별 최대 체세포배 유도를 보인 처리구는 조직 1g당 1,325개의 체세포배를 유도한 80μM 엡시식산 첨가 처리구였다(표 6). 그리고 활성탄 처리 유·무에 관계없이 엡시식산 농도가 증가할수록 체세포배 유도수도 증가하는 경향을 보였다.

[표 6] 활성탄 처리 및 엡시식산 농도별 체세포배 유도 효과

엡시식산 농도 (μM)	체세포배 유도 수 (/1g조직 당)
엡시식산 농도 (μM)	활성탄 처리	활성탄 무처리
0	0	0
8	448	178
20	666	192
40	973	270
60	1,239	422
80	1,325	555

[실시 예 9] 엡시식산 및 젤라이트 농도별 체세포배 유도 효과

체세포배를 유도하기 위한 엡시식산이 첨가된 배지는 주로 고형배지를 많이 사용하는데 이때 고형형성을 위해 주로 아가(한천)이 첨가되는데 침엽수종의 경우 아가보다 더욱 정제되어 독성이 매우 낮은 젤라이트가 첨가된다(도 5). 또한 그 농도가 0.4% 정도인데 반해 본 발명에서는 0.6∼1.0%까지 높여 간접적인 배발생조직의 탈수를 촉진시켜 조직으로부터 체세포배가 분화될수 있도록 고안하였다. 가장 많은 체세포배 유도는 60μM 엡시식산+0.8% 젤라이트 처리구에서 1g 조직당 392개로 가장 많았고 그와 유사하게 60μM 엡시식산+0.8% 젤라이트 처리구에서도 381개로 높은 유도수를 보여 두 처리 모두 효과가 높은 것으로 나타났다(표 7). 그러나 20μM 엡시식산+0.6% 젤라이트 처리구에서 107개로 가장 낮았는데 엡시식산 농도가 증가할수록 유도수도 점차 증가하여 동일농도의 젤라이트에서는 엡시식산 농도가 높을수록 체세포배 유도수가 높은 경향을 알 수 있었다.

[표 7] 엡시식산 및 젤라이트 농도별 체세포배 유도 효과

엡시식산 농도(μM)	젤라이트 농도(%)	체세포배 유도 수 (/1g조직 당)
20	0.6	107
40	0.6	270
60	0.6	381
20	0.8	185
40	0.8	322
60	0.8	392
20	1.0	137
40	1.0	167
60	1.0	300

[실시예 10] 체세포배의 발아

체세포배를 발아는 배발생조직으로부터 유도한 체세포배중 자엽단계의 체세포배만을 해부현미경하에서 선발하여 사용하였다(도 6). 발아 배지는 1/2LM배지에 20g/ℓ수크로스 및 0.6%의 젤라이트로 조제하였다. 체세포배 발아는 최초 2주는 암소에서 실시하였고 다음 2주는 약 300룩스 정도의 약한 광도하에서 그 이후에는 3,000룩스의 광도로 옮겼다.

발아 처리 1주 후에는 체세포배의 자엽과 하배축부분이 신장되고 색깔은 푸른색을 띄기 시작하지만 하배축 끝의 유근발달은 아직 이루어지지 않았다(도 7). 발아 2~3주 후에는 자엽과 하배축은 더욱 길이 생장을 하며 그 말단에는 뿌리유도가 관찰되었다(도 8). 발아 4주가 넘으면 발아식물체의 말단에 있는 정아에서 새로운 신초가 발생하고 길이생장이 더욱 가속되었다. 발아 2~3주마다 새로운 배지로 교환하고 발아체의 길이가 4㎝ 이상이 되면 60°기울기로 굳힌 배지가 들어 있는 시험관으로 이식하였는데, 이때 뿌리는 배지 속으로 삽입이 되지 않고 배지 위로 치상하였다(도 9).

[실시예 11] 순화과정을 통한 폿트묘 생산

발아식물체의 길이가 5∼6㎝ 이상이 되면 시험관에서 식물체를 꺼내어 인공흙(펄라이트:피트모스:버미큘라이트, 1:1:1)이 담긴 플라스틱 폿트(φ 5.5㎝×7㎝)로 이식하였다(도 10). 폿트묘의 순화환경은 배양실 조건(25℃, 3,000룩스, 16시간 광조명)에서 8주간 실시하였고 환경순화는 매일 충분한 양의 물을 관수하여 내부 상대습도를 높게 유지시켰다. 활착된 폿트묘는 비닐 폿트(φ 11㎝×20㎝)로 옮겨 심어 온실에서 더욱 생장시켰다(도 11).

본 발명에 의하면 단시간 내에 우수 침엽수종의 대량생산이 가능해져 생장 및 재질이 우수한 낙엽송 외에도 다른 침엽수종의 무성대량 증식뿐만 아니라 솔잎혹파리 등과 같은 병충해에 강한 소나무의 신품종 육종에도 동일하게 이 기술을 적용시킬 수 있다. 아울러 이 기술의 개발로 유전자조작 등의 첨단 생물공학 기법을 임업에 적용하는 것이 가능해졌으며 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성증진 등의 산림자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

낙엽송의 번식 방법에 있어서, 낙엽송의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계, 배발생조직을 활성탄이 첨가된 배지에서 전처리를 하는 단계, 상기 전처리한 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 체세포배의 발아 단계, 식물체로의 분화 단계 및 재분화된 발아식물체의 환경순화 단계 및 포지 이식단계를 포함함을 특징으로 하는 체세포배 유도에 의한 낙엽송의 번식 방법.
제1항 있어서, 배발생조직의 유도에서 배지는 통상의 1/2LM배지에 10~80g/수크로즈, 0.5~5.0㎎/ℓ 2,4-D, 0.5~5.0㎎/ℓ BAP, 100~1,000㎎/ℓ L-글루타민 및 0.4~1.0중량%의 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체 배지임을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제2항에 있어서, 배양환경은 22~28℃ 정도의 암소에서 배양하는 것을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제1항 있어서, 배발생조직의 증식에서 배지는 통상의 1/2LM배지에 10~80g/수크로즈, 0.5~5.0㎎/ℓ 2,4-D, 0.5~5.0㎎/ℓ BAP, 100~1,000㎎/ℓ L-글루타민 및 0.4~1.0중량%의 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체 배지임을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제4항에 있어서, 배양환경은 22~28℃ 정도의 암소에서 배양하면서 계대 배양하는 것을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제 1항에 있어서, 상기 체세포배 유도 단계에서 세포현탁액을 필터로 여과하고 상기 필터를 체세포배 유도배지위에 치상하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제1항에 있어서, 체세포배 유도에서 사용되는 배지는 통상의 1/2LM배지에 10~80g/ℓ 수크로스, 100~1,000㎎/ℓ L-글루타민, 100~1,000㎎/ℓ 카제인, 60∼80μM 엡시식산 0.6~1.0중량%의 젤라이트가 첨가되고, pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체 배지임을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제7항에 있어서, 배양환경은 22~28℃ 정도의 암소에서 배양하는 것을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제1항에 있어서, 배발생조직의 전처리하는 단계는 0.1∼2.0중량%의 활성탄이 첨가된 배지에서 5∼10일 동안 전처리를 하는 것을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제1항에 있어서, 체세포배를 발아하기 위한 배지로는 통상의 내지는 1/2LM배지에 10~80g/ℓ 수크로스, 0.4~1.0중량%의 젤라이트가 첨가되고 pH 5.0~7.0 범위를 만족하는 고체배지임을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제10항에 있어서, 체세포배의 발아는 22~28℃ 정도의 암소에서 배양하는 단계와, 암소 배양 이후 300~3,000룩스 범위 내에서 광도를 증가시켜 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제1항에 있어서, 발아된 식물체의 재분화 단계는 통상의 내지는 1/2LM배지에 10~80g/ℓ 수크로스, 0.4~1.0중량%의 젤라이트가 첨가되고 pH 5.0~7.0 범위를 만족하며, 경사를 가지도록 굳힌 배지가 들어있는 시험관에 이식하여 생장시킴을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.
제1항에 있어서, 환경순화단계는 발아식물체의 길이가 5∼6㎝ 이상인 것을 선별하여 인공흙이 담긴 플라스틱 폿트에 이식하여 22~28℃ 정도, 300~3,000룩스의 조건에서 순화한 후, 활착된 폿트묘를 비닐 폿트로 옮겨 심어 온실에서 더욱 활착 및 생장시키는 것을 특징으로 하는 낙엽송의 번식 방법.