CN105284621B - 一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，包括采用小蓬竹无菌苗茎段为外植体，在诱导培养基上形成愈伤组织，进而诱导胚性愈伤组织的发生，将胚性愈伤组织接种到改良的分化培养基上，诱导胚性愈伤组织分化出芽，再接种到生根培养基上分化出根，形成完整植株，最后移栽到花盆，完成小蓬竹再生全过程。本发明方法，获得小蓬竹的频率高，时间短，非常适宜于小蓬竹遗传改良。完成小蓬竹植株再生的时间最快仅需12周左右。为小蓬竹的快速繁殖和定向生物技术育种奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明属于竹类植物生物技术领域，具体涉及一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法。
背景技术
小蓬竹[Drepanostachyum luodianense(Yi et R.S.Wang)Keng f.]系禾本科竹亚科镰序竹属，又名“藤竹”、“竹麻”，为一次性开花结实的合轴丛生竹种。小蓬竹竹秆下部直立，近实心，上部垂悬呈蔓状延伸，外形美观，具有栽培观赏价值，常成小片生长于海拔600～1000m的石灰岩裸露石山上，是喀斯特石山地区的适生性竹种。小蓬竹的适应性强，较能耐干旱和瘠薄，特别是在坡度较大的喀斯特地区，许多其它树种和竹类不能生存或能生存但长势不好，而小蓬竹在此却能生长良好，且在狭小的石沟、石缝中也能良好生长，具有良好的生态效益。小蓬竹在喀斯特生态系统的水源涵养、水土保持、养分平衡等生态功能发挥中具有重要的作用，且又是重要的经济竹种，其竹材柔韧，可编织凉椅和农具；整秆极适宜用来作菜架和篱笆等用；竹材纤维含量高、强度大，也是优良的造纸原料：植株形态优美，是良好的园林绿化竹种，特别适合作梯度绿化。同时，小蓬竹还具有较大的使用价值，具有良好的开发利用前景。
然而小蓬竹是我国特产竹种，在世界自然保护联盟物种生存委员会编制的《濒危物种红色名录》中被定为濒危种。20世纪末期，小蓬竹被当地造纸企业广泛用作造纸原料，特别是对新生幼竹掠夺式的砍伐现象严重，致使小蓬竹无性系种群严重退化，竹株衰老死亡，种群数量急剧减少(刘济明.喀斯特适生植物小蓬竹研究I[M].贵阳:贵州人民出版社,2010:95-109.)。据现有调查，小蓬竹在贵州省的罗甸县、平塘县、紫云苗族布依族自治县、长顺县、望谟、安龙、贞丰、册亨及惠水等地的喀斯特山地有分布，于海拔600～1000m的山坡上成片生长，种群数量不断减少，亟需保护(金祺,刘济明.不同生境条件对小蓬竹生长的影响[J].中南林业调查规划,2014,33(4):52～56)。
由于竹类植物营养生长期长，开花期无法预测，且大部分竹类植物结实率低，种子获取十分困难。因此，竹子繁殖主要以一株埋鞭、埋秆、埋节等传统方法为主，这些方法具有消耗种竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，小蓬竹也是如此。利用生物技术可以高效、快速地对作物品种性状进行遗传改良，从而为小蓬竹再生植株的培养提供一种方便、快捷和有效的方法。
竹子组织培养方面的研究，最早见于Alexander和Rao(1968)关于竹子合子胚离体培养的简报。国内外比较系统开展竹子组织培养工作始于20世纪80年代。1982年，Metha等(1982)在第5届国际植物组织细胞培养会议上首次报道通过胚性愈伤组织获得印度箣竹(Bambusa arundinacea)再生植株。我国的竹子组织培养工作开展得较晚，20世纪90年代才开始，目前已实现了簕竹属(Bambusa)的部分竹种、翠竹(Pleioblastus pygmaea)、人面竹(Phyllostachys aurea)、菲白竹(Pleioblastus fortunei)、小蓬竹(Drepanostachyumluodianense)等观赏竹的组培快繁。但这些竹种大都通过以芽繁芽途径实现试管里的离体培养和快速繁殖。现阶段，国内通过以芽繁芽途径来实现竹子植株的再生，其技术已趋于成熟，但通过体胚诱导途径来实现植株的再生，这方面报道并不多。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，能快速、大量获得小蓬竹再生植株。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，具体步骤为：
1)将无菌的小蓬竹丛芽分段接种到愈伤诱导培养基进行愈伤诱导，愈伤组织形成后转接到继代培养基进行增殖培养，得到胚性愈伤组织；愈伤诱导培养基组成为：以MS为基本培养基，再附加2.0～3.0mg/L 2,4-D、0.01～0.1mg/L TDZ、0.5～1.0mg/LNAA、100mg/LVc、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂；继代培养基组成为：以MS为基本培养基，再附加4.0～5.0mg/L2,4-D、0.5～1.0mg/L TDZ、100mg/L Vc、30g/L蔗糖、7g/L琼脂；
2)将胚性愈伤组织转接到分化培养基上培养，至有再生丛芽分化形成；分化培养基组成为：以MS为基本培养基，再附加1.0～2.0mg/L TDZ、0.5～1.0mg/L NAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂；
3)将已经分化出的再生芽转接到生根培养基中，进行生根培养；生根培养基组成为以MS为基本培养基，再附加1.0～3.0mg/L NAA，0.1～0.5mg/L IBA；
4)待根生长至5～10cm时，进行再生苗的移栽；再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中生长2周后移至室外。
步骤1)中，所述胚性在愈伤组织培养三周后，将其转接到继代培养基中。
步骤4)中，所述植物生长室的生长条件为：湿度在60％-80％，温度25±1℃，光周期为光照14h/黑暗10h。
步骤1)中，在小蓬竹愈伤诱导培养基中添加的激素为：2,4-D 3.0mg/L+TDZ0.01mg/L+NAA 1.0mg/L。
步骤1)中，小蓬竹胚性愈伤培养基中使用的激素为2,4-D 5.0mg/L+TDZ 1.0mg/L。
上述培养基组分中，MS为MS培养基成分(Murashige&Skoog medium，1962，Physiol.Plant 15:473-497)，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，TDZ为噻二唑苯基脲，NAA为萘乙酸，Vc为维生素C。
有益效果：与现有技术相比，本发明的方法，获得小蓬竹的频率高，时间短，非常适宜于小蓬竹遗传改良。完成小蓬竹植株再生的时间最快仅需12周左右。为小蓬竹的快速繁殖和定向生物技术育种奠定了坚实的基础。具有一定的社会效益和经济效益。
附图说明
图1是小蓬竹的丛芽外植体图；
图2是小蓬竹丛芽诱导出的愈伤组织图；
图3是小蓬竹愈伤组织在继代增殖培养基上生长三周后的胚性愈伤组织图；
图4是小蓬竹胚性愈伤组织在分化培养基上分化一个月后长出大量芽体图；
图5是继代2次后的小蓬竹芽丛图；
图6是胚性愈伤组织分化成芽第二阶段图；
图7是胚性愈伤组织分化成芽第三阶段图；
图8是小蓬竹再生苗的生根图；
图9是移栽成功的小蓬竹再生植株图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，操作步骤如下：
1)外植体的选择：本发明的实验中选取材料为小蓬竹的无菌丛芽(图1)。
2)胚性愈伤组织的诱导与保持：选取无菌苗上萌发的再生芽，切取1.5cm的茎段(图1)。接到愈伤诱导培养基(MS+2,4-D 2.0～3.0mg/L+TDZ 0.01～0.1mg/L+NAA 0.5～1mg/L+100mg/L Vc)中，三周后愈伤组织形成(图2，图3)，将形成的愈伤组织转接到胚性愈伤培养基(MS+2,4-D 4.0～5.0mg/L+TDZ 0.5～1.0mg/L+100mg/L Vc)进行增殖培养(图4)。
3)胚性愈伤组织的分化：胚性愈伤组织培养3周后，将其转接到分化培养基(MS+TDZ 1.0～2.0mg/L+NAA 0.5～1.5mg/L)上，使胚性愈伤组织分化成芽(图5、图6、图7)。
4)再生芽的生根与移栽：将生长1个月左右的芽丛转接至生根培养基中(MS+NAA1.0～3.0mg/L+IBA 0.1-0.5mg/L)，1周后，就有不定根产生(图8)，待根生长至5～10cm时，可进行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中(湿度在60％-80％，温度(25±1℃)，光周期为光照14h/黑暗10h)，培养2周后移至室外(图9)。
本实验中所有培养基都在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件为121℃下18min。培养室温度为(25±1℃)。光周期为14h/黑暗10h。培养物表面的光照强度约为3000lx。
实施例2
1、小蓬竹愈伤组织诱导方法同实施例1，选用不同激素配比的培养基进行试验对比。具体选用生长素2,4-D、NAA和细胞分裂素TDZ作为生长调节剂进行组合诱导愈伤组织发生，实验采用三因素三水平进行正交设计，实验结果见表1。
表1正交实验的诱导率显示，不同植物生长调剂及其浓度的不同影响着愈伤组织诱导率的发生，方差分析表明，配方5,7,9与配方1,2,3,4,6,8存在显著差异。小蓬竹愈伤诱导培养基的最佳激素配比是2,4-D 2.0～3.0mg/L+TDZ 0.01～0.1mg/L+NAA 0.5～1.0mg/L。
表1 小蓬竹愈伤组织诱导率
表中数据为平均值,同一列中不同字母表示数据差异显著(P<0.05)；表2同。
2、小蓬竹胚性愈伤培养方法同实施例1，选用含不同激素配比的培养基进行试验对比。根据上一阶段所得到的，选取健康、无褐化的愈伤组织作为实验材料进行胚性愈伤培养。本实验以MS为基本培养基，使用激素2,4-D、TDZ组合对胚性愈伤组织进行增殖培养，实验采用二因素三水平正交试验，实验结果见表2。
表2正交实验结果显示，不同植物生长调剂剂及其浓度的不同影响着胚性愈伤组织的增殖，方差分析表明，配方5,7,9与配方1,2,3,4,6,8存在显著差异。小蓬竹胚性愈伤培养基的最佳激素配比是2,4-D 4.0～5.0mg/L+TDZ 0.5～1.0mg/L。
表2 胚性愈伤组织的增殖
Claims (5)
1.一种通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，其特征在于，具体步骤为：
1)将无菌的小蓬竹丛芽分段接种到愈伤诱导培养基进行愈伤诱导，愈伤组织形成后转接到继代培养基进行增殖培养，得到胚性愈伤组织；愈伤诱导培养基组成为：以MS为基本培养基，再附加2.0～3.0mg/L 2,4-D、0.01～0.1mg/L TDZ、0.5～1.0mg/LNAA、100mg/L Vc、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂；继代培养基组成为：以MS为基本培养基，再附加4.0～5.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L TDZ、100mg/L Vc、30g/L蔗糖、7g/L琼脂；
2)将胚性愈伤组织转接到分化培养基上培养，至有再生丛芽分化形成；分化培养基组成为：以MS为基本培养基，再附加1.0～2.0mg/L TDZ、0.5～1.0mg/L NAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂；
3)将已经分化出的再生芽转接到生根培养基中，进行生根培养；生根培养基组成为以MS为基本培养基，再附加1.0～3.0mg/L NAA，0.1～0.5mg/L IBA；
4)待根生长至5～10cm时，进行再生苗的移栽；再生苗移栽花盆中后置于植物生长室中生长2周后移至室外。
2.根据权利要求1所述通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，其特征在于，步骤1)中，所述胚性愈伤组织培养三周后，将其转接到继代培养基中。
3.根据权利要求1所述通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，其特征在于，步骤4)中，所述植物生长室的生长条件为：湿度在60％～80％，温度25±1℃，光周期为光照14h/黑暗10h。
4.根据权利要求1所述通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，其特征在于，步骤1)中，在小蓬竹愈伤诱导培养基中添加的激素为：2,4-D 3.0mg/L+TDZ 0.01mg/L+NAA1.0mg/L。
5.根据权利要求1所述通过体胚培养获得大量小蓬竹再生植株的方法，其特征在于，步骤1)中，小蓬竹继代培养基中使用的激素为2,4-D 5.0mg/L+TDZ 1.0mg/L。
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