KR101566469B1

KR101566469B1 - 아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법 및 이를 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법

Info

Publication number: KR101566469B1
Application number: KR1020130141281A
Authority: KR
Inventors: 이효신; 문흥규; 박소영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2015-11-05
Also published as: KR20150057655A

Abstract

본 발명은 구상나무(Korean fir, Abies koreana)의 배발생 조직(embryogenic mass)으로부터 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens strain C58/pMP90)을 매개로 한 구상나무의 형질전환 방법, 이를 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 구상나무 형질전환체를 제공한다.

Description

아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법 및 이를 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법{Agrobacterium-mediated Transformation Method of Korean fir, Abies koreana}

본 발명은 아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법 및 이를 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구상나무(Korean fir, Abies koreana)의 배발생 조직(embryogenic mass)으로부터 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens strain C58/pMP90)을 매개로 한 구상나무의 형질전환 방법, 이를 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 구상나무 형질전환체에 관한 것이다.

구상나무(Korean fir, Abies koreana)는 국내특산 침엽수로 한국의 남부지방, 특히 한라산, 지리산, 덕유산, 속리산 등에 주로 분포한다. 최근 기후변화에 의해 자생지에서 서식하던 구상나무들이 급격히 쇠퇴하고 있다는 연구가 여러 차례 보고되고 있다.

그러나 아직 이러한 쇠퇴의 원인이 명확히 밝혀지지 않았다. 일부 학자들은 토지이용 패턴의 변화 또는 자연적 수명에 의한 고사 등 여러 가설들을 제시하고 있다. 강(1989)은 한라산 구상나무는 척박하고 얕은 토양에서 생육하고 있어 계곡과 능선을 따라 부는 탁월풍과 더불어 소용돌이 바람으로 인해 구상나무의 뿌리가 상하고 수분부족이 초래되어 고사되거나, 여름의 한랭과 겨울의 건조 등 환경적 요인에 의하여 고사되고 있다고 보고하였다.

한편, 고 등(1996)은 한라산 구상나무림의 식생구조와 생육 및 치수발생을 조사한 결과, 생육상태는 Y 계곡상류, 삼각봉 일대, 방아오름 일대가 양호하였다. 그러나 왕관릉 동쪽 일대, 영실 일대 및 백록담 내에서 수고생장이 저조하고, 치수발생은 주로 임연부에 발생한다고 하였다. 일부 학자들은 연륜연대학적 분석을 통해 이 부분을 해석하려 하였는데, 김 등(1994)은 1959, 1964, 1967, 1970, 1978, 1986, 1988년도에 생장이 저조하였고, 최근 들어 생장이 매우 둔화되었다고 하였다.

원인구명을 위해 기상, 토양, 대기오염 등과의 관계 분석을 하였으나, 이러한 쇠퇴의 원인을 명확히 설명하지 못하고, 자연적인 교란과 인위적인 교란이 복합적으로 작용하였을 것이라 추정하였다.

구 등(2001)은 한라산 구상나무의 연륜생장분석 결과 1982년, 1988년, 1996년도의 생장이 가장 저조하였는데, 이는 당년 4월과 전년 11월의 기온과 관계가 깊을 뿐 아니라 강수량과 정의 상관관계를 보여 수분 스트레스에 민감하다고 하였다. 또한, 겨울 기온이 상승하면 생장이 감소하는 경향이 있음을 밝혔다. 아울러 동해(frost damage)로 추정되는 상흔이 1964, 1965, 1966년도에 공통적으로 나타나 국지적인 저온 현상에 의한 것으로 추정하였으나 당시 기상자료의 부재로 확인을 하지는 못하였다.

한편, 체세포배 발생은 임목류의 재분화에 있어 매우 유용한 시스템이다(Gupta와 Conger 1999). 체세포배 배양 시스템은 식물 재분화와 분자육종, 그리고 생식질 보존을 위한 초저온 저장 등에 있어 필수적인 수단이다(Park 등, 2000; Find 등, 2005). 그러나 임목류 중에서 특히 침엽수는 재분화가 매우 어려운 것으로 알려져 있다.

침엽수의 체세포배 유도 기술을 실제로 활용하기 위해서는 먼저 해결해야 할 전제조건이 있다. 그것은 육종목표가 되는 침엽수의 종자로부터 배발생 조직을 유도하는 것이다. 현재 침엽수의 경우에는 삽목이나 조직배양의 기관유도 등을 이용한 클론 증식은 거의 불가능하다. 따라서 그 대안으로 체세포배 복제법을 통한 클론 증식 기술 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

종자, 특히 미숙종자로부터 성공적으로 배발생 조직을 유도하기 위해서는 재료(미숙종자)의 채취 시기, 접합자배의 발달단계, 영양배지, 식물호르몬 조합, 그리고 고형배지 제조 시 첨가하는 기타 배지 내 첨가물과 같은 여러 가지 요인이 중요하다. 이러한 요인들 중에서 미숙종자 내의 접합자배의 발달 정도가 가장 중요하다. 그 이유는 침엽수의 접합자배는 그 발달과정에서 일정 시기가 지나면 분열능력을 상실하기 때문이다.

따라서, 분열능력을 상실하기 전의 미숙 구과를 채취해서 배양해야만 성공적으로 배발생 조직을 얻을 수 있다. 성공적일 경우, 접합자배의 끝부분에 있는 배병(suspensor)이 배지에 첨가된 식물호르몬의 영향으로 세포분열을 거듭한 후 마침내 주공(micropyle)을 통해 밖으로 분출된다. 따라서 성공적인 배발생 조직 유도를 이루기 위해서는 종자채취 시기에 따른 접합자배의 발달 정도 및 배발생 조직의 유도율과의 관계를 구명할 필요가 있다.

젓나무속(Abies)에 속하는 침엽수의 체세포배 발생은 Abies alba , A. fraseri, A. balsamea , A. cephalonica 등의 여러 종에서 보고되었다(Hristoforoglu 등, 1995; Schuller 등, 2000; Guevin과 Kirby, 1998; Guevin 등, 1995; Krajnakova 등, 2009). 최근 성공적인 체세포배 배양이 뉴질랜드의 nordmann fir에서 보고된바 있는데, Find 등(2005)은 체세포배 발생 조직이 유전자 도입을 위한 형질전환 즉, 분자육종에 있어 가장 적합한 재료라고 하였다.

따라서, 경제적 및 생태적으로 매우 중요한 위치를 차지하고 있는 구상나무의 육종과 보존을 위해서는 체세포배 발생기술의 개발과 이를 바탕으로 한 유전자 형질전환 방법의 확보가 매우 절실히 요구되고 있는 실정이다. 여기에서는 구상나무의 미숙/성숙종자로부터 체세포배 발생조직을 유도한 다음, 아그로박테리움을 매개로 한 유전자 형질전환 방법을 확립하고자 하였다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 수행하여, 구상나무의 미숙/성숙종자로부터 체세포배 발생조직을 유도한 다음, 아그로박테리움을 매개로 하여 유전자의 형질전환이 가능함을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구상나무(Korean fir, Abies koreana)의 배발생 조직(embryogenic mass)으로부터 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 매개로 한 구상나무의 형질전환 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 방법을 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체의 생산방법에 의해 생산된 구상나무 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, (a) 구상나무의 성숙종자로부터 배발생 조직을 유도하는 단계, (b) 상기 유도된 배발생 조직을 증식하는 단계, 및(c) 상기 증식된 배발생 조직과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양(co-culture)하여 상기 배발생 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는, 아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 형질전환된 배발생 조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 및 상기 유도된 체세포배를 성숙시키는 단계를 포함하는 구상나무 형질전환체의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 생산방법에 의해 생산된 구상나무 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 의하면, 국내 특산 침엽수인 구상나무의 육종과 보존전략 마련을 위한 유전자 형질전환 방법을 제공함으로써, 구상나무의 보존에 기여하고, 구상나무의 형질전환체를 생산함에 있어서, 생산성을 높일 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법은 침엽수의 분자육종을 위한 형질전환시에도 적용될 수 있다.

도 1은 구상나무의 형질전환에 사용한 바이너리 벡터(binary vector)인 pBIV10의 모식도이다.
도 2는 구상나무의 배발생 조직을 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens strain C58/pMP90)으로 감염시킨 다음, 50 ㎍/㎖의 kanamycin이 첨가된 수정 LV(mLV) 배지에서 형질전환된 배발생 조직을 선발한 결과이다.
도 3은 형질전환 여부를 확인하기 위하여 게놈 DNA(genomic DNA)로부터 PCR 분석을 실시한 결과이다. 가나마이신으로 선발된 배발생 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 다음 nptⅡ 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭반응을 실시하였다.
도 4는 가나마이신이 첨가된 선발 배지에서 배발생 조직의 생존율을 나타낸 것이다.
도 5는 도입된 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여 quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)을 실시한 결과이다.
도 6은 선발된 배발생 조직의 GUS 활성염색 결과와 배발생 조직으로부터 유도된 체세포배를 보여주는 결과이다.

본 발명은 (a) 구상나무의 성숙종자로부터 배발생 조직을 유도하는 단계, (b) 상기 유도된 배발생 조직을 증식하는 단계, 및(c) 상기 증식된 배발생 조직과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양(co-culture)하여 상기 배발생 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는, 아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법에 관한 것이다.

구상나무를 비롯한 국내자생 침엽수의 체세포 재분화 체계는 전 세계적으로 매우 어렵고, 국내에서도 확립되어 있지 않다. 따라서 본 발명에서는 유일한 재분화 수단임과 동시에 형질전환 효율이 높은 것으로 알려진 배발생 조직을 이용하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 배발생 조직의 유도는 2.0 mg/L의 티디아주론(thidiazuron; TDZ), 100 mg/L의 미오-이노시톨(myo-inositol), 0.5 g/L의 L-글루타민(L-glutamine), 1 g/L의 카제인 가수분해물(casein hydrolyzate), 3%(w/v) 슈크로즈 및 0.3%(w/v)의 젤라이트(gelrite)가 첨가된 SH(Schenk와 Hildebrant, 1972) 배지에서 수행할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 배발생 조직의 증식은 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등, 1985) 배지에서 수행할 수 있고, 일정 주기, 예컨대 매 2주 간격으로 계대배양하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 배발생 조직의 증식은 24±1℃의 암조건에서 수행할 수 있다.

본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 배발생 조직의 유도 및 증식을 위해 여과지(filter paper)를 이용할 수 있는데, 배발생 조직은 작고 미세한 조직으로, 아그로박테리움과 공동배양 후 일일이 새 배지에 옮기기에 많은 시간이 소요됨과 동시에 조작과정 중 배발생 조직이 죽거나 상처를 입을 수 있다. 따라서 여과지를 이용해 동시에 다량의 배발생 조직을 옮겨 줌으로써, 아그로박테리움의 형질전환 효율을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 공동배양은 상기 아그로박테리움 튜메파시엔스와 상기 증식된 배발생 조직을 50 ㎍/㎖의 리팜피신, 50 ㎍/㎖의 가나마이신 설페이트 및 20 ㎍/㎖의 겐타마이신 설페이트가 포함되어 있는 LB 액체배지에서 진탕배양할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 형질전환은 공동배양하여 수득한 아그로박테리움 튜메파시엔스 및 배발생 조직의 혼합용액을 여과지에 균일하게 도포한 후, 상기 여과지를 항생제를 첨가하지 않고 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등, 1985) 배지에서 배양하여 형질전환을 유도할 수 있다.

본 발명에 의한 구상나무의 형질전환 방법에서, 상기 아그로박테리움 튜메파시엔스는 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58/pMP90 (Agrobacterium tumefaciens C58/pMP90)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형질전환시키는 일반적인 방법으로는 유전자총(biolistics)을 이용하거나 유전자를 도입한 아그로박테리움을 이용하는 방법이 있는데, 본 발명에서는 아그로박테리움 C58/pMP90과 함께 임목류(포플러) 형질전환에 많이 이용되는 아그로박테리움 LB4404를 테스트한 결과, 무처리와 LB4404에서는 형질전환체를 얻지 못한 반면에, 아그로박테리움 C58/pMP90에서는 35%의 형질전환율을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 구상나무의 형질전환 방법에 의해 형질전환된 배발생 조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 및 상기 유도된 체세포배를 성숙시키는 단계를 포함하는 구상나무 형질전환체의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 구상나무 형질전환체의 생산방법에서, 상기 체세포배의 유도는 상기 형질전환된 배발생 조직을 60μM의 앱시스산(abscisic acid), 20 g/L의 슈크로즈 및 0.3%(w/v)의 화이타겔(phytagel)이 첨가되고, 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등) 배지에서 수행할 수 있다.

본 발명에 의한 구상나무 형질전환체의 생산방법에서, 상기 체세포배의 성숙은 상기 유도된 체세포배를 60μM의 앱시스산(abscisic acid), 20 g/L의 슈크로즈 및 0.3%(w/v)의 화이타겔(phytagel)이 첨가되고, 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등) 배지에서, 24±1℃의 온조 조건으로 8주 동안 배양하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 구상나무 형질전환체의 생산방법에 의해 생산된 구상나무 형질전환체에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 실시 재료 및 방법

(1) 식물 재료, 배양 조건 및 처리

한라산에서 채취한 구상나무의 성숙종자로부터 2.0 mg/L thidiazuron(TDZ), 100 mg/L myo-inositol, 0.5 g/L L-glutamine, 1 g/L casein hydrolyzate, 3%(w/v) sucrose, 그리고 0.3%(w/v) gelrite가 첨가된 SH(Schenk와 Hildebrant, 1972) 배지에서 배발생 조직을 유도하였다.

증식을 위한 배발생 조직 유도배지로는 무기염류를 반으로 줄인 수정 LV(mLV; Litvay 등,1985) 배지를 이용하였고, 매 2주 간격으로 계대배양하였다. 상기 배지는 고압증기멸균 전에 pH 5.8로 조정하였고, 배양은 24±1℃의 암조건에서 실시하였다.

이때, 상기 수정 LV(mLV; Litvay 등,1985) 배지는 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 배지를 사용하였다.

(2) 형질전환

형질전환을 위해 바이너리 벡터인 pBIV를 가지고 있는 아그로박테리움 C58/pMP90(Koncz와 Shell, 1986)을 사용하였다.

아그로박테리움은 50 ㎍/㎖ 리팜피신, 50 ㎍/㎖ 가나마이신 설페이트 및 20 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트가 포함된 LB 액체배지에 접종하여 28℃에서 250 rpm으로 16시간 배양하였다.

원심분리하여 균체를 모은 다음 흡광도(OD₆₀₀)가 0.6이 되도록 100 μM의 아세토시린곤(acetosyringone)이 첨가된 1/2 LV 액체배지(mLV; Litvay 등, 1985)로 희석하였다.

공동배양을 위해 Falcon tube(50 ml)에 희석한 아그로박테리움 현탁액 30 ml를 넣고, 약 1.5g의 배발생 조직(EM)을 넣어 최종 밀도가 50 mg/ml이 되게 한 다음, 30분간 80 rpm의 진탕배양기에서 공동배양하였다.

공동배양이 완료된 후, 끝이 잘린 피펫을 이용해 3 ml의 혼합용액(아그로박테리움+배발생 조직)을 여과지(filter paper)에 고르게 도포하고, 여과지에 남은 여액은 진공펌프를 이용해 흡착하여 제거하였다. 이때 대조구로는 배발생 조직에 아그로박테리움을 제외한 나머지를 동일한 방법으로 처리하였다.

이후 배발생 조직이 있는 여과지를 항생제를 첨가하지 않은 mLV 배지에 배양하여 형질전환을 유도하고, 3일 후 50 ㎍/㎖의 kanamycin이 첨가된 증식배지로 옮겼다. 배발생 조직이 도포된 여과지는 매주 옮겨 주었고, 배양 3주 후에 항생제 배지에서 살아 남은 형질전환체를 50 ㎍/㎖의 가나마이신이 첨가된 새 증식배지에 옮겨주었다.

다시 3주 후에 가나마이신으로 선발된 배발생 조직을 새 배지로 옮겼다. 세 번의 선발 후에 일부를 취해 형질전환 여부의 확인을 위한 GUS 염색에 사용하였다.

(3) 형질전환 배발생 조직으로부터 체세포배의 유도 및 성숙

형질전환된 배발생 조직(EM)으로부터 체세포배를 유도, 성숙시키기 위해 50 ㎍/㎖ 가나마이신으로 선발된 배발생 조직을 60μM의 앱시스산(ABA), 20 g/L의 슈크로즈및0.3%(w/v)의 화이타겔(Phytagel)이 첨가된 mLV 배지로 옮겼다.

이때 ABA는 배지를 멸균한 후에 첨가하였고, 배양은 24±1℃에서 8주간 실시하였다.

(4) GUS 조직화학염색(histochemical assay)

GUS 염색을 위해 배발생 조직과 체세포배를 GUS 반응용액(20 mM Na₂HPO₄+NaH₂PO₄, pH 7.0, 10 mM K₃[Fe(CN)₆], 10 mM K₄[Fe(CN)₆×3H₂O], 10 M Na₂EDTA, 0.1% TritonX-100, 1.5 mM X-Glucuronide)에 넣고 37℃에서 24시간 반응시켰다. 이때, GUS 활성의 관찰은 광학현미경에서 40배율로 조사하였다.

(5) 게놈 DNA(Genomic DNA)의 분리와 PCR 증폭 반응

형질전환 여부의 확인을 위한 PCR 분석을 위해 배발생 조직으로부터 Qiagen genomic-tips(Valencia, CA, USA)를 사용하여 genomic DNA를 분리하였다.

PCR 반응에는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(NPT II) 유전자의 증폭을 위한 2조합의 PCR 프라이머를 사용하였다. NPT II의 증폭을 위한 정방향 프라이머는 5´-acgggaaaacgacatgatgc-3´(서열번호 1), 그리고 역방향 프라이머는 5´-cggacgcagaaggcaatgt-3´(서열번호 2)를 사용하였다.

PCR 증폭 반응액에는 100 ng의 genomic DNA, 1× PCR buffer, 2.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.2 μM 프라니어 그리고 1 ㎕ Taq DNA polymerase(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)를 첨가하고, 멸균수를 사용하여 최종 볼륨을 50 ㎕로 조정하였다.

증폭 반응은 94℃에서 게놈 DNA를 5분간 변성시킨 다음, 94℃ 1분, 56℃ 1 분 및 72℃ 1분의 반응을 30 반복 실시하고, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 증폭산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하였다.

(6) RNA의 분리와 qRT-PCR 증폭

총 RNA는 TRI reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 사용하여 분리하였다. RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 다음, Grant 등(2004)의 방법으로 quantitative real-time RT-PCR을 실시하였다.

qRT-PCR 실험에는 SYBR Premix ExTaq(Takara, Japan)과 Mx3000PQPCR System(Stratagene, USA)을 사용하였다.

증폭 반응은 95℃에서 2분간 cDNA를 변성시킨 다음, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초의 반응을 25반복 실시하고, 최종적으로 72℃에서 30초간 반응시켰다.

GUS 유전자의 증폭을 위한 정방향 프라이머는 5´-ctgggcagatgaacatggc-3´(서열번호 3), 그리고 역방향 프라이머는 5´-tcgccgctttggacatacc-3´(서열번호 4)를 사용하였다.

발현수준의 비교분석을 위한 대조구로는 UBC28 유전자를 이용하였다. UBC28의 증폭을 위한 정방향 프라이머는 5´-TCCAGAAGGATCCTCCAACTTCCTGCAGT-3´(서열번호 5), 그리고 역방향 프라이머는 5´-ATGGTTACGAGAAAGACACCGCCTGAATA-3´(서열번호 6)를 합성하여 사용하였다.

2. 결과

상기 1. 실험재료 및 방법에서의 결과를 도 1 내지 도 6에 나타내었다.

도 1은 구상나무의 형질전환에 사용한 바이너리 벡터인 pBIV10의 모식도이다. 선발표지로서 nos 프로모터의 하위에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(nptⅡ) 유전자를 가지고 있다. 또한, 도입된 유전자의 발현분석을 위해 35S 프로모터의 하위에 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase; GUS) 유전자를 가지고 있다.

도 2는 구상나무의 배발생 조직을 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens strain C58/pMP90)으로 감염시킨 다음, 50 ㎍/㎖의 가나마이신이 첨가된 mLV 배지에서 형질전환된 배발생 조직을 선발한 결과이다.

도 2a의 아그로박테리움을 감염시키지 않은 배발생 조직은 가나마이신이 첨가된 수정 LV(mLV) 배지에서 더 이상 생장하지 못하고 고사하였다. 그러나 도 2b의 아그로박테리움을 감염시킨 배발생 조직은 동일한 배지에서 활발하게 분열하여 증식하였는데, 총 12주의 배양을 통해 48계통을 선발하였다.

도 3은 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 게놈 DNA로부터 PCR 분석을 실시한 결과이다. 가나마이신으로 선발된 배발생 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 다음 nptⅡ 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭반응을 실시하였다.

그 결과, 아그로박테리움을 감염시키지 않은 배발생 조직(C)에서는 nptⅡ 유전자의 PCR 증폭산물이 관찰되지 않았으나, 아그로박테리움을 감염시킨 모든 배발생 조직(1-10)에서는 nptⅡ 유전자의 PCR 증폭산물이 관찰되었다.

도 4는 가나마이신이 첨가된 선발 배지에서 배발생 조직의 생존율을 나타낸 것이다. 아그로박테리움을 감염시키지 않은 배발생 조직(control)은 배양 3주 후부터 생존율이 급격히 하락하여 배양 12주 후에는 모두 고사하였다.

그러나, 아그로박테리움을 감염시킨 배발생 조직(C58/pMP90/pBIV10)은 배양 12주 후에도 약 40%가 생존하였다. 최종적으로 가나마이신이 첨가된 배지에서 선발된 계통은 48개였고, 이들은 모두 정상적으로 형질전환되었음을 게놈 PCR(도 3)과 qRT-PCR(도 5)로 확인하였다.

도 5는 도입된 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여 quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)을 실시한 결과를 나타낸 것이다. GUS 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 실시한 결과, 선발된 48계통 모두에서 GUS 유전자가 발현됨을 확인하였다.

도 6은 선발된 배발생 조직의 GUS 염색 결과(도 6a)와 배발생 조직으로부터 유도된 체세포배(도 6b)를 보여주는 결과이다. 체세포배의 조직화학 염색(histochemical staining) 결과, GUS 활성이 모든 48계통의 체세포배 유래의 자엽, 하배축 그리고 유근에서 관찰되었다.

본 발명은 구상나무의 형질전환에 있어 배발생 조직이 매우 뛰어난 형질전환 재료임을 나타낸 것으로, 아그로박테리움을 매개로한 국산 침엽수종의 형질전환에 있어 최초의 보고이다. 따라서 본 발명은 국산 침엽수종의 육종 및 보존전략 마련에 있어 중요하게 활용될 것으로 기대된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법 및 이를 이용한 구상나무 형질전환체의 생산방법은 구상나무를 포함한 침엽수종의 분자육종 및 보존전략 마련을 위한 기본적인 수단을 제공할 수 있는 효과를 지니고 있어, 식물 관련 산업의 발전에 기여할 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 있다.

<110> Korea Forest Research Institute(KFRI) <120> Agrobacterium-mediated Transformation Method of Korean fir, Abies koreana <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 acgggaaaac gacatgatgc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 cggacgcaga aggcaatgt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ctgggcagat gaacatggc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 tcgccgcttt ggacatacc 19 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 tccagaagga tcctccaact tcctgcagt 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 atggttacga gaaagacacc gcctgaata 29

Claims

(a). 구상나무의 성숙종자로부터 배발생 조직을 유도하는 단계;
(b). 상기 유도된 배발생 조직을 증식하는 단계; 및
(c). 상기 증식된 배발생 조직과 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 공동배양(co-culture)하여 상기 배발생 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는, 아그로박테리움을 이용한 구상나무의 형질전환 방법에 있어서,
상기 배발생 조직의 유도는 2.0 mg/L의 티디아주론(thidiazuron), 100 mg/L의 미오-이노시톨(myo-inositol), 0.5 g/L의 L-글루타민(L-glutamine), 1 g/L의 카제인 가수분해물(casein hydrolyzate), 3%(w/v) 슈크로즈 및 0.3%(w/v)의 젤라이트(gelrite)가 첨가된 SH(Schenk와 Hildebrant) 배지에서 수행하고,
상기 배발생 조직의 증식은 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등) 배지에서, 24± 1℃의 암조건에서 수행하며,
상기 공동배양은 상기 아그로박테리움 튜메파시엔스와 상기 증식된 배발생 조직을 50 ㎍/㎖의 리팜피신, 50 ㎍/㎖의 가나마이신 설페이트 및 20 ㎍/㎖의 겐타마이신 설페이트가 포함되어 있는 LB 액체배지에서 진탕배양하고,
상기 형질전환은 공동배양하여 수득한 아그로박테리움 튜메파시엔스 및 배발생 조직의 혼합용액을 여과지에 균일하게 도포한 후, 상기 여과지를 항생제를 첨가하지 않고 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등) 배지에서 배양하여 형질전환을 유도하는 것을 특징으로 하는 구상나무의 형질전환 방법.
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제1항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜메파시엔스는 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58/pMP90 (Agrobacterium tumefaciens C58/pMP90)인 것을 특징으로 하는 구상나무의 형질전환 방법.
제1항의 방법에 의해 형질전환된 배발생 조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계; 및
상기 유도된 체세포배를 성숙시키는 단계를 포함하는 구상나무 형질전환체의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 체세포배의 유도는 상기 형질전환된 배발생 조직을 60μM의 앱시스산(abscisic acid), 20 g/L의 슈크로즈 및 0.3%(w/v)의 화이타겔(phytagel)이 첨가되고, 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등) 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 구상나무 형질전환체의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 체세포배의 성숙은 상기 유도된 체세포배를 60μM의 앱시스산(abscisic acid), 20 g/L의 슈크로즈 및 0.3%(w/v)의 화이타겔(phytagel)이 첨가되고, 170 mg/L의 KH₂PO₄, 800 mg/L의 KNO₃, 451.5 mg/L의 MgSO₄ 및 825 mg/L의 NH₄NO₃를 첨가하여 대량 무기염류를 1/2로 줄인 수정 LV(Litvay 등) 배지에서, 24±1℃의 온도 조건으로 8주 동안 배양하여 수행하는 것을 특징으로 하는 구상나무 형질전환체의 생산방법.
제8항의 방법에 의해 생산된 구상나무 형질전환체.