CN110295191B - 一种二倍体毛白杨的遗传转化方法 - Google Patents

一种二倍体毛白杨的遗传转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，首先采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，清洗消毒后依次进行增殖继代培养、芽伸长培养和生根培养，得到毛白杨无菌苗，挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，制备菌液作为侵染液；将毛白杨无菌苗的叶片切成叶盘，培养7d后转入侵染液中进行侵染，侵染后的叶盘先黑暗培养后光照恢复培养，最后进行抗性芽的筛选，得到候选植株，对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将均为阳性的植株进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株。本发明方法具有转化效率高、培育周期短、可大规模投入生产等优点，二倍体毛白杨的遗传转化体系可为规模化培育新品种、定向改造优良性状提供帮助。

Description

一种二倍体毛白杨的遗传转化方法
技术领域
本发明涉及一种毛白杨的遗传转化方法，尤其是一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
杨树(Populus)作为杨属杨柳科中一类植物的总称，在中国大部分地区都有分布，杨属植物在我国有几十个种，其具有生长指标好，树形高大优美，对不良环境适应性强等特点。杨属植物天然种质资源极为丰富，是全球温带气候中种植量最大的树种之一。毛白杨(Populus tomentosa)作为中国的乡土杨树品种，具有生长速度快，环境适应性强等特点，我国的毛白杨数量庞大，遍布于我国黄淮海流域100多万平方公里的10多个省、市、自治区。毛白杨生长迅速，适应性强，纤维较长，材质优良、树干高大通直，树形美观，是民用、建筑、家具用材和纤维工业的重要原料，也是杨属中最适于作为纸浆材原料的优良树种之一。但是由于生长周期长、树体高大，异花授粉和杂交不亲和性等原因，极大地限制了杨树传统育种工作的开展。植物基因工程的兴起，为毛白杨遗传改良提供了新的途径。通过植物遗传转化将外源基因引入到植物细胞并使其稳定地遗传和表达，从而获得新的生物学性状，开辟了毛白杨育种的新途径。
Parson等(1986)最早对利用根癌农杆菌对杨树进行了遗传转化并证明了外源基因可以在杨属植物中表达。Fillattid等(1987)将抗除草剂基因aroA转入了银白杨与大齿杨杂交的一种无性系中，从此开始了现代杨树转基因技术的研究。毛白杨不易通过传统育种的方法提高植物对于恶劣环境的抗逆性，而基因编辑技术可以针对性的提高毛白杨的抗逆性。现如今，常见的转基因技术都已运用于杨树的遗传转化研究中。郝贵霞等(1999)在获得再生体系的基础上，利用雌性毛白杨回交植株作为材料，成功转入了豆类蛋白酶抑制剂基因。等等。
与其它杨属植物不同的是，毛白杨在自然条件下存在大量的野生三倍体与二倍体混植，由于三倍体毛白杨较二倍体毛白杨在树形上较为高大，作为我国部分地区的行道树与观赏树种，分布广泛，所以目前对毛白杨的遗传转化体系多为针对三倍体毛白杨的，并且其再生植株生根发育困难，难以形成完整植株，而且通常采用的是传统的根癌农杆菌介导法，获得转基因植株的效率一般不足50％且多为假阳性。
目前，对二倍体毛白杨遗传转化方面的相关研究很少。二倍体毛白杨作为我国乡土树种，仍存在生长速度慢等问题。本发明人在国内外现有研究基础上，探索目前缺失的雄性二倍体毛白杨再生转化体系，通过分析影响再遗传转化系的因素，筛选出各影响因素的优化组合，旨在提供一种雄性二倍体毛白杨的再生体系，以提高杨树的生长速度，为雄性二倍体毛白杨后续遗传研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，该方法具有转化效率高、培育周期短、可大规模投入生产等优点。
技术方案
一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，包括如下步骤：
(1)毛白杨无菌苗的获得：
采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，流水下冲洗1-2h后，进行消毒处理，无菌水清洗后，接入1/2MS培养基进行培养，培养30d后得到毛白杨无菌苗新鲜叶片，采集幼嫩叶片放入增殖继代培养基中进行培养，35d后获得大量毛白杨不定芽；剪取不定芽接种于芽伸长培养基，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，45d后顶芽形成完整根系，得到毛白杨无菌苗；
增殖继代培养基配方：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/L TDZ，pH5.8；
注：6-BA，6-苄基腺嘌呤，一种细胞分裂素；NAA，萘乙酸，一种植物生长素；TDZ(噻苯隆，一种细胞分裂素。
(2)根癌农杆菌侵染转化：
挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，制备OD600为0.3-0.5的菌液作为侵染液；选取生长45-60d的毛白杨无菌苗，切去第三至第五位叶片的维管束组织，并将叶片切成1cm×1cm叶盘，接种于愈伤分化培养基上，培养7d后，将叶盘转入侵染液中进行震荡侵染，侵染10-30min后，取出叶盘，用无菌纸吸干叶盘表面多余菌液，将叶盘转入共培养基中，在黑暗条件下培养8-32h，洗菌后转入恢复培养基中在1800-2000lux的光照条件下恢复培养7d；
恢复培养基配方：1/2MS培养基，pH＝5.8；
(3)抗性芽的筛选
将恢复培养后的叶盘转入分化筛选培养基进行培养，当叶盘边缘长出1-1.6cm不定芽时，将其转到芽伸长培养基上进行培养，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，培养至长出根系，得到候选植株；
(4)抗性植株的检测
对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将GUS染色和PCR检测均为阳性的植株，进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株。
进一步，步骤(1)中，所述消毒处理方法：先用70％酒精消毒30s，然后用10％次氯酸钠消毒5min。该方案下，外植体的污染数最少，褐化率与死亡率相对较低。
进一步，步骤(1)和(3)中，所述芽伸长培养基配方为：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，pH5.8。
进一步，步骤(1)和(3)中，所述生根培养基的配方：1/2MS+0.3mg/L NAA+0.5mg/LIBA，pH5.8。注：IBA，吲哚丁酸，一种植物生长素。
步骤(2)中，携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌的制备方法：从-80℃冰箱中取出EHA105农杆菌感受态细胞，放置于冰中融化。每100μL感受态加1μg质粒混匀，在冰中放置10min，然后用液氮冷冻5min，后转移至37℃培养箱中放置5min，最后冰浴5min。加入500μLLB液体培养基，放置于28℃摇床200rpm震荡一个小时；12000rpm离心1min，留取100μL左右上清液；均匀涂布含有抗生素的LB平板上依据农杆菌生长速度倒置放于28℃培养箱培养2-3d，即得。
进一步，步骤(2)中，菌液浓度为OD600＝0.4，侵染时间为20min。
进一步，步骤(2)中，所述愈伤分化培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+0.005mg/L TDZ+400mg/L Tim，pH5.8。注：Tim，特美汀(新型革兰氏阴性菌抗生素)。
进一步，步骤(2)中，所述共培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/LTDZ，使用前加入200μmol/LAS。注：AS，乙酰丁香酮，一种植物转化促进剂。
进一步，步骤(3)中，所述分化筛选培养基的配方为：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+50mg/L KAN，pH5.8。注：KAN，硫酸卡那霉素，一种抗生素。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，该方法具有转化效率高(高达35％)、培育周期短、可大规模投入生产等优点，并且遗传转化体系稳定。
本发明首先采用低浓度次氯酸钠代替升汞作为消毒剂，对植物以及外界环境造成污染较小，消毒剂能够自然降解；本发明在生根培养中混合使用IBA与NAA，能够提高毛白杨生根率的同时，使根系更加粗壮，侧根数量大幅提升，有利于植株快速生长；本发明方法中，雄性毛白杨无菌苗从外植体到完全形成再生植株时间控制在90d以内，减短了这类毛白杨的培育时间。在此遗传转化体系下，可对毛白杨后续的分子研究提供理论基础。毛白杨作为我国本土树种，二倍体毛白杨的遗传转化体系可为规模化培育新品种、定向改造优良性状提供帮助。
附图说明
图1为pBI121载体质粒的物理图谱；
图2为PCR检测结果的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，涉及到的培养基配方如下：
增殖继代培养基：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/L TDZ，pH5.8；
芽伸长培养基配方为：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，pH5.8；
生根培养基的配方：1/2MS+0.3mg/L NAA+0.5mg/L IBA，pH5.8；
共培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/L TDZ，使用前加入200μmol/LAS；注：AS，乙酰丁香酮，一种植物转化促进剂。
恢复培养基：1/2MS培养基，pH＝5.8；
愈伤分化培养基：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/L TDZ+400mg/LTim,pH5.8；
分化筛选培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+50mg/L KAN，pH5.8；注：KAN，硫酸卡那霉素，一种抗生素。
培养环境：组织培养生长室内温度25℃，湿度30-60％，光照培养的光照强度1800-2000lux。
实施例1
一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，包括如下步骤：
(1)毛白杨无菌苗的获得：
采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，流水下冲洗1-2h后，进行消毒处理，无菌水清洗后，接入1/2MS培养基进行培养，培养30d后得到毛白杨无菌苗新鲜叶片，采集幼嫩叶片放入增殖继代培养基中进行培养，35d后获得大量毛白杨不定芽；剪取不定芽接种于芽伸长培养基，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，45d后顶芽形成完整根系，得到毛白杨无菌苗；
(2)农杆菌侵染转化：
携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌的制备方法：从-80℃冰箱中取出EHA105农杆菌感受态细胞，放置于冰中融化。每100μL感受态加1μg pBI121载体质粒(pBI121载体质粒的物理图谱见图1)混匀，在冰中放置10min，然后用液氮冷冻5min，后转移至37℃培养箱中放置5min，最后冰浴5min，加入500μL LB液体培养基，放置于28℃摇床200rpm震荡一个小时；12000rpm离心1min，留取100μL左右上清液；均匀涂布含有抗生素的LB平板上依据农杆菌生长速度倒置放于28℃培养箱培养2-3d，即得携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌。
挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，将菌体用1/2MS培养基重悬至OD600为0.4，得到的菌液作为侵染液；选取生长45-60d的毛白杨无菌苗，切去第三至第五位叶片的维管束组织，并将叶片切成1cm×1cm叶盘，接种于愈伤分化培养基上，培养7d后，将叶盘转入侵染液中进行震荡侵染，侵染20min后，取出叶盘，用无菌纸吸干叶盘表面多余菌液，将叶盘转入共培养基中，在黑暗条件下培养24h，洗菌后转入不含抗生素的恢复培养基中在1800-2000lux的光照条件下恢复培养7d；
(3)抗性芽的筛选
将恢复培养后的叶盘转入含抗生素的筛选培养基平板上，进行筛选培养，筛选出的叶盘用无菌水漂洗后转入分化筛选培养基进行培养，当叶盘边缘长出1-1.6cm不定芽时，将其转到芽伸长培养基上进行培养，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，培养至长出根系，得到候选植株；
(4)对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将GUS染色和PCR检测均为阳性的植株，进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株。
一、本实施例共获得17株候选植株，编号为mby1-mby17，未经转化的对照毛白杨记作CK；将候选植株和对照毛白杨进行GUS染色检测和PCR检测：
A.GUS染色方法：①分别将毛白杨候选植株和对照毛白杨的叶片放入GUS染液中，于28℃培养箱中放置过夜，②将材料转入70％酒精中脱色，也可放置于28℃200rpm恒温摇床中加速脱色；③重复步骤②直至酒精变为无色；④观察候选植株和对照毛白杨染色情况
检测发现：只有mby5与mby12显示蓝色。
B.PCR检测：用CATB法提取候选植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增所用正向引物为KanF:5′-CCCCTCGGTATCCAATT-3′，反向引物为KanR:5′-CCAGAGTCCCGTCAGAAGA-3′；
PCR扩增反应体系为：基因组DNA 1μL；ddH2O 5.9μL；10×PCR Buffer 1μL；2mMdNTPs 1μL；正向引物0.5μL；反向引物0.5μL；Taq DNA聚合酶0.1μL；
PCR反应程序：预变性94℃10min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，35个循环，72℃再延伸5min。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，其中，CK+为阳性对照，CK-为阴性对照，泳道1-17分别为mby1-mby17。由图2可以看出，载体质粒的阳性对照、泳道5与泳道12均出现明亮条带，且条带大小相近，与目的基因片段大小一致，说明mby5与mby12为阳性植株，且均已经成功转化。

Claims (3)

1.一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）毛白杨无菌苗的获得：
采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，流水下冲洗1-2 h后，进行消毒处理，无菌水清洗后，接入1/2MS培养基进行培养，培养30 d后得到毛白杨无菌苗新鲜叶片，采集幼嫩叶片放入增殖继代培养基中进行培养，35 d后获得大量毛白杨不定芽；剪取不定芽接种于芽伸长培养基，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2 cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，45 d后顶芽形成完整根系，得到毛白杨无菌苗；
增殖继代培养基配方：1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.005 mg/L TDZ，pH5.8；
（2）根癌农杆菌侵染转化：
挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，制备OD600为0.3-0.5的菌液作为侵染液；选取生长45 d-60 d的毛白杨无菌苗，切去第三至第五位叶片的维管束组织，并将叶片切成1 cm×1 cm叶盘，接种于愈伤分化培养基上，培养7 d后，将叶盘转入侵染液中进行震荡侵染，侵染10-30 min后，取出叶盘，用无菌纸吸干叶盘表面多余菌液，将叶盘转入共培养基中，在黑暗条件下培养8-32 h，洗菌后转入恢复培养基中在1800-2000 lux的光照条件下恢复培养7d；
恢复培养基配方：1/2MS培养基，pH=5.8；
（3）抗性芽的筛选
将恢复培养后的叶盘转入含抗生素的筛选培养基平板上，进行筛选培养，筛选出的叶盘用无菌水漂洗后转入分化筛选培养基进行培养，当叶盘边缘长出1-1.6 cm不定芽时，将其转到芽伸长培养基上进行培养，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2 cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，培养至长出根系，得到候选植株；
（4）对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将GUS染色和PCR检测均为阳性的植株，进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株；
步骤（1）和（3）中，所述芽伸长培养基配方为：1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，pH5.8；
步骤（1）和（3）中，所述生根培养基的配方：1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，pH5.8；
步骤（2）中，所述愈伤分化培养基的配方：1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.005mg/L TDZ+400 mg/L Tim，pH 5.8；
步骤（2）中，所述共培养基的配方：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/LTDZ，使用前加入200μmol/L AS；
步骤（3）中，所述分化筛选培养基的配方为：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+50mg/L KAN，pH5.8。
2.如权利要求1所述二倍体毛白杨的遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述消毒处理方法：先用70%酒精消毒30 s，然后用10%次氯酸钠消毒5 min。
3.如权利要求1所述二倍体毛白杨的遗传转化方法，其特征在于，步骤（2）中，菌液浓度为OD600=0.4，侵染时间为20 min。
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Application publication date: 20191001

Assignee: Nanjing all Electronic Technology Co.,Ltd.

Assignor: NANJING FORESTRY University

Contract record no.: X2023320000038

Denomination of invention: A Genetic Transformation Method of Diploid Chinese White Poplar

Granted publication date: 20220726

License type: Common License

Record date: 20230111

Application publication date: 20191001

Assignee: Nanjing Guangren Engineering Co.,Ltd.

Assignor: NANJING FORESTRY University

Contract record no.: X2023320000039

Denomination of invention: A Genetic Transformation Method of Diploid Chinese White Poplar

Granted publication date: 20220726

License type: Common License

Record date: 20230111