CN107794278B - 一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，涉及一种毛果杨转基因方法。是要解决现有毛果杨遗传转化方法的抗性筛选基因单一问题，以及诱导抗性芽出现的假阳性及畸形问题。方法：一、选取毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；二、活化携带PHSE401载体的农杆菌；三、将转化受体材料放入悬浮菌液中侵染；四、将侵染后的受体材料接种到共培养基上培养；五、共培养的受体材料脱菌处理后，再经筛选培养获得抗性芽；六、将抗性芽培养得抗性植株；七、检验；八、移栽。本方法以毛果杨无菌苗茎段作为转化受体材料直接诱导形成抗性芽，极大地缩短了这个重要模式树种转基因的周期，且不存在畸形和假阳性的情况。本发明用于毛果杨转基因领域。

Description

一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法
技术领域
本发明涉及一种毛果杨转基因方法。
背景技术
毛果杨(Populus trichocarpa Torr.Gray)也叫测序杨，是杨属青杨派树种，也是第一个被全基因组测序的树种，测序结果于2006年发表在《Science》期刊上。因此，毛果杨已成为研究林木生长发育特性、生理生态功能的模式树种，然而，已被报道的林木基因功能及作用机制研究，大多数是在杂交杨中开展的，鲜有以毛果杨为遗传材料的，这是由于现有的毛果杨转基因技术较杂交杨困难所致，这对模式树种毛果杨基因资源利用造成了极大的阻碍。
目前，关于毛果杨遗传转化的报道已有四篇。其中一篇于2004年发表在PlantMolecular Biology Reporter期刊上，该报道中毛果杨的遗传转化包括诱导抗性愈伤和抗性芽再生两个过程，首先由无菌苗茎段外植体在植物生长调节剂萘乙酸和2ip作用下诱导抗性愈伤，抗性愈伤再经不同浓度的噻苯隆诱导抗性芽。其中两篇由同一科研团队分别于2006、2015年发表在Plant Cell Physiology、Methods Molecular Biology期刊上，该报道中毛果杨遗传转化同样包括诱导抗性愈伤和抗性芽再生两个过程，不同的是，该报道中以温室内苗龄6个月的毛果杨节间茎段作为外植体，并在植物生长调节剂激动素和2,4-二氯苯氧乙酸作用下诱导出抗性愈伤。然而，以上两种方法的平均转化效率分别为6％、10％，并且转化周期长达5-6个月。另一篇于2017年发表在Scientific Reports期刊上，该报道中以毛果杨无菌苗茎段为外植体直接诱导抗性芽，转化效率平均为26.7％。
以上研究均以新霉素磷酸转移酶基因(npt II)为抗性筛选基因，抗性筛选基因较为单一，筛选培养过程中卡那霉素使用浓度范围在30-100mg/L，试验表明，毛果杨对各种植物生长调节剂和抗生素反应均比较敏感，高浓度抗生素下无法诱导出芽，或不定芽表现一定程度的假阳性和畸形，进而影响对转基因植株后续表型及基因作用机制的研究。
发明内容
本发明是要解决现有毛果杨遗传转化方法的抗性筛选基因单一问题，以及在卡那霉素筛选下以茎段为转化材料直接诱导抗性芽出现的假阳性及畸形问题，提供一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法。
本发明基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，包括以下步骤：
一、选取培养25-35d的毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；
二、挑取单个携带PHSE401载体的农杆菌菌落，接入YEP液体培养基中活化，得到活化好的农杆菌菌液；
所述PHSE401载体的RB至LB区域携带guide RNA、cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因；
所述PHSE401载体已在《A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editingin plants》文章(BMC Plant Biology 2014,14:327)中公开，由文章作者赠予；
PHSE401载体中连接guide RNA的具体方法参照文章《A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants》。
人工设计一段与目的基因DNA序列互补的guide RNA序列，guide RNA可以实现对cas核酸酶的引导。表达载体转入植物体后，表达出的guide RNA会与体内目的基因特异性结合，引导cas核酸酶对结合位点进行切割，之后细胞以非同源性末端接合或同源重组的机制将断裂的DNA重新连接，形成对目的基因编辑而产生基因的敲除或敲入。
三、将活化好的农杆菌菌液离心，倒掉上清，用悬浮液重悬菌体得到悬浮菌液，然后将步骤一的转化受体材料放入悬浮菌液中进行侵染；
四、将转化受体材料从悬浮菌液中取出，接种到共培养基上，暗培养2～3d，培养温度为23～25℃；
五、将步骤四共培养后的受体材料经过脱菌处理后，先接种到不定芽筛选初期培养基上，在23～25℃下光培养20-30d，然后转接至后期筛选培养基上，在23～25℃下光培养20-30d，获得抗性芽；
六、待抗性芽的茎长为0.9～1.1cm时，将抗性芽转接至生根筛选培养基中，23～25℃下光培养，获得抗性植株；
七、对步骤六获得的抗性植株进行检验，检验结果为阳性的即为转基因植株；
八、对步骤七获得的转基因植株进行移栽。
进一步的，步骤一中受体材料选择的具体要求是：
选取培养25-35d长势较好的毛果杨无菌苗，切下形态学自上而下第二、三、四茎节，再将其切成0.8-1.0cm的小段作为转化受体材料。
进一步的，步骤二所述农杆菌为根癌农杆菌菌株GV3101。
进一步的，步骤二中农杆菌活化的具体方法是：
将保存于-80℃的农杆菌菌株在冰上融化，用无菌牙签蘸取少量菌液划线于YEP固体培养基上，平板密封倒置于28℃培养箱中培养48h；挑取单菌落接种于20ml的YEP液体培养基中，在28℃、200rpm的恒温摇床上培养15-17h，再按1％-2％的接种量将菌液转接至50ml的液体YEP培养基中，在28℃、200rpm的恒温摇床上继续培养至OD600值为0.4-0.7。所述YEP固体及液体培养基中均包含50mg/L利福平、50mg/L庆大霉素和50mg/L卡那霉素。
进一步的，步骤三中所述悬浮液的配制方法是：
向含有20-25g/L蔗糖，且pH值为5.0-5.8的1/2WPM液体培养基中添加50-80μM乙酰丁香酮。
进一步的，步骤三中侵染的时间为15-20min。
进一步的，步骤四中共培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、50-80μM乙酰丁香酮、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。
进一步的，步骤五中脱菌处理的具体方法为：先将受体材料用250mg/L的头孢水冲洗一遍，再用无菌水冲洗三遍，每遍3-5min。然后用无菌滤纸吸干材料表面多余液体。
进一步的，步骤五中不定芽筛选初期培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、5-20mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。
进一步的，步骤五中后期筛选培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、5-20mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。
进一步的，步骤六中生根筛选培养基为含有0.1-1.0mg/L吲哚丁酸、5-20mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。
进一步的，步骤五中光培养的光周期为12-16h/d，光照强度为40-70μmol·m-2·s-1。
进一步的，步骤六中光培养的光周期为12-16h/d，光照强度为40-70μmol·m-2·s-1。
本发明方法的培养基中激素和抗生素均在培养基高温灭菌后加入。
进一步的，步骤七中对抗性植株进行检验包括以下步骤：
以初步筛选的抗性植株叶片为材料，提取植株DNA，设计cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因引物，采用PCR扩增方法进行鉴定其是否为转基因植株。
进一步的，步骤八所述的转基因植株移栽的具体要求是：
待转基因植株根长2cm以上时即可移入营养土中生长，移栽前将幼苗根部的培养基洗净，移栽时覆土深度要盖住根系，并压紧营养土，移栽后浇透水，注意温度、湿度的管理。
本发明获得转基因植株是通过CRISPR/Cas9技术(新一代基因编辑技术)来实现的，CRISPR/Cas9技术中应用PHSE401载体。CRISPR/Cas9的原理及功能参照文章《A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants》。
本发明的有益效果：
毛果杨作为林木研究的模式树种，其转基因技术水平对于林木基因工程育种研究具有重要意义，而目前其基因转化方面的报导仅有四篇，且已有研究中均以新霉素磷酸转移酶基因为抗性筛选基因。其中三篇均通过愈伤诱导途径获得抗性芽，此途径不仅转化周期长，且转化效率也相对较低；最近一篇报导以无菌苗茎段为转化材料直接诱导抗性芽，但卡那霉素筛选下直接诱导的抗性芽存在假阳性及较大比例的畸形问题。因此，本发明提供了一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，该方法不仅弥补了目前毛果杨遗传转化方法的抗性筛选基因单一问题、克服了卡那霉素筛选下直接诱导抗性芽出现假阳性及畸形问题，而且体现出毛果杨这个重要模式树种转基因所需短周期、高效率的技术要求。
本发明方法以潮霉素磷酸转移酶基因为抗性筛选基因，该基因编码的潮霉素磷酸转移酶能使植物产生抗潮霉素特性，因此用潮霉素可以对转基因植株进行筛选。而潮霉素通过抑制植物细胞核糖体的装配过程，影响细胞蛋白质翻译，从而造成细胞死亡，这在遗传转化实验中可有效抑制假阳性植株的诱导及生长，从而大大提高阳性植株的筛选效率。本方法通过潮霉素抗性筛选获得的均为阳性植株，不存在假阳性的情况。而卡那霉素抗性筛选假阳性植株概率5％-10％；同时，本方法通过高、低浓度潮霉素的结合使用，在保证阳性植株高效诱导的同时，也使其均能正常生长，没有出现畸形的抗性芽或苗情况。而卡那霉素筛选获得的抗性芽表现出茎段、叶片不同程度的扭曲等畸形，在后期生根筛选培养过程中才能渐渐恢复，但仍有一些芽是畸形；此外，本研究以毛果杨无菌苗茎段作为转化受体材料直接诱导形成抗性芽，抗性芽诱导时间仅需30-40d，获得完整转基因植株仅需50-60d，且转化效率平均达到15％，若严格按照方案操作，转化效率可高达20％。
附图说明
图1是本发明方法中PHSE401载体的结构图；
图2为实施例1中培养28d长势较好的毛果杨无菌苗；
图3为实施例1中转化受体材料在共培养基中暗培养2d的结果；
图4为实施例1中转化受体材料经过不定芽筛选初期培养基光培养20d后的结果；
图5为实施例1中转化受体材料经过筛选后期培养基中培养获得的抗性芽；
图6为实施例1中浓度为5mg/L的潮霉素对不定芽的诱导结果；
图7为实施例1中浓度为10mg/L的潮霉素对不定芽的诱导结果；
图8为实施例1中浓度为15mg/L的潮霉素对不定芽的诱导结果；
图9为实施例1中浓度为20mg/L的潮霉素对不定芽的诱导结果；
图10为实施例1中抗性芽在生根筛选培养基中培养的结果；
图11为实施例1中抗性芽移栽到营养土中生长的照片；
图12为实施例1中提供的转基因植株cas基因鉴定结果，其中M：2000bp DNAMarker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-9：转基因植株；
图13为实施例1中提供的转基因植株hpt基因鉴定结果，其中M：2000bp DNAMarker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-9：转基因植株。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，包括以下步骤：
一、选取培养25-35d的毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；
二、挑取单个携带PHSE401载体的农杆菌菌落，接入YEP液体培养基中活化，得到活化好的农杆菌菌液；所述PHSE401载体的RB至LB区域携带guide RNA、cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因；
三、将活化好的农杆菌菌液离心，倒掉上清，用悬浮液重悬菌体得到悬浮菌液，然后将步骤一的转化受体材料放入悬浮菌液中进行侵染；
四、将转化受体材料从悬浮菌液中取出，接种到共培养基上，暗培养2～3d，培养温度为23～25℃；
五、将步骤四共培养后的受体材料经过脱菌处理后，先接种到不定芽筛选初期培养基上，在23～25℃下光培养20-30d，然后转接至后期筛选培养基上，在23～25℃下光培养20-30d，获得抗性芽；
六、待抗性芽的茎长为0.9～1.1cm时，将抗性芽转接至生根筛选培养基中，23～25℃下光培养，获得抗性植株；
七、对步骤六获得的抗性植株进行检验，检验结果为阳性的即为转基因植株；
八、对步骤七获得的转基因植株进行移栽。
步骤二PHSE401载体中连接guide RNA的具体方法参照文章《ACRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants》。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中受体材料选择的具体要求是：
选取培养25-35d长势较好的毛果杨无菌苗，切下形态学自上而下第二、三、四茎节，再将其切成0.8-1.0cm的小段作为转化受体材料。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述农杆菌为根癌农杆菌菌株GV3101。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中guide RNA的一段序列与目的基因的DNA序列互补，guide RNA可以实现对cas核酸酶的引导。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中农杆菌活化的具体方法是：
将保存于-80℃的农杆菌菌株在冰上融化，用无菌牙签蘸取少量菌液划线于YEP固体培养基上，平板密封倒置于28℃培养箱中培养48h；挑取单菌落接种于20ml的YEP液体培养基中，在28℃、200rpm的恒温摇床上培养15-17h，再按1％-2％的接种量将菌液转接至50ml的液体YEP培养基中，在28℃、200rpm的恒温摇床上继续培养至OD600值为0.4-0.7。所述YEP固体及液体培养基中均包含50mg/L利福平、50mg/L庆大霉素和50mg/L卡那霉素。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中所述悬浮液的配制方法是：向含有20-25g/L蔗糖，且pH值为5.0-5.8的1/2WPM液体培养基中添加50-80μM乙酰丁香酮。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中侵染的时间为15-20min。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中共培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、50-80μM乙酰丁香酮、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中不定芽筛选初期培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、5-20mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤五中后期筛选培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、5-20mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤六中生根筛选培养基为含有0.1-1.0mg/L吲哚丁酸、5-20mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤五中光培养的光周期为12-16h/d，光照强度为40-70μmol·m-2·s-1。其它与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤六中光培养的光周期为12-16h/d，光照强度为40-70μmol·m-2·s-1。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是：步骤七中对抗性植株进行检验包括以下步骤：
以初步筛选的抗性植株叶片为材料，提取植株DNA，设计cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因引物，采用PCR扩增方法进行鉴定其是否为转基因植株。其它与具体实施方式一至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是：步骤八所述的转基因植株移栽的具体要求是：
待转基因植株根长2cm以上时即可移入营养土中生长，移栽前将幼苗根部的培养基洗净，移栽时覆土深度要盖住根系，并压紧营养土，移栽后浇透水，注意温度、湿度的管理。其它与具体实施方式一至十四之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：采用本方法获得毛果杨嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除突变体。
1.转化受体材料的获得：
选取培养28d长势较好的毛果杨无菌苗(如图2)，切下形态学自上而下第二、三、四茎节，再将其切成0.8-1.0cm的小段作为转化受体材料。
2.农杆菌菌种的活化：
农杆菌菌株含有PHSE401载体，表达载体图谱如图1所示。以嘌呤核苷磷酸化酶基因为目的基因。人工设计一段与嘌呤核苷磷酸化酶基因DNA序列互补的guide RNA序列。PHSE401载体的RB至LB区域携带guide RNA(引导嘌呤核苷磷酸化酶基因发生编辑的片段)、cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因。
所述PHSE401载体已在《A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editingin plants》文章(BMC Plant Biology 2014,14:327)中公开，由文章作者赠予；
PHSE401载体中连接guide RNA的具体方法参照文章《A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants》。
将保存于-80℃携带植物表达载体的农杆菌菌株在冰上融化，用无菌牙签蘸取少量菌液划线于固体YEP培养基上，平板密封倒置于28℃培养箱中培养48h；挑取单菌落接种于20ml的液体YEP培养基中，在28℃、200rmp的恒温摇床上培养16h，再按2％的比例将菌液转接至50ml的液体YEP培养基中，在28℃、200rmp的恒温摇床上继续培养至0.6。将菌液在2200g下离心10min，小心掉到上清，在超净工作台中用悬浮液重悬菌体，观察菌体悬浮液浓度，并测OD600值，直至菌体悬浮液OD600值为0.4时待用。
上述YEP固体及液体培养基中均包含50mg/L利福平、50mg/L庆大霉素和50mg/L卡那霉素。
3.毛果杨遗传转化过程：
将准备好的转化受体材料放入菌体悬浮液中，加入80μM的乙酰丁香酮，轻摇20min，倒掉悬浮液，把受体材料置于无菌滤纸上吸去表面部分菌液，将其水平接种到含有0.04mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.02mg/L吲哚丁酸、0.0008mg/L噻苯隆、80μM的乙酰丁香酮的共培养基中，在24±1℃条件下暗培养2d(如图3)。
将共培养后的受体材料进行脱菌处理：先用250mg/L的头孢水冲洗一遍，再用无菌水冲洗三遍，每遍3-5min。然后用无菌滤纸吸干材料表面多余液体，将其水平接种到含有0.04mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.02mg/L吲哚丁酸、0.0008mg/L噻苯隆、10mg/L潮霉素和250mg/L头孢霉素的不定芽筛选初期培养基中，在光周期为16h/d，光照强度50μmol·m-2·s-1的条件下培养20d后(如图4)，转接至含有0.04mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.02mg/L吲哚丁酸、0.0008mg/L噻苯隆、5mg/L潮霉素和250mg/L头孢霉素的筛选后期培养基中培养，20d即获得抗性芽(如图5)。
不同浓度潮霉素对不定芽的诱导有显著影响，当浓度为5mg/L时可诱导出少量不定芽(如图6)；增加潮霉素浓度至10mg/L时几乎没有长势良好的芽(如图7)，且长时间培养外植体材料会逐渐褐化直至死亡；继续增加潮霉素浓度至15mg/L、20mg/L时，不能诱导出芽，且外植体材料很快褐化死亡(如图8和图9)。因此，最终确定受体材料先在含有10mg/L潮霉素的筛选培养基中培养20-25d，再转接至含有5mg/L潮霉素的筛选培养基中，这既最大限度的避免了假阳性的出现，也保证了抗性芽的正常诱导。
待抗性芽的茎长为1cm左右时，将其转接至含有0.1mg/L吲哚丁酸、5mg/L潮霉素和250mg/L头孢霉素的生根筛选培养基中，在光周期为16h/d，光照强度50μmol·m-2·s-1的条件下培养(如图10)，30d后移栽到营养土中生长(图11)。
4.抗性植株的鉴定：
本发明经筛选培养最终获得9棵完整抗性植株，提取这些植株的DNA，并分别以抗性植株DNA、农杆菌质粒(阳性对照)、野生型毛果杨DNA(阴性对照)为模板，分别用cas引物和hpt引物进行PCR扩增。转进植物体的表达载体中含有cas及hpt位点，因此以其进行PCR鉴定，若能扩增出条带，则说明为转基因植株。
cas引物序列：Forward：5’-GAGTTCTACAAGTTCATCAAGCC-3’；Reverse：5’-CCAGGAAGTCCTTATCCTTAATG-3’，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸7min。
hpt引物序列：Forward：5’-GAGCTTGTCGATCGACAGAT-3’；
Reverse：5’-ATAACAGCGGTCATTGACTG-3’；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。
PCR反应完毕后，取5μl扩增产物，采用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图12、图13所示，以cas引物进行PCR扩增时，阴性对照植株没有扩增出任何条带，9株抗性植株均有特异性条带出现，并且与阳性对照质粒DNA扩增出的条带一致；同样，以hpt引物进行PCR扩增时，阴性对照植株没有扩增出任何条带，9株抗性植株均有特异性条带出现，并且与阳性对照质粒DNA扩增出的条带一致，表明这些抗性植株均为转基因植株。

Claims (7)

1.一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、选取培养25-35d的毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；
二、挑取单个携带PHSE401载体的农杆菌菌落，接入YEP液体培养基中活化，得到活化好的农杆菌菌液；所述PHSE401载体的RB至LB区域携带guide RNA、cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因；
三、将活化好的农杆菌菌液离心，倒掉上清，用悬浮液重悬菌体得到悬浮菌液，然后将步骤一的转化受体材料放入悬浮菌液中进行侵染；
四、将转化受体材料从悬浮菌液中取出，接种到共培养基上，暗培养2～3d，培养温度为23～25℃；
五、将步骤四共培养后的受体材料经过脱菌处理后，先接种到不定芽筛选初期培养基上，在23～25℃下光培养20～30d，然后转接至后期筛选培养基上，在23～25℃下光培养20～30d，获得抗性芽；其中不定芽筛选初期培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、10mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基；后期筛选培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、5mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基；
六、待抗性芽的茎长为0.9～1.1cm时，将抗性芽转接至生根筛选培养基中，23～25℃下光培养，获得抗性植株；其中生根筛选培养基为含有0.1-1.0mg/L吲哚丁酸、5mg/L潮霉素、200-250mg/L头孢霉素、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基；
七、对步骤六获得的抗性植株进行检验，检验结果为阳性的即为转基因植株；
八、对步骤七获得的转基因植株进行移栽。
2.根据权利要求1所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤一中受体材料选择的具体要求是：
选取培养25-35d长势较好的毛果杨无菌苗，切下形态学自上而下第二、三、四茎节，再将其切成0.8-1.0cm的小段作为转化受体材料。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤三中所述悬浮液的配制方法是：向含有20-25g/L蔗糖，且pH值为5.0-5.8的1/2WPM液体培养基中添加50-80μM乙酰丁香酮。
4.根据权利要求3所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤三中侵染的时间为15-20min。
5.根据权利要求1、2或4所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤四中共培养基为含有0.01-0.1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01-0.1mg/L吲哚丁酸、0.0001-0.1mg/L噻苯隆、50-80μM乙酰丁香酮、20-25g/L蔗糖和5.0-5.5g/L琼脂的WPM培养基。
6.根据权利要求5所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤五中光培养的光周期为12-16h/d，光照强度为40-70μmol·m-2·s-1。
7.根据权利要求6所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤六中光培养的光周期为12-16h/d，光照强度为40-70μmol·m-2·s-1。
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