CN103194486A - 一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：（1）愈伤诱导；（2）愈伤组织预培养；（3）菌种活化与培养；（4）侵染；（5）共培养；（6）延迟选择；（7）诱导不定芽；（8）伸长培养；（9）诱导生根及检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。本发明的方法克服了现有技术因以杨树茎段或叶柄为外植体的杂交杨农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，可以用少量愈伤组织外植体快速获得的抗性转基因杨树，周期短、染菌率低、转化效率高，为大规模的转基因杨树提供了一种技术手段。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。
背景技术
杨属Populus L.在全世界约有100多种，广泛分布于欧亚和北美洲。我国约有62种，是世界杨树种质资源最多的国家。杨属植物因其生长快、适应性强、用途广泛，不仅在水土保持和维护生态平衡方面发挥重要作用，而且还具有广泛的工业用途，是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要原料。
长期以来，杨树的改良主要通过杂交育种的方式进行，但因其生长发育受光照、水分、温度很多因素影响，与其它农作物和园艺植物比较，有许多特有的生物学特性，如较长的生长周期、复杂的生殖方式、高度杂合性等，使得传统的杨树育种方法己远远不能满足现代育种的要求，所以，利用组织培养技术和基因工程方法来满足实践中对杨树育种的要求具有重要的意义。
进入二十世纪八十年代后，随着分子生物学理论和技术的快速发展，以1983年首株转基因烟草问世为标志，功能基因的克隆和转基因技术己广泛应用到植物抗性的研究领域。尽管以木本植物为实验材料的林木基因工程因研究难度较大，进展相对滞后，但是由于杨树生长速度快，易繁殖，核基因组(约420Mb)及染色体数目相对较小，易于通过农杆菌转化，使得杨树成为研究树木分子生物学、林业生物技术及树木基因组的模式植物。
目前，在植物上应用的遗传转化方法主要有DNA直接转移法和根癌农杆菌（Agrobactenium tumefaciens）介导法。其中后者最为常用，是目前应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。它具有操作简便，外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝，整合位点稳定，转移DNA片段明确，整合后外源基因结构变异小，可转移大片段DNA，可直接用不同的植物组织进行基因转移等优点。已被应用于双子叶植物的遗传转化研究，现有的转基因植物如烟草拟南芥西红柿玉米等，80%以上是通过这种方法获得的。
随着对杨属的遗传转化研究的逐渐深入，农杆菌侵染已经应用于胡杨、欧洲黑杨、毛果杨、小叶杨等树种，但对白杨派及其杂种无性系的研究较为滞后，转化效率较低；而白杨派树种具有适应生境广、抗逆性强、乡土树种多、种间杂交能力强、能在大陆半干旱带和大陆湿润带等广泛生境范围内栽培并可发挥较大的生产作用等独特优势，因此研究一种针对白杨派的高效转基因方法对林木分子育种意义深远。目前白杨派中农杆菌介导的转基因的方法多局限于叶片和叶柄，而直接侵染这些外植体周期长转化效率低，而且后期染菌严重，因此本研究以白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）为实验对象，建立了一种以愈伤组织为受体的杂交杨农杆菌转化方法。
注：本研究采用的农杆菌为C58/pMP90/pH7GWIWG2(I)，C58具有利福平抗性，辅助Ti质粒pMP90具有庆大霉素抗性；通过Gateway技术构建的表达载体pH7GWIWG2(I)具有壮观霉素抗性，其T-DNA上的潮霉素磷酸转移酶基因作为转基因杨树的选择标记基因，编码蛋白具有潮霉素抗性。具有潮霉素抗性的再生苗用特异性引物进行全基因组PCR检测，产物大小为456bp，验证目的片段转入白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）中。
发明内容
本发明目的是提供一种以愈伤组织为外植体的农杆菌转化白杨杂种无性系方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：
（1）愈伤诱导：
将白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）的腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1-0.5cm2叶片的叶柄置于M1'固体培养基中，于24-26℃黑暗条件下预培养12-15天；更换一次M1'固体培养基，继续在24-26℃黑暗条件下预培养12-15天，有愈伤组织生成；
（2）愈伤组织预培养：
将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养2-3天；
（3）菌种活化与培养：
用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29℃倒置暗培养20-28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29℃倒置暗培养36-48h；
挑取单菌落至2-4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150-200rpm27-29℃暗培养12-16h；吸取0.1-1.0mL菌液放置于50-75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm27-29℃暗培养至菌液OD600=0.6-0.8；
（4）侵染：
将步骤（3）获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10-15min，弃去上清液，将沉淀用50-75mL M液重悬，得到侵染液，按30-50个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24-26℃条件下80-100rpm侵染10-20min；
（5）共培养：
取出侵染后的愈伤组织，吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24-26℃，暗条件下培养24-36小时；
（6）延迟选择：
取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4-5min，洗涤2-3次，再用浓度为350-500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液150-200rpm洗涤4-5min，洗涤2-3次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，24-26℃于黑暗条件下培养3-5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500-800Lux弱光下培养5-8天；
（7）诱导不定芽：
将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，22-26℃1500-2000Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每14-21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22-26℃1500-2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm；
（8）伸长培养：
切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24-26℃1500-2000Lux光照条件下培养2-4周，获得表型趋于正常的芽；
（9）诱导生根及检测：
取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24-26℃1500-2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。
基本培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20-30g，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH5.6-5.8；
M1'固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
M1固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
农杆菌为C58（pMP90/pH7GWIWG2(I)）；
含有抗生素的YEB固体培养基的组成为利福平25-50mg，庆大霉素20-30mg，壮观霉素30-50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH=7.0；
含有抗生素的YEB液体培养基的组成为利福平25-50mg，庆大霉素20-30mg，壮观霉素30-50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，定容至1L，pH=7.0。
M液的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，定容至1L，pH=5.6-5.8。
CIM固体选择培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素350-500mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
SIMa固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8；
SIMb固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素TDZ0.0022mg，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
SEM固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素BAP0.05mg，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。。
RM固体培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20-30g，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
本方法明显克服了因以杨树茎段或叶柄为外植体的杂交杨农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，可以用少量愈伤组织外植体快速获得的抗性转基因杨树，周期短、染菌率低、转化效率高，为大规模的转基因杨树提供了一种技术手段。
附图说明
图1为转化了的杨树全基因组PCR检测结果。
具体实施方式
本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，并不对本发明作任何限制。
实施例1
一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：
（1）愈伤诱导：
将白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）的腋芽置于基本培养基上继代繁殖，培养5周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2次造成伤口置于M1'固体培养基中，于25℃黑暗条件下预培养14天；更换一次M1'固体培养基，继续在25℃黑暗条件下预培养14天，有愈伤组织生成；
（2）愈伤组织预培养：
将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养2天；
（3）菌种活化与培养：
用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，28℃倒置暗培养24h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，28℃倒置暗培养42h；
挑取单菌落至3mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，180rpm28℃暗培养14h；吸取0.5mL菌液放置于60mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，180rpm28℃暗培养至菌液OD600=0.6-0.8；
（4）侵染：
将步骤（3）获得的菌液在室温、3800rpm离心12min，弃去上清液，将沉淀用60mL M液重悬，得到侵染液，按40个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，25℃条件下90rpm侵染15min；
（5）共培养：
取出侵染后的愈伤组织，用无菌滤纸吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，25℃，暗条件下培养30小时；
（6）延迟选择：
取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在200rpm下洗涤4min，洗涤2次，再用浓度为400mg/L的头孢霉素-去离子水溶液180rpm洗涤4min，洗涤2次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，25℃于黑暗条件下培养4天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，700Lux弱光下培养6天；
（7）诱导不定芽：
将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，24℃1800Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每18天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中24℃1800Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm；
（8）伸长培养：
切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中25℃1800Lux光照条件下培养3周，获得表型趋于正常的芽；
（9）诱导生根及检测：
取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，25℃1800Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。
基本培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖25g，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
M1'固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
M1固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
农杆菌为C58（pMP90/pH7GWIWG2(I)）；
含有抗生素的YEB固体培养基的组成为利福平35mg，庆大霉素25mg，壮观霉素40mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH=7.0；
含有抗生素的YEB液体培养基的组成为利福平35mg，庆大霉素25mg，壮观霉素40mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，定容至1L，pH=7.0。
M液的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，定容至1L，pH=5.6。
CIM固体选择培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素(Cefotaxime Sodium)400mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
SIMa固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素400mg，潮霉素B10mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
SIMb固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，细胞分裂素TDZ0.0022mg，头孢霉素400mg，潮霉素B10mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
SEM固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖25g，细胞分裂素BAP0.05mg，头孢霉素400mg，潮霉素B10mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
RM固体培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖25g，头孢霉素400mg，潮霉素B10mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH=5.6。
实施例2
一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：
（1）愈伤诱导：
将白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）的腋芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划3次造成伤口置于M1'固体培养基中，于24℃黑暗条件下预培养15天；更换一次M1'固体培养基，继续在24℃黑暗条件下预培养15天，有愈伤组织生成；
（2）愈伤组织预培养：
将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养3天；
（3）菌种活化与培养：
用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27℃倒置暗培养28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27℃倒置暗培养48h；
挑取单菌落至2mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150rpm27℃暗培养16h；吸取0.1mL菌液放置于50mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150rpm27℃暗培养至菌液OD600=0.6-0.8；
（4）侵染：
将步骤（3）获得的菌液在室温、3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀用50mL M液重悬，得到侵染液，按30个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24℃条件下80rpm侵染20min；
（5）共培养：
取出侵染后的愈伤组织，用无菌滤纸吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24℃，暗条件下培养36小时；
（6）延迟选择：
取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180rpm下洗涤5min，洗涤3次，再用浓度为350mg/L的头孢霉素-去离子水溶液150rpm洗涤5min，洗涤3次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，24℃于黑暗条件下培养5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500Lux弱光下培养8天；
（7）诱导不定芽：
将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，22℃1500Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22℃1500Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm；
（8）伸长培养：
切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24℃1500Lux光照条件下培养4周，获得表型趋于正常的芽；
（9）诱导生根及检测：
取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24℃1500Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。
基本培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20g，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
M1'固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
M1固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
农杆菌为C58（pMP90/pH7GWIWG2(I)）；
含有抗生素的YEB固体培养基的组成为利福平25mg，庆大霉素20mg，壮观霉素30mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH=7.0；
含有抗生素的YEB液体培养基的组成为利福平25mg，庆大霉素20mg，壮观霉素30mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，定容至1L，pH=7.0。
M液的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，定容至1L，pH=5.8。
CIM固体选择培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素350mg，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
SIMa固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素350mg，潮霉素B10mg，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
SIMb固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，细胞分裂素TDZ0.0022mg，头孢霉素350mg，潮霉素B10mg，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
SEM固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20g，细胞分裂素BAP0.05mg，头孢霉素350mg，潮霉素B10mg，琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
RM固体培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20g，头孢霉素350mg，潮霉素B10mg，
琼脂7.1g，定容至1L，pH=5.8。
实施例3
一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：
（1）愈伤诱导：
将白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）的顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片切取所述组培苗的带有0.1-0.5cm2叶片的叶柄置于M1'固体培养基中，于26℃黑暗条件下预培养12天；更换一次M1'固体培养基，继续在26℃黑暗条件下预培养12天，有愈伤组织生成；
（2）愈伤组织预培养：
将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养3天；
（3）菌种活化与培养：
用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，29℃倒置暗培养20h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，29℃倒置暗培养36h；
挑取单菌落至4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，200rpm29℃暗培养12h；吸取1.0mL菌液放置于75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，200rpm29℃暗培养至菌液OD600=0.6-0.8；
（4）侵染：
将步骤（3）获得的菌液在室温、4000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀用75mL M液重悬，得到侵染液，按50个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，26℃条件下100rpm侵染10min；
（5）共培养：
取出侵染后的愈伤组织，用无菌滤纸吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，26℃，暗条件下培养24小时；
（6）延迟选择：
取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在220rpm下洗涤4min，洗涤2次，再用浓度为500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液200rpm洗涤4min，洗涤2次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，26℃于黑暗条件下培养3天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，800Lux弱光下培养5天；
（7）诱导不定芽：
将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，26℃2000Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每14天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中26℃2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm；
（8）伸长培养：
切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中26℃2000Lux光照条件下培养2周，获得表型趋于正常的芽；
（9）诱导生根及检测：
取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，26℃2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。
基本培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖30g，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
M1'培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
M1固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
农杆菌为C58（pMP90/pH7GWIWG2(I)）；
含有抗生素的YEB固体培养基的组成为利福平50mg，庆大霉素30mg，壮观霉素50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH=7.0；
含有抗生素的YEB液体培养基的组成为利福平50mg，庆大霉素30mg，壮观霉素50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，定容至1L，pH=7.0。
M液的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，定容至1L，pH=5.7。
CIM固体选择培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素500mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
SIMa固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素500mg，潮霉素B10mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
SIMb固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ0.0022mg，头孢霉素500mg，潮霉素B10mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
SEM固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素BAP0.05mg，头孢霉素500mg，潮霉素B10mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
RM固体培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖30g，头孢霉素500mg，潮霉素B10mg，琼脂7.0g，定容至1L，pH=5.7。
上面各实施例所涉及的MS盐（Duchefa Biochemie B.V.公司）。
实施例4：不同外植体类型对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）产生阳性抗性芽及其染菌率的影响
本实验用白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）不带腋芽的茎段，带有0.1-0.5cm2叶片的叶柄，1-2cm2的叶片以及实施例1步骤（1）获得的0.5cm3的块状愈伤组织四种不同的组织作为农杆菌侵染的外植体材料。
实验步骤和条件均参照实施例1的步骤和条件，结果见表1，结果表明，在其它转化条件相同的情况下，不同的外植体材料产生的抗潮霉素阳性再生芽的频率不同，其中愈伤组织的转化效率最高，茎段次之，差异极其显著，而由叶片产生的再生芽的频率最低，几乎没有再生芽产生；不同外植体材料染菌率不同，愈伤组织染菌率最低，叶片、叶柄、茎段的染菌率都超过百分之五十，转化效率高，为大规模的转基因杨树提供了一种技术手段。
表1不同受体材料对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）产生抗性不定芽的影响
| 外植体类型 | 外植体数（个） | 产生抗性芽外植体数（个） | 染菌率（%） | 转化效率（%） |
| 愈伤组织 | 50 | 22 | 26 | 44.0 |
| 叶片 | 50 | 2 | 70 | 4.0 |
| 叶柄 | 50 | 7 | 60 | 14 |
| 茎段 | 50 | 11 | 54 | 22.0 |
实施例5：不同类型的农杆菌对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）产生阳性抗性芽的影响
在杨树的转化中，经常使用的农杆菌有胭脂碱型农杆菌C58（pMP90）和章鱼碱型农杆菌LBA4404两种类型。许多实验证明，相对于章鱼碱型农杆菌，青杨派，黑杨派的种间及种内杂交杨对胭脂碱型农杆菌更为敏感。本实验所用的717杨树为白杨派的种间杂交杨，也证实了胭脂碱型农杆菌C58（pMP90）比章鱼碱型农杆菌LBA4404转化效率更高。
表2不同类型农杆菌对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）产生阳性抗性芽的影响
| 农杆菌类型 | 愈伤组织数（个） | 产生抗性芽外植体数（个） | 转化效率（%） |
| LBA4404/pH7GWIWG2(I) | 50 | 11 | 22.0 |
| C58/pMP90/pH7GWIWG2(I) | 50 | 20 | 40.0 |
实施例6：预培养时间对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）转化效率的影响
在植物的遗传转化中，预培养的作用有两点：一是促进细胞的分裂，分裂状态下的细胞更容易整合外源DNA，提高转化效率；二是使培养基中的乙酰丁香酮渗入到外植体中，在于农杆菌共培养时候方便诱导农杆菌Vir基因表达，方便T-DNA整合，本实验结果表明在一定时间段内，随着预培养时间的延长，转化频率提高，当预培养时间为48h时，转化效率最高，为44.0%，但与72h、96h处理下的转化效率差异不显著，故本实验预培养时间最佳为48h。
表3预培养时间预培养时间对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）转化效率的影响
| 预培养时间（h） | 外植体数（个） | 产生抗性芽外植体数（个） | 转化效率（%） |
| 0 | 50 | 6 | 12.0 |
| 12 | 50 | 11 | 22.0 |
| 24 | 50 | 14 | 28.0 |
| 48 | 50 | 22 | 44.0 |
| 72 | 50 | 20 | 40.0 |
| 96 | 50 | 21 | 40.2 |
实施例7：侵染及共培养时间对白杨杂种无性系717-1B4（P.tremula×P.alba）产生阳性抗性芽的影响
适当的侵染时间是转化成功的关键，侵染时间过短不利于转化，时间过长容易使外植体褐化，导致死亡。愈伤组织相比其他外植体更容易在侵染中褐化，因此本次试验选取侵染时间10min15min20min25min30min，不同于其他组织的侵染，本次试验发现侵染愈伤组织时间与转化效率相关性不大而随着侵染时间延长愈伤组织褐化严重增加。可能因为农杆菌从Vir基因开始表达到T-DNA插入需要大约16个小时侵染只关乎农杆菌的附着，愈伤组织本身分化程度低，凸凹不平，易于农杆菌附着。
农杆菌和外植体的共培养过程是整个转化实验中最重要的环节，共培养时间的长短直接影响T-DNA转移，整合及转化细胞的数量。本实验（表4）的最佳共培养时间为24h，此时培养皿中愈伤组织与培养基接触处出现肉眼可见菌落，最后获得的潮霉素抗性芽的频率高达30.0%。
表4共培养时间对产生阳性抗性芽的影响
| 共培养时间（h） | 外植体数（个） | 产生抗性芽外植体数（个） | 转化效率（%） |
| 12 | 50 | 10 | 20.0 |
| 24 | 50 | 15 | 30.0 |
| 36 | 50 | 13 | 26.0 |
| 48 | 50 | 6 | 12.0 |
| 60 | 50 | 3 | 6.0 |
本发明提供了一种以愈伤组织为外植体的农杆菌转化白杨杂种无性系的方法，NAA和2ip的联合作用诱导茎段或叶柄产生愈伤组织，经农杆菌侵染后，在细胞分裂素TDZ作用下，促使愈伤再分化形成不定芽，呈玻璃化状态的幼芽在BAP诱导下伸长，形态逐渐趋于正常，具有抗性的再生杨树在含有抗生素潮霉素的基本培养基中生根。本方法先将外植体诱导成愈伤组织形成无定形态的薄壁细胞，从而使农杆菌侵染效率大大提高。每一个外植体通过愈伤组织诱导后切成0.4-0.6cm3的小愈伤组织能够显著增加外植体的利用率；农杆菌在一块愈伤组织的各个面上独立侵染，因此一块愈伤组织可以发育出多个独立的转化子；用愈伤组织直接侵染，避免了传统先侵染叶片、叶柄或茎段后诱导愈伤造成的诱导愈伤不完全而导致农杆菌被愈伤组织包被的不足。
Claims (9)
1.一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征包括下述步骤：
（1）愈伤诱导：
将717杨树的腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1-0.5cm2叶片的叶柄置于M1'固体培养基中，于24-26℃黑暗条件下预培养12-15天；更换一次M1'固体培养基，继续在24-26℃黑暗条件下预培养12-15天，有愈伤组织生成；
（2）愈伤组织预培养：
将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养2-3天；
（3）菌种活化与培养：
用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29℃倒置暗培养20-28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29℃倒置暗培养36-48h；
挑取单菌落至2-4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150-200rpm27-29℃暗培养12-16h；吸取0.1-1.0mL菌液放置于50-75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm27-29℃暗培养至菌液OD600=0.6-0.8；
（4）侵染：
将步骤（3）获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10-15min，弃去上清液，将沉淀用50-75mL M液重悬，得到侵染液，按30-50个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24-26℃条件下80-100rpm侵染10-20min；
（5）共培养：
取出侵染后的愈伤组织，吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24-26℃，暗条件下培养24-36小时；
（6）延迟选择：
取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4-5min，洗涤2-3次，再用浓度为350-500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液150-200rpm洗涤4-5min，洗涤2-3次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，24-26℃于黑暗条件下培养3-5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500-800Lux弱光下培养5-8天；
（7）诱导不定芽：
将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，22-26℃1500-2000Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每 14-21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22-26℃1500-2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm；
（8）伸长培养：
切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24-26℃1500-2000Lux光照条件下培养2-4周，获得表型趋于正常的芽；
（9）诱导生根及检测：
取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24-26℃1500-2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。
2.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征是步骤（1）所述基本培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20-30g，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH5.6-5.8；所述M1'固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
3.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于步骤（2）所述M1固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
4.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于步骤（3）所述农杆菌为C58（pMP90/pH7GWIWG2(I)）；所述含有抗生素的YEB固体培养基的组成为利福平25-50mg，庆大霉素20-30mg，壮观霉素30-50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH=7.0；所述含有抗生素的YEB液体培养基的组成为利福平25-50mg，庆大霉素20-30mg，壮观霉素30-50mg，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，定容至1L，pH=7.0。
5.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于步骤（4）中所述M液的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮19.86mg，定容至1L，pH=5.6-5.8。
6.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于步骤（6）中所述CIM固体选择培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素350-500mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
7.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于步骤（7）中所述SIMa固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8；所述SIMb固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素TDZ0.0022mg，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
8.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于步 骤（8）中所述SEM固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素BAP0.05mg，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
9.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征在于在步骤（9）中所述RM固体培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20-30g，头孢霉素350-500mg，潮霉素B10mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。
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