CN102754595A - 一种千层塔发状根系的制备与培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种千层塔发状根系的制备与培养方法，属生物细胞工程技术。该方法取千层塔幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜千层塔愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(DL1968)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在千层塔愈伤组织处生长出千层塔发状根；抑菌培养后将具有发状根的外植体放入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。本发明利用生物细胞工程技术建立千层塔发状根系培养系统，制备千层塔发状根系，实现了标准化生产千层塔，替代野生资源，缓解了千层塔日益增长的市场需求，而且解决了千层塔依赖进口问题。对药用植物发状根的工业化和商业化开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物发状根系的制备与培养方法，特别涉及一种千层塔发状根系的制备与培养方法，属生物细胞工程技术。
背景技术
蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Muray)Trev.，又名千层塔、蛇足草、宝塔草等，为石杉科石杉属蕨类植物，主布东北、长江流域和闽、粤、桂、滇、黔等省区。千层塔为多年生草本，全体暗绿色，稍有光泽，茎上部有又状分枝，高10～15cm。根须状，根茎棕色，断面圆形或类圆形，直径2～3cm。茎呈圆柱形，表面绿褐色，直径2～3cm。叶绿褐色，对生，叶片皱缩卷曲或破碎，完整者展平后呈长椭圆形，长18～27cm，宽3～5cm，叶端形状急尖，叶缘呈锯齿状，叶基部渐狭，无叶柄。孢子囊淡黄色，单生于叶腋，呈肾形，孢子同型。气微，味苦。千层塔植株顶端具有生殖芽，落地可生根成新苗，长有孢子囊，成肾形，淡黄色，横生叶腋，成熟时撒出孢子粉，野生条件下通过孢子和生殖芽繁殖，但由于孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6～15年才能成熟。
民间常将全草入药，有毒，用于退热、止血、消肿散毒。1972年中国科学院上海药物研究所首次报道该植物中的生物碱石杉碱甲(HuperzineA，HupA)在动物实验上有松弛横纹肌的作用之后，又证明HupA是具有低毒高效、可逆和高选择性等优点的乙酰胆碱酯酶抑制剂，对于治疗重症肌无力、中老年痴呆及提高记忆力具有良好的疗效，并对抑制有机磷酸中毒有一定的作用。目前国内外多家制药厂生产石杉碱甲制剂，石杉碱甲制剂和即将上市的希普林对医药原料石杉碱甲的需求和潜在需求极大地带动了石杉碱甲的市场需求。由于合成石杉碱甲成本高昂，化学合成尚无法实现产业化，故导致了千层塔资源长期紧缺，价格不断攀升，2006年千层塔药材干品涨至25元/kg，2008年初达到40元/kg，2010年甚至达到160元/kg。
随着老年化社会到来，痴呆症已成为人类的第四大病魔，直接导致国际市场上石杉碱甲的供应缺口越来越大，这既为石杉碱甲提供了广阔的市场前景，也加速了千层塔资源的迅速消耗。千层塔作为主要的药源植物和珍稀药材，为了保护稀缺中药资源，促进中药资源的可持续利用，除了加强其野生资源的保护和人工栽培之外，采用现代生物工程技术生产原材料代替种植以解决千层塔野生资源不足的问题。
利用现代细胞工程技术制备药用植物发状根，并对发状根进行离体规模化培养，可以快速大量地提取植物体中有效化学成分，也是进行药用植物资源可持续发展的有效途径之一。由于发状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物质合成能力，并且发状根培养不受环境、生态、气候等条件的限制。因此，利用发状根培养技术标准化生产千层塔替代野生资源，可以缓解日益增长的市场需求，而且也将解决依赖进口原材料、提取物等花费大量外汇的问题。因此，建立千层塔发状根培养系统大量生产千层塔替代原材料具有重要意义
目前，用发根农杆菌诱导形成的植物发状根涉及到31科100余种双子叶植物，而露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clarke)是迄今单子叶植物中发状根诱导成功的唯一例子。发状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点：(1)发状根中染色体和次生代谢产物的生物合成相对稳定；(2)发状根不仅生长速度快，而且次生代谢产物含量高，(3)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(4)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效地回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(5)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造新的合成路线，得到价值更高的产品；(7)节省大量用于种植原料的农田。正是由于发状根的上述优点，为其工业化、规模化生产优质中草药原材料提供了基础，成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。
利用植物发状根进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，植物细胞培养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用。通过发状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类(如莨菪烷生物碱、喹啉生物碱)、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶(如超氧化物歧化酶)等。大量研究表明，发状根培养体系正在成为生产次生代谢产物的重要生物技术之一，有些药用植物发状根已经进行了工业化和商业化阶段。目前利用生物细胞工程技术制备千层塔发状根系还未见相关文献报道。
发明内容
本发明目的提供一种利用生物细胞工程技术高效制备、培养千层塔发状根系的方法。
为实现本发明目的，本发明千层塔发状根系的制备与培养方法通过如下步骤实现：
取千层塔幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜千层塔愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(DL1968)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在千层塔愈伤组织处生长出千层塔发状根；抑菌培养后将具有发状根的外植体放入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。
所述千层塔幼嫩茎脱分化处理时，是取1～5cm千层塔幼嫩茎段置于B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±3下暗培养10～35d，获得新鲜千层塔愈伤组织；所述发根农杆菌与千层塔愈伤组织共培养前，将发根农杆菌在固体YEB培养基中25℃±3下暗培养1～6d；然后选取发根农杆菌单克隆菌株到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心，收集菌体，将菌体置于MS液体培养基中混匀；所述愈伤组织与发根农杆菌共培养培养基为100umol/L乙酰丁香酮的B5固体培养基，共培养时间为1-3d；所述诱导培养基为含有400mg/L头孢噻肟钠的B5固体培养基；所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25℃±1暗黑培养，每2～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；所述将抑菌处理后具有发状根的外植体放入发状根扩增培养是在25℃±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素B5液体基本培养基；所述振荡培养箱摇床转速为100～110r·min-1。
本发明千层塔发状根系诱导与培养具体方法为：
(1)将千层塔幼嫩茎剪成1～5cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理6～13min，酒精浸泡5～10s，无菌水冲洗3～8遍后转入到B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养12-20d，获得千层塔愈伤组织。
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后，涂布在20mL YEB固体培养基上，25℃±1下培养2～4d，长出克隆菌体。
(3)挑取由步骤(2)获得的发根农杆菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养，培养12小时，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100ml YEB液体培养基中振荡培养，培养8h，OD值为0.3～0.9，收集菌液，3500rpm下离心5～15分钟收集菌体。
(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中并混匀。
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中1-2d。
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗黑培养，每3～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)用无激素B5液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入50mL的扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min-1。
本发明利用生物细胞工程技术建立千层塔发状根系培养系统，制备千层塔发状根系，实现了标准化生产千层塔，替代野生资源，缓解了千层塔日益增长的市场需求，而且解决了千层塔依赖进口问题。对药用植物发状根的工业化和商业化开发具有重要意义。
附图说明
图1千层塔愈伤组织照片；
图2发根农杆菌介导Ri质粒转化千层塔愈伤组织产生发根的照片；
图3千层塔发状根扩增后悬浮培养的照片。
具体实施方式
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实施例1甘露碱纸层析分析
(1)材料：本发明新诱导出的千层塔发根(NTR)；经过继代培养的本发明发根(TR)；器官根(NR)、叶片(L)或愈伤细胞(C)；发根农杆菌A4菌液；
(2)农杆碱的提取：分别取1g上述样品加1ml(0.1M)HCl室温研磨，12,000rpm离心5min，取上清液10μl，以微量进样器点样。
(3)层析：层析滤纸的制备：将层析滤纸裁成8×8(cm)规格，浸泡于0.4mol/L的HCl溶液中24h，然后用蒸馏水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗涤后，平放在托盘上，30℃下凉干，备用。
(4)样品点样：距层析滤纸底边1～1.5cm处划一直线，铅笔标记出等距离的点样线.以微量进样器点上5μl样品，边滴加边吹干。
(5)层析展开：干燥滤纸垂直置入密闭的已饱和层析罐，待液体上限距上边缘2～4cm时取出。
(6)显色：将滤纸吹干后，浸入0.2％AgNO3丙酮液1min，取出风干；然后浸入1％NaOH-甲醇液2～3min，最后用5％硫代硫酸钠液固定，观察并摄影。
(7)结果：对千层塔毛状根的农杆碱纸层分析，毛状根样品与农杆碱标准品点板斑点位置相近，此位置千层塔原植物及千层塔未侵染愈伤组织均没有此斑点。说明发根农杆菌基因已经存在植物基因组中并表达。
实施例2
(1)将千层塔幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理7min，酒精浸泡6s，无菌水冲洗4遍后转入到B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养12d，获得千层塔愈伤组织。
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养4d长出单克隆，获得发根农杆菌A4。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为0.5，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.5，收集菌液，3000rpm下离心7min收集菌体。
(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中并混匀。
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织12min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中2d。
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗黑培养，每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素B5液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min-1。
实施例3
(1)将千层塔幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理10min，酒精浸泡8s，无菌水冲洗7遍后转入到B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养30d，获得千层塔愈伤组织。
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养5d长出单克隆，获得发根农杆菌A4。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为1，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7，收集菌液，3000rpm下离心10min收集菌体。
(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中并混匀。
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织25分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中2d。
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗黑培养，每4d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素B5液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min-1。
实施例4
(1)将千层塔幼嫩茎剪成1～2cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理8～10min，酒精浸泡8s，无菌水冲洗5遍后转入到B5+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养25d，获得千层塔愈伤组织。
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后涂于YEB固体培养基中，26℃±1下暗培养2～4d长出单克隆，获得发根农杆菌A4。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，26℃±1振荡培养，OD值为0.6～0.8，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.6，收集菌液，3500rpm下离心10min收集菌体。
(4)将菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的的B5固体培养基中并混匀。
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织20分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中1d。
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。25℃±1暗黑培养，每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素B5液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min-1。
Claims (9)
1.一种千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：取千层塔幼茎为外植体诱导愈伤组织，然后取愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在千层塔幼茎表面生长出千层塔毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。
2.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述千层塔幼嫩茎脱分化处理时，是取1～4cm千层塔幼嫩茎段置于B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养10-35d；获得新鲜千层塔愈伤组织。
3.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述发根农杆菌与千层塔愈伤组织共培养，是先将发根农杆菌在固体YEB培养基中26℃±1下培养2～4d；然后选取其单克隆菌体到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于B5液体培养基中混匀。
4.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述愈伤组织与发根农杆菌共培养培养基为含100umol/L乙酰丁香酮的B5固体培养基，共培养时间为1-3d；所述诱导培养基为含有400mg/L头孢噻肟钠的B5固体培养基。
5.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25℃±1暗培养，每2～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
6.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述将抑菌处理后具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养是在25℃±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素B5液体基本培养基，所述振荡培养箱摇床转速为100～110r·min-1。
7.如权利要求1-6任何一种所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：
(1)将千层塔幼嫩茎剪成1～5cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理6～13min，酒精浸泡5～10s，无菌水冲洗3～8遍后转入到B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养12-20d，获得千层塔愈伤组织；
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后，涂布在20mL YEB固体培养基上，25℃±1下培养2～4d，长出克隆菌体。
(3)挑取由步骤(2)获得的发根农杆菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养，培养12小时，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100ml YEB液体培养基中振荡培养，培养8h，OD值为0.3～0.9，收集菌液，3500rpm下离心5～15分钟收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中并混匀；
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中1-2d；
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗黑培养，每3～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；
(7)用无激素B5液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入50mL的扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min-1。
8.如权利要求7所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：
(1)将千层塔幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理7min，酒精浸泡6s，无菌水冲洗4遍后转入到B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养12d，获得千层塔愈伤组织；
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后，涂于YEB固体培养基中，25℃±1下暗培养4d长出单克隆；
(3)挑取由步骤(2)获得的发根农杆菌环单菌落置于YEB培养基中，26℃±1振荡培养，OD值为0.5，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.5，收集菌液，3,500rpm下离心7min收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中并混匀；
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织12min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中2d；
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗培养，每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；
(7)把无激素B5液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min-1。
9.如权利要求7所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：
(1)将千层塔幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理10min，酒精浸泡8s，无菌水冲洗7遍后转入到B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养30d，获得千层塔愈伤组织；
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后，涂于YEB固体培养基中，26℃±1下暗培养20d长出单克隆；
(3)挑取由步骤(2)获得的发根农杆菌环单菌落置于YEB培养基中，26℃±1振荡培养，OD值为1，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7，收集菌液，3,500rpm下离心12min收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中并混匀；
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织20min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B5固体培养基中1d；
(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B5固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗培养，每9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；
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