CN101194598A - 一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，以远志下胚轴和叶片为外植体，用活化了的毛状根农杆菌进行转化，使毛状根农杆菌Ri质粒的T－DNA整合到远志细胞核DNA中，表达形成毛状根，经过多次继代培养获得远志毛状根系。所获得远志毛状根与中药远志主要成分相同的远志酸(即远志皂苷)，并且含量不低于野生中药远志。可作为一种新药源提供远志产品，解决远志需求量逐年增加，野生资源匮乏以及栽培品的品质下降，给临床、中成药加工和出口带来的实际问题。

Description

一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，尤其涉及一种远志毛状根系的高效诱导与培养生产远志酸的方法。

背景技术

远志最早记载于《神农本草经》，曰：“全草能益智强志，故称远志。主咳逆伤中，补不足，除邪气，利九窍，益智慧，耳目聪明，不忘，强志倍力”。李时珍在《本草纲目》记载：“远志有大叶、小叶二种，入足少阴肾经，非心经药也。其功专于强志益精，治善忘”。《中华人民共和国药典》(2005版第一部)记载远志为远志科植物细叶远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P.sibirica L.的干燥根。味苦、辛，性温。入心、肾经。功能：安神益智、祛痰、解郁。用于惊悸、健忘、梦遗、失眠、咳嗽多痰、痈疽疮肿等证。

远志为常用大宗药材，近些年来国内外市场对远志的需求逐年上升，市场行情好，价格高，刺激了各地药农采挖的积极性，导致远志野生资源逐年下降，几近枯竭，特别是外贸急需的远志筒已极少见，拉动价格上扬，并呈逐年上升趋势。今年以来，各类远志品种涨幅较大，且居高不下，有些药市大货好货难以组织。远志市场缺口较大，2003年全国产量为1000吨左右，市场需求3000吨左右，缺口2000多吨；2005年全国产量约1500吨左右，缺口在50％以上，2006年开市以来远志升至天价。根据产区调查，其主要原因有野生资源减少，资源破坏，产地缩小，更新力差(远志种子小，靠蚂蚁等昆虫传播，天然更新不易)和家种困难(远志为喜生于阳光充足，土壤深厚、肥沃、中性或微碱性的地方，一年后才能发芽出苗生长，生长期需要四年，少数地方人工栽培研究成功，尚未大面积推广又有问题)等原因。鉴于远志市场需求量巨大，价值较贵，野生资源有限，破坏严重，人工种植远志时间长、规模小、产量低，故应用现代生物技术的理论和手段，解决药用植物资源不能满足市场需求的问题。

1982年Chilton报道在发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物的过程中，在感染部位上或附近能产生大量副产物——发状根(又称毛状根)。毛状根培养技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。目前美国、英国、日本、韩国、中国及加拿大等许多国家都在对药用植物毛状根培养的基础理论进行大量深入的研究。它是将发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)含有的质粒中的T-DNA片段整合到植物细胞的DNA上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统。发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizo-biaceae)农杆菌属(Agrobacterium)一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。

据报道，在长春花的毛状根中检测到了在长春花细胞培养中未能获得的长春碱和长春新碱。红豆杉毛状根培养体系，发现在短叶红豆杉的毛状根中紫杉醇的含量是其愈伤组织中的近8倍。无刺曼陀罗毛状根续代培养5年以上仍保持合成托品烷生物碱的稳定性。毛状根还可将部分酸分泌释放到培养液中，有利于酸的回收提取和工业化生产。在丹参毛状根培养[5]中发现有7种丹参酮存在于毛状根组织中，大约40％分泌到培养基中，同时发现丹参毛状根中含有水溶性酚酸类化合物，其中丹参酚酸A的含量超过原植物2.7倍。在黄芪毛状根培养的研究中发现粗皂甙、可溶性多糖的含量明显超过黄芪干燥根。此外，他们还成功地进行了黄芪毛状根的大规模培养实验，3L、5L和10L体积的容器中经过21天的培养，其产量可以达到干重10g/L。并证实黄芪毛状根具有增强动物免疫功能。促进骨髓造血，抗自由基，改善记忆和抗衰老、保护肾功能等作用，其作用的效价基本上与药用黄芪类似。人参、盾叶薯蓣、石斛、青蒿、三七、甘草、萝芙木、延胡索、紫杉、曼陀罗、颠茄和甘草等100多种药用植物建立了毛状根培养系统。

相对于常规细胞培养和组织培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定，并能向培养液释放部分代谢产物等优点，通过改变培养条件，毛状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍的活性物质，以及原来植物所不含有的活性成分。因此通过毛状根大规模培养，从中提取有价值的植物次生代谢产物具有良好的应用前景。由于近三分之一传统药材的药用部位是根，所以这一培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义。

该方法获得毛状根大规模培养技术平台的建立，成为生产中药材的另一个替代途径，为药用次生代谢产物的来源提供新方法，对药用植物品质改良和实现工业化生产将是一个有力的推动，为今后定向提高根茎类药材的品质提供了可靠的技术和方法，同时通过毛状根培养获得药用成分节约了大量土地资源，保护了生态环境，具有良好的社会效益和经济效益，有较强的应用价值。

发明内容

本发明其目的就在于提供一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，具有操

作周期短，发根农杆菌侵染远志的子叶和茎上形成发根的频率高，诱导率高，筛选的毛状根培养体系成本低，所获得的远志酸含量不低于野生远志的特点。

实现上述目的而采取的技术方案包括：

(1)取无菌远志种子，接种在幼苗培养基上进行幼苗培养，获得无菌幼苗；

(2)取所述步骤(1)获得的无菌幼苗的下胚轴、叶片外植体，放入预培养基进行暗培养；

(3)取所述步骤(2)中进行预培养的下胚轴、叶片等外植体，经发根农杆菌A4介导，进行转化；

(4)将所述步骤(3)介导转化后的下胚轴、叶片等外植体在预培养基进行弱光共培养；

(5)将所述步骤(4)进行共培养的下胚轴、叶片等外植体放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，直至外植体外形成毛状根；

(6)将所述步骤(5)中抑菌培养的具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中进行毛状根扩大培养；

(7)将所述步骤(6)中获得的远志毛状根进行干燥，测定其所远志皂苷等酸含量。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明是利用发根农杆菌A4菌株转染远志的子叶和茎等为外植体，操作周期短，发根农杆菌侵染远志的子叶和茎上形成发根的频率高，诱导率高，筛选的毛状根培养体系成本低，所获得的远志酸含量不低于野生远志，可以作为野生远志的替代药源，并为进一步扩大为工业化生产奠定基础。

具体实施方式

实施例包括如下步骤：

(1)取无菌远志种子，接种在幼苗培养基上进行幼苗培养，获得无菌幼苗；

(2)取所述步骤(1)获得的无菌幼苗的下胚轴、叶片外植体，放入预培养基进行暗培养；

(3)取所述步骤(2)中进行预培养的下胚轴、叶片等外植体，经发根农杆菌A4介导，进行转化；

(4)将所述步骤(3)介导转化后的下胚轴、叶片等外植体在预培养基进行弱光共培养；

(5)将所述步骤(4)进行共培养的下胚轴、叶片等外植体放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，直至外植体外形成毛状根；

(6)将所述步骤(5)中抑菌培养的具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中进行毛状根扩大培养；

(7)将所述步骤(6)中获得的远志毛状根进行干燥，测定其所远志皂苷等酸含量。

所述步骤(1)中的幼苗培养基是无菌远志种子置于无激素的MS培养基中，28℃下进行培养2-3天。

所述步骤(2)的下胚轴、叶片外植体在预培养基进行的暗培养条件是将外植体放入预培养基在25℃培养24-72小时；所述培养基包括下述含量的组分：MS基本培养基+生长素2.0-10.0mg/L+细胞分裂素0.2-1.0mg/L，避光培养。

所述步骤(3)中预培养的外植体经发根农杆菌的介导转化方法是，将预培养后的外植体置稀释后的发根农杆菌A4菌液中，轻轻振荡30min，进行介导转化。

所述的发根农杆菌菌液是将发根农杆菌A4菌株置入YMB液体培养基中，22℃振荡培养24h，120r/min，然后菌液进行离心，弃上清液，用无激素的MS培养基重悬浮并稀释到，生长对数期的毛状根农杆菌准备接种，用紫外分光光度计扫描，感染前稀释至10⁶～10⁷个细菌/mL。

所述的步骤(4)中介导转化后的下胚轴、叶片外植体的共培养是转化的预培养基在弱光，1000lx，25℃培养72-96小时；所述培养基包括下述含量的组分：MS基本培养基+生长素2.0-10.0mg/L+细胞分裂素0.2-1.0mg/L，避光培养。

所述生长素为NAA，IAA，2，4-D中的一种；

所述细胞分裂素为6-BA，KT，ZT中的一种。

所述的步骤(5)中共培养的下胚轴、叶片外植体放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，是将介导转化的下胚轴、叶片外植体放入抑菌培养基在25±2℃，24-48弱光中进行至少五次的继代抑菌培养，直至将菌除净。

所述的抑菌培养基包括下述含量的组分：无任何激素的MS培养基，头孢类抗生素，如头孢唑啉250-600mg/L。

所述的步骤(6)中将具有毛状根的外植体放入毛状根扩大培养基中25±2℃，2-3天进行扩增培养，或液体培养基中振荡培养，100r/min，培养温度23±1℃。

所述的扩增培养基包括下述含量的组分：不含激素的MS基本培养基或改良White琼脂培养基，青霉素类抗生素，如羟苄青霉素250-600mg/L。

所述的抑菌培养基和毛状根扩增培养基中还包括以下含量的组分：肌醇100-500mg/L，Vc1-5mg/L，水解酪蛋白200-400mg/L，葡萄糖浓度5-10％。

所述的步骤(7)中远志酸的含量测定方法，即《中华人民共和国药典》(2005版第一部)，远志项下含量测定方法进行测定。

以下将参照具体实施例详述本发明：

一种远志毛状根系培养生产远志酸，具体步骤如下：

(1)无菌幼苗植株：新鲜远志的种子，用清水彻底清洗后，放置过夜后用无菌水漂洗3次，75％酒精消毒1分钟，10％ NaCl消毒10-15分钟，再用无菌水冲洗5次备用。接种于MS0的培养基上，28℃下暗培养，及时将未污染的发芽种子转接到MS0固体培养基中，继续28℃光照培养，得到无菌种子幼苗。

(2)获得的无菌幼苗的下胚轴、叶片等外植体，放入预培养基进行暗培养，在25℃培养24-72小时；所述培养基包括下述含量的组分：MS基本培养基+生长素2.0-10.0mg/L+细胞分裂素0.2-1.0mg/L，避光培养。

生长素为NAA，IAA，2，4-D中的一种；细胞分裂素为6-BA，KT，ZT中的一种。

MS基本培养基中各元素的含量如下(mg/L)：

大量    含量  微量元   含量  铁盐         含量  有机物  含   其  含量

元素          素                                      量   他

KNO₃    1900  H₃BO₃    6.2   FeSO₄7H₂O    27.8 肌醇   100   蔗  30000

                                                           糖

NH₄NO₃  1650  MnSO₄    22.3  Na₂EDTA2H₂O  37.3 烟酸   0.5   琼  8000

              4H₂O                                         脂

MgSO₄   370   ZnSO₄    8.6                     盐酸硫 0.5

7H₂O          7H₂O                             胺素

KH₂PO₄  170   Na₂MoO₄  0.25                    盐酸吡 0.5

              2H₂O                             哆醇

CaCl₂   440   CuSO₄    0.025                   甘氨酸  2

2H₂O          5H₂O

              CoCl₂    0.025

              6H₂O

              KI       0.83

(3)发根农杆菌的细菌处理液的配制(胡萝卜处理组)：取新鲜胡萝卜根30g，切碎，加少量水，匀浆后榨汁，得60mL，120℃20min灭菌后，于细菌接种前过滤，加入到90mL YEB无菌母液中，使得其他无机、有机成分与YEB培养基浓度相同。未处理组为YEB液体培养基。

细菌处理：吸取前述菌液少许，分别加入到上述两种培养液中，22℃振荡培养24h(120r/min)，然后菌液进行离心，弃上清液，用紫外分光光度计扫描取生长对数期的毛状根农杆菌准备接种。

所述的YEB培养基作为发根农杆菌培养基，其中的各个元素含量如下(mg/L)：

成分                                含量

蛋白胨(Peptone)                     5000

酵母提取液(Yeast extract powder)    1000

牛肉浸膏(Beef Extract)              5000

MgSO4.7H2O                          495

PH 7.0

(4)培养的下胚轴、叶片等外植体，经发根农杆菌A4介导，进行转化。发根农杆菌的介导转化方是，将预培养后的外植体置稀释后的发根农杆菌A4菌液中，轻轻振荡30min，进行介导转化。

(5)将介导转化后的下胚轴、叶片等外植体在预培养基进行共培养。培养条件是预培养基在弱光(1000lx)，25℃培养72-96小时；所述培养基包括下述含量的组分：MS基本培养基+生长素2.0-10.0mg/L+细胞分裂素0.2--1.0mg/L。

(6)共培养的下胚轴、叶片等外植体放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，25±2℃，24-48弱光中进行至少五次的继代抑菌培养，直至将菌除净。所述抑菌培养基包括下述含量的组分：无任何激素的MS培养基，头孢类抗生素，如头孢唑啉250-600mg/L。放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，直至外植体外形成毛状根。

(7)毛状根的鉴定：

①毛状根可以从形态水平上给于鉴定，它不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。这些表型的特征与未转化的根不同，可区分开。

②通过毛状根中GUS活性的测定或NPTII酶的检测从组织水平来证明Ri质粒中的T-DNA是否转移整合到植物细胞的核因组上。

③可用高压纸电泳方法测定冠瘿碱，用碱性硝酸银溶液染色，硫代硫酸钠溶液固定。作为细胞水平的毛状根鉴定方法，因为冠瘿碱合成酶基因在发根农杆菌中并不能表达。

(8)将抑菌培养的具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中进行毛状根扩大培养。培养条件是25±2℃，2-5天进行扩增培养。或液体培养基中振荡培养(100r/min)，培养温度23±1℃。所述扩增培养基包括下述含量的组分：不含激素的MS基本培养基或改良White液体培养基，青霉素类抗生素，如羟苄青霉素250-600mg/L。

改良White培养基中各元素的含量如下(mg/L)：

大量元    含    微量元  含量    铁盐        含   有机物    含   其  含量

素        量    素                         量             量   他

KNO₃      80    H₃BO₃   1.5     Fe₂(SO₄)₃  2.5  肌醇      100  蔗  30000

                                                              糖

Ca(NO₃)₂  300   MnSO₄   7.0                     烟酸      0.3  琼  8000

H₂O             4H₂O                                           脂

MgSO₄     720   ZnSO₄   3.0                     盐酸硫胺  0.1

7H₂O            7H₂O                            素

NaH₂PO₄   16.5  MoO₃    0.0001                  盐酸吡哆  0.1

4H₂O                                            辛

KCl       65    CuSO₄   0.001                   甘氨酸    3

                5H₂O

Na₂SO4    200

抑菌培养基和毛状根扩增培养基中还包括以下含量的组分：肌醇100-500mg/L，Vc1-5mg/L，水解酪蛋白200-400mg/L，葡萄糖浓度5-10％。

(9)毛状根酸的含量：采用《中华人民共和国药典(2005版第一部)，远志项下，高效液相色谱法对其主要成分远志酸(远志皂苷)进行定量分析。

色谱条件：以十八烷基碳键和硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长为210nm，理论板数按照远志酸峰计算不低于2500。

对照品溶液的制备：精密称取远志酸对照品适量，加甲醇配置成每1ml含有80μg的溶液，即得。

供试溶液的制备：远志毛状根干品粉末(过4号筛)约1g，精密称定，索氏提取器提取，甲醇适量，浸渍30分钟，加热回流5小时，提取液蒸干，残渣加10％盐酸溶液20ml，微热使溶解，水浴中水解2小时，取出，冷却，过滤，沉淀用水洗涤至中性，残渣加甲醇溶解并转移至100ml，量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液5-10μl，注入液相色谱仪，测定。

经过上述诱导培养获得的毛状根，生长速度快，可在40天左右获得含有远志酸的毛状根，所含有的远志酸含量与野生远志相当。

Claims (14)

1.一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其包括如下步骤：

(1)取无菌远志种子，接种在幼苗培养基上进行幼苗培养，获得无菌幼苗；

(2)取所述步骤(1)获得的无菌幼苗的下胚轴、叶片外植体，放入预培养基进行暗培养；

(3)取所述步骤(2)中进行预培养的下胚轴、叶片等外植体，经发根农杆菌A4介导，进行转化；

(4)将所述步骤(3)介导转化后的下胚轴、叶片等外植体在预培养基进行弱光共培养；

(5)将所述步骤(4)进行共培养的下胚轴、叶片等外植体放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，直至外植体外形成毛状根；

(6)将所述步骤(5)中抑菌培养的具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养基中进行毛状根扩大培养；

(7)将所述步骤(6)中获得的远志毛状根进行干燥，测定其所远志皂苷等酸含量。

2.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的幼苗培养基是无菌远志种子置于无激素的MS培养基中，28℃下进行培养2-3天。

3.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)的下胚轴、叶片外植体在预培养基进行的暗培养条件是将外植体放入预培养基在25℃培养24-72小时；所述培养基包括下述含量的组分：MS基本培养基+生长素2.0-10.0mg/L+细胞分裂素0.2-1.0mg/L，避光培养。

4.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中预培养的外植体经发根农杆菌的介导转化方法是，将预培养后的外植体置稀释后的发根农杆菌A4菌液中，轻轻振荡30min，进行介导转化。

5.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的发根农杆菌菌液是将发根农杆菌A4菌株置入YMB液体培养基中，22℃振荡培养24h，120r/min，然后菌液进行离心，弃上清液，用无激素的MS培养基重悬浮并稀释到，生长对数期的毛状根农杆菌准备接种，用紫外分光光度计扫描，感染前稀释至10⁶～10⁷个细菌/mL。

6.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中介导转化后的下胚轴、叶片外植体的共培养是转化的预培养基在弱光，1000lx，25℃培养72-96小时；所述培养基包括下述含量的组分：MS基本培养基+生长素2.0-10.0mg/L+细胞分裂素0.2-1.0mg/L，避光培养。

7.根据权利要求3或6所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述生长素为NAA，IAA，2，4-D中的一种；

8.根据权利要求3或6所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述细胞分裂素为6-BA，KT，ZT中的一种。

9.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中共培养的下胚轴、叶片外植体放入抑菌培养基进行抑菌继代培养，是将介导转化的下胚轴、叶片外植体放入抑菌培养基在25±2℃，24-48弱光中进行至少五次的继代抑菌培养，直至将菌除净。

10.根据权利要求1或9所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的抑菌培养基包括下述含量的组分：无任何激素的MS培养基，头孢类抗生素，如头孢唑啉250-600mg/L。

11.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的步骤(6)中将具有毛状根的外植体放入毛状根扩大培养基中25±2℃，2-3天进行扩增培养，或液体培养基中振荡培养，100r/min，培养温度23±1℃。

12.根据权利要求9所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的扩增培养基包括下述含量的组分：不含激素的MS基本培养基或改良White琼脂培养基，青霉素类抗生素，如羟苄青霉素250-600mg/L。

13.根据权利要求3或6所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的抑菌培养基和毛状根扩增培养基中还包括以下含量的组分：肌醇100-500mg/L，Vc1-5mg/L，水解酪蛋白200-400mg/L，葡萄糖浓度5-10％。

14.根据权利要求1所述的一种远志毛状根系培养生产远志酸的方法，其特征在于，所述的步骤(7)中远志酸的含量测定方法，即《中华人民共和国药典》(2005版第一部)，远志项下含量测定方法进行测定。