CN101638669B - 一种采用细胞团块悬浮培养生产川贝母总生物碱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用细胞团块悬浮培养生产川贝母总生物碱的方法，该方法将经过诱导培养获得的川贝母细胞团块切成3～4mm大小，接入液体培养基中进行悬浮培养，最终获得生物碱含量高(为市售川贝母鳞茎的2.04倍)，且生长周期短(仅为24～28天)的培养产物。该方法较好地解决了川贝母传统生产方法中存在的时间长，药材产量和有效成分含量低等问题，可实现大规模快速生产川贝母药材有效成分的目的。

Description

一种采用细胞团块悬浮培养生产川贝母总生物碱的方法
技术领域
本发明涉及一种川贝母总生物碱的组织培养方法，特别是涉及一种采用细胞团块悬浮培养生产川贝母总生物碱的方法。 
背景技术
川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，为名贵的川产道地药材，堪称药中之宝。是治疗肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血的常用药物。主要有效成分为贝母生物碱和甾体皂甙类等。在自然界中从川贝母种子萌发到长成药材，大约需要4-5年，且其中药用成分含量很低，这就造成了川贝母野生资源的过度采挖，使得川贝母野生资源锐减，正面临枯竭的境地。 
傅华龙等人利用川贝母鳞茎诱导获得愈伤组织、胚性愈伤组织、胚状体、小鳞茎和大鳞茎等，通过对总生物碱含量测定结果显示，组织培养生产的川贝母鳞茎总生物碱含量要高于野生及市售川贝；并且还进行了游离全蛋白电泳比较，测得组培鳞茎与野生鳞茎的游离全蛋白图谱完全一致。高山林等人探索出川贝母鳞茎快速增殖的最佳条件，并对组织培养川贝母的化学成分和药理作用进行了研究，检测了通过组织培养获得的鳞茎和商品鳞茎有一致的化学成分，都具有生物碱、有机酸、皂甙氨基酸等13种化学物质；通过药理实验结果显示，组培川贝与野生川贝具有同样镇咳祛痰作用，而且药物毒性均较低，比较安全。 
目前，未见采用川贝母细胞团块悬浮培养方式生产总生物碱的报道。在组织培养中，常规的固体培养方式存在细胞团块在培养基中分散性较差，因此细胞团块吸收营养物质不及悬浮培养充分，从而使得细胞团块生长速度慢、周期长。另外，一般的悬浮培养是以单个细胞作为外植体进行培养的；虽然单个细胞的分裂能力强，但分化程度极低，不利于培养细胞中次生代谢产物的产生，并且单个细胞不能形成一个传质梯度，也会影响到次生代谢产物的产生。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用川贝母细胞团块悬浮培养方式生产总生物碱的方法，该方法获得的培养产物其生物碱含量高且生长周期短。 
为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤： 
(1)细胞团块的获得：将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成适当大小转接到产生细胞团块的培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1～1.0mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+琼脂5.5～7.0g·L-1中进行培养，所采用的pH值为5.6～6.0，培养温度18～22℃、每天光照8～12小时、光照强度为1000～1800lx； 
(2)细胞团块的悬浮培养：将(1)步骤获得的细胞团块切成为2～8mm的小块转入到液体培养基MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+NAA0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～40g·L-1+病毒唑5～20mg·L-1中进行悬浮培养，所采用的pH值为5.5～6.0，细胞团块的接种量为10～50g·L-1，培养温度18～22℃、每天光照8～12小时、光照强度为600～1000lx，摇床转速为120～140r/min； 
(3)细胞团块的继代培养：采用与步骤(2)相同的培养条件，在细胞团块接入液体培养基后35天进行第一次继代培养，以后每隔24～28天继代一次，每次继代时将原培养液倒掉，然后补加培养液并保持细胞团块培养物占培养液总体积的1/5～1/3； 
(4)获得有效成分含量高的培养物：将继代培养的细胞团块过滤并经减压抽滤至细胞团块不再滴水为止，然后将细胞团块置于烘箱中烘干至恒重，即获得所需生物碱含量高的培养产物，用分光光度法在412nm处测定培养产物中总生物碱含量。 
上述步骤(1)中应选取黄绿色且无芽点的愈伤组织接入培养基中以获得黄棕色细胞团块。 
本发明由于采用以川贝母细胞团块为外植体进行悬浮培养的方式生产总生物碱，使得细胞团块在培养过程中吸收的营养物质更充分，因而生长速度快、周期短，其生长周期为24～28天，培养30天后细胞团块可增值4倍以上；并且采用细胞团块作为外植物体进行悬浮培养，在细胞团块中心至表面能够形成一个传质梯度，这在一定程度上更有利于次生代谢产物的产生。因此用本发明方法能够快速获得生物碱含量高的培养产物，较好地解决了传统培养方法中存在的生产时间长，药材产量和有效成分含量低等问题，从而可实现大规模快速生产川贝母药材有效成分的目的，以满足药材市场对川贝母的大量需求。 
具体实施方式
实施例1 
(1)细胞团块的获得：在超净工作台上将由鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成适当大小转接到产生细胞团块的培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+30g·L-1蔗糖+琼脂6.5～7.0g·L-1中，并在18～22℃、光照强度为1000～1800lx、每天光照12小时的条件下进行培养，30天可诱导产生细胞团块； 
(2)细胞团块的悬浮培养：将诱导产生的细胞团块在超净工作台上切成3～4mm大小，接入MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+病毒唑5mg.L-1+30g·L-1蔗糖的液体培养基中，接种量为30g·L-1，培养温度18～ 22℃、光照强度600～1000lx、每天光照12小时、在转速为120～140r/min的条件下进行振荡培养，细胞团块增值速度很快，培养一个周期后，细胞团块增值倍数可达到5.08倍，且再生细胞团块的生物碱含量为0.139％； 
(3)细胞团块的继代培养：在细胞团块接入液体培养基后35天进行第一次继代培养，以后每隔24～28天后继代一次，每次继代是将原培养液倒掉，然后加培养液并保持细胞团块培养物占培养液体积的1/5～1/3，其培养温度18～22℃、每天光照8～12小时、光照强度为600～1000lx，摇床转速120～140r/min； 
(4)获得总生物碱含量高的培养物：将培养一个生长周期的细胞团块用尼龙网过滤并经减压抽滤至细胞团块不再滴水为止，然后将细胞团块置于60℃的烘箱中烘干至恒重，用分光光度法在412nm处测定细胞团块中总生物碱含量，具体方法可参照《湖北贝母与川贝母总生物碱含量的比较》，药学进展.1998.22(1)：49-50。 
实施例2 
将实施例1(2)步骤中悬浮培养基改为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+病毒唑20mg·L-1+蔗糖30g·L-1，其他步骤同实施例1，培养30天后统计细胞团块增值倍数为2.96倍，细胞团块表面伤口处褐化较严重。 
实施例3 
将实施例1(2)步骤中细胞团的接种量由30g·L-1改为50g·L-1，其他步骤同实施例1，培养30天后统计细胞团块增值倍数为2.26倍，说明接种量过大不利于细胞团块的增值。 
实施例4 
将实施例1(2)步骤中悬浮培养基改为MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+病毒唑5mg·L-1+蔗糖30g·L-1，其他步骤同实施例1，培养30天后统计细胞团块增值倍数为2.63倍，其细胞团块培养物中有芽产生。 

Claims (2)

1.一种采用细胞团块悬浮培养生产川贝母总生物碱的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)细胞团块的获得：将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成适当大小转接到产生细胞团块的培养基MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1～1.0mg·L-1+蔗糖30～50g·L-1+琼脂5.5～7.0g·L-1中进行培养，所采用的pH值为5.6～6.0，培养温度18～22℃、每天光照8～12小时、光照强度为1000～1800lx；
(2)细胞团块的悬浮培养：将(1)步骤获得的细胞团块切成2～8mm的小块转入到液体培养基MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+NAA0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～40g·L-1+病毒唑5～20mg·L-1中进行悬浮培养，所采用的pH值为5.5～6.0，细胞团块的接种量为10～50g·L-1，培养温度18～22℃、每天光照8～12小时、光照强度为600～1000lx，摇床转速为120～140r/min；
(3)细胞团块的继代培养：采用与步骤(2)相同的培养条件，在细胞团块接入液体培养基后35天进行第一次继代培养，以后每隔24～28天继代一次，每次继代时将原培养液倒掉，然后补加培养液并保持细胞团块培养物占培养液总体积的1/5～1/3；
(4)获得有效成分含量高的培养物：将继代培养的细胞团块过滤并经减压抽滤至细胞团块不再滴水为止，然后将细胞团块置于烘箱中烘干至恒重，即获得生物碱含量高的培养产物。
2.根据权利要求1所述的一种采用川贝母细胞团块悬浮培养生产总生物碱的方法，其特征在于：步骤(1)中应选取黄绿色且无芽点的愈伤组织接入诱导细胞团块的培养基中以获得黄棕色的细胞团块。
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