CN107484659B - 一种铁皮石斛原球茎无激素培养方法 - Google Patents
一种铁皮石斛原球茎无激素培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛原球茎无激素培养的方法，培养基为：MS+土豆汁250g/L+蔗糖30g/L+琼脂条7～8g/L效果最好，培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0。添加土豆汁的培养基中原球茎的增殖率最高可达1028.94％，多糖含量和总生物碱含量较番茄汁高，其中以250g/L效果最好。本发明无添加任何化学激素，生态环保，且方法简单，适宜于实际生产应用，为直接利用铁皮石斛原球茎作为药用材料提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域中植物组织培养的方法，尤其涉及一种铁皮石斛原球茎无激素培养的方法。
背景技术
铁皮石斛(Dedrobium officinale Kimura et Migo)属兰科石斛属国家重点二级保护植物。主要成分为石斛多糖和石斛碱，因其润肺止咳、滋阴清热、益胃生津等功效显著，而位居“九大仙草”之首。铁皮石斛的野生资源趋于枯竭，利用组织培养技术进行人工标准化、规模化栽培已日趋成熟。但铁皮石斛经过组织培养、炼苗、移栽以及三至五年的栽培后方能作为商品，生长周期长，且铁皮石斛生长环境要求较严格，后期栽培投入的设备及人工成本较高，以致其价格居高不下。而铁皮石斛原球茎具有生长周期短，繁殖率高等特点，前人研究表明，铁皮石斛原球茎有较好的药理效果，其药效作用与药用铁皮石斛茎段相似，因此工业化生产铁皮石斛原球茎及其有效成分有着巨大的市场前景。目前对铁皮石斛原球茎的研究集中在添加外源激素或改变培养条件以提高增殖率，积累多糖和总生物碱含量方面，而植物工厂化生产的原球茎也仅是作为铁皮石斛种苗的育种胚芽，由于培养基中添加了外源激素和原球茎的高增殖率，大量的原球茎被作为“废物”舍弃，这对其作为珍贵药材来说是一大浪费。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前对铁皮石斛原球茎的研究集中在添加外源激素或改变培养条件以提高增殖率，积累多糖和总生物碱含量方面，而植物工厂化生产的原球茎也仅是作为铁皮石斛种苗的育种胚芽，由于培养基中添加了外源激素和原球茎的高增殖率，大量的原球茎被作为“废物”舍弃，对其作为珍贵药材来说是一大浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种无激素培育铁皮石斛原球茎的方法，提高了原球茎的增殖率及有效成分含量，使铁皮石斛原球茎的生产有实际应用价值。
本发明是这样实现的，一种铁皮石斛原球茎无激素培养方法，所述铁皮石斛原球茎无激素培养方法以铁皮石斛T4的原球茎为试材，在培养基中添加不同浓度梯度的土豆汁和番茄汁天然有机物，并测定不同培养时间铁皮石斛原球茎的干物率、增殖率、多糖和总生物碱含量。
进一步，所述铁皮石斛原球茎无激素培养方法包括以下步骤：
步骤一，铁皮石斛原球茎诱导：使用铁皮石斛成熟果荚作为原球茎的诱导材料，在超净工作台上先用体积比为75％的酒精表面消毒20～30s，再用重量比为0.1％的升汞消毒5～8min，无菌水冲洗4～6次；用解剖刀将蒴果切开，将种子播种在无激素培养基MS+土豆汁100～150g/L+蔗糖20～30g/L+琼脂条7～8g/L的培养基中，种子平铺于培养基表面；培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0；培养30～40d后，得到膨大的铁皮石斛原球茎；
步骤二，铁皮石斛原球茎增殖：得到的原球茎接种于上述无激素培养基MS+土豆汁100～150g/L+蔗糖20～30g/L+琼脂条7～8g/L中增殖，接种量为每瓶10个点，每个点原球茎直径大小为0.8～1cm，30～40d后继代一次；培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0；
步骤三，铁皮石斛原球茎无激素培养：选择市场销售的新鲜土豆和番茄，切块，煮沸，纱布过滤，取汁液；设置成不同浓度梯度的土豆汁和番茄汁添加于MS培养基中，将得到的原球茎接种于培养基中培养，培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0；
步骤四，测定铁皮石斛原球茎的干物率；
步骤五，测定铁皮石斛原球茎的增殖率；
步骤六，测定铁皮石斛原球茎的主要药用成分。
进一步，所述步骤三中不同浓度的培养基配制具体包括：以土豆和番茄作为天然有机物添加到MS培养基；并设置土豆汁浓度为100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L五个浓度梯度；番茄汁浓度梯度为50g/L、200g/L、350g/L、500g/L、650g/L五个浓度梯度；以MS+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L+土豆汁150g/L作为对照组；KT为6-糠氨基嘌呤；NAA为a-萘乙酸。
进一步，在培养基中添加不同浓度梯度的土豆汁和番茄汁天然有机物中，土豆汁浓度250g/L。
进一步，所述步骤四干物率的测定，具体包括：小心取出于培养室中培养30d、40d、50d的铁皮石斛原球茎，称取30g铁皮石斛原球茎新鲜样品M于105℃杀青30min，50℃烘干至恒质量，准确称取铁皮石斛样品干质量m；
干物率＝(m/M)*100％。
进一步，所述步骤五增殖率的测定包括：接种前称取培养瓶的重量m1，接种后再次称重m2，计算出原球茎的初重，于培养室中培养30d、40d、50d后小心取出原球茎，称取增殖后的原球茎重量M；
增殖率＝M-(m2-m1)/(m2-m1)*100％。
进一步，所述步骤六主要药用成分的测定：多糖含量的测定采用苯酚硫酸法，总生物碱含量的测定采用氯仿法。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述铁皮石斛原球茎无激素培养方法培养的铁皮石斛原球茎。
本发明的优点及积极效果为：以天然有机物代替外源激素培养铁皮石斛原球茎，其石斛多糖和总生物碱积累的速率远远大于传统人工栽培的植物茎段，且生产成本较低，无添加激素可放心食用或加工，另外还可以考虑作为石斛多糖和石斛碱的生产来源，在一定程度上可成为促进铁皮石斛价格理性回归的方法。为解决药材匮乏，本发明以铁皮石斛T4的原球茎为试材，通过添加不同浓度的天然有机物，短时期内即可获得大量增殖的不含外源激素的原球茎，由于本发明采用无激素的生产方式，因此得到的产品符合相关检验要求，可以达到上市要求。同时可有效降低生产成本，有利加快其应用及推广。
本发明为直接利用铁皮石斛原球茎作为药用材料提供了理论依据。结果表明：50d内原球茎干物率随着原球茎的大量增殖而逐渐下降，250g/L的土豆汁培养50d时增殖率最高，达1028.94％，同时多糖含量比添加外源激素的培养基高66.58％，而总生物碱含量在40d时积累最多，比对照高30.93％。添加土豆汁的培养基中原球茎的增殖率、多糖含量和总生物碱含量较番茄汁高，其中以250g/L效果最好。
附图说明
图1是本发明实施例提供的铁皮石斛原球茎无激素培养方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明以铁皮石斛T4的原球茎为试材，在培养基中添加不同浓度梯度的土豆汁和番茄汁两种天然有机物，测定不同培养时间铁皮石斛原球茎的干物率、增殖率、多糖和总生物碱含量。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的铁皮石斛原球茎无激素培养方法包括以下步骤：
S101：铁皮石斛原球茎诱导：使用铁皮石斛成熟果荚作为原球茎的诱导材料，在超净工作台上先用体积比为75％的酒精表面消毒20～30s，再用重量比为0.1％的升汞消毒5～8min，无菌水冲洗4～6次；用解剖刀将蒴果切开，将种子播种在无激素培养基MS+土豆汁100～150g/L+蔗糖20～30g/L+琼脂条7～8g/L的培养基中，种子平铺于培养基表面，所述MS培养基为1962年，由Murashige和Skoog公开的MS培养基，所述土豆汁为用市场销售的新鲜土豆，切块，煮沸，纱布过滤，取汁液。培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0。培养30～40d后，得到膨大的铁皮石斛原球茎；
S102：铁皮石斛原球茎增殖：将得到的原球茎接种于上述无激素培养基MS+土豆汁100～150g/L+蔗糖20～30g/L+琼脂条7～8g/L中增殖，接种量为每瓶10个点，每个点原球茎直径大小为0.8～1cm，30～40d后继代一次。培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0；
S103：铁皮石斛原球茎无激素培养：选择市场销售的新鲜土豆和番茄，切块，煮沸，纱布过滤，取汁液。设置成不同浓度梯度的土豆汁和番茄汁添加于MS培养基中，将得到的原球茎接种于培养基中培养，培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0；
S104：测定铁皮石斛原球茎的干物率；
S105：测定铁皮石斛原球茎的增殖率；
S106：测定铁皮石斛原球茎的主要药用成分。
下面结合实验方法对本发明作进一步描述。
一、本发明实验材料取铁皮石斛T4蒴果，用组织培养方式进行常规表面消毒后播种于MS培养基中，原球茎继代增殖培养后第6代作为试材。
(1)培养基配方
以市面购买的土豆和番茄作为天然有机物添加到MS培养基。并设置土豆汁浓度为100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L五个浓度梯度；番茄汁浓度梯度为50g/L、200g/L、350g/L、500g/L、650g/L五个浓度梯度。以MS+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L+土豆汁150g/L作为对照组。取铁皮石斛T4原球茎接种于上述培养基中，培养温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，琼脂条7～8g/L，蔗糖为30g/L，pH为5.8～6.0。
(2)干物率的测定
小心取出于培养室中培养30d、40d、50d的铁皮石斛原球茎，称取30g铁皮石斛原球茎新鲜样品M于105℃杀青30min，50℃烘干至恒质量，准确称取铁皮石斛样品干质量m；
干物率＝(m/M)*100％。
(3)增殖率的测定
接种前称取培养瓶的重量m1，接种后再次称重m2，计算出原球茎的初重，于培养室中培养30d、40d、50d后小心取出原球茎，称取原球茎重量M；
增殖率＝M-(m2-m1)/(m2-m1)*100％。
(4)主要药用成分的测定
多糖含量的测定采用苯酚硫酸法。总生物碱含量的测定采用氯仿法。
(5)数据处理
采用Excel软件作图，试验数据用Spss17.0进行统计分析。
下面结合具体分析对本发明作进一步描述。
1)不同浓度天然有机物对铁皮石斛原球茎干物率的影响：
在添加不同浓度土豆汁的培养基中，铁皮石斛原球茎干物率随着培养时间的延长总体上呈下降趋势。其中浓度对原球茎干物率的影响在前40d的变化较小，50d时各浓度处理下干物率较对照组下降更明显，在300g/L土豆汁的培养基中，干物率较对照下降48.19％。
在添加不同浓度番茄汁培养基中，原球茎的干物率总体趋势呈先上升后下降，且40d后各浓度处理组较对照显著上升，以添加50g/L和650g/L番茄汁效果更明显。可能是由于这两个过低和过高的浓度使原球茎生长受到限制，原球茎未大量增殖和分化导致的结果。
2)不同浓度天然有机物对铁皮石斛原球茎增殖率的影响：
对照组在40d后原球茎增殖率已趋于稳定，在添加不同浓度土豆汁的培养基中，随着培养时间的增加，铁皮石斛原球茎增殖率总上呈上升趋势，各处理组在50d时均达到最大值，显著高于对照，其中250g/L土豆汁培养基中增殖率比对照组高79.06％，达1028.94％。而在添加不同浓度番茄汁培养基中，40d前原球茎增殖率均显著低于对照，在50d时仅200～500g/L番茄汁培养基的增殖率与对照无显著差异，分析原因可能是番茄中的某些元素抑制了铁皮石斛原球茎的生长。总体看来，土豆汁较番茄汁促进铁皮石斛原球茎增殖的效果较好，表现为原球茎饱满，颜色浓绿。
3)不同浓度天然有机物对铁皮石斛原球茎多糖积累的影响
不同浓度土豆汁培养基中原球茎多糖含量影响中，多糖含量总体呈现先减少后增加的趋势。50d时浓度为250g/L的土豆汁培养基多糖含量显著高于其它浓度，达14.46％，与对照组相比增加66.58％。
随着培养时间的延长，番茄汁培养基中原球茎多糖含量均呈现持续下降的趋势。培养30d时，50g/L的番茄汁培养基中原球茎多糖含量最高，达到了15.62％，显著高于对照及其他处理组，但30d时其增殖率较对照低46.29％。
4)不同浓度天然有机物对铁皮石斛原球茎总生物碱积累的影响
在添加不同浓度土豆汁和番茄汁的培养基中，原球茎总生物碱含量随着培养时间的变化呈先上升后下降的趋势。40d时总生物碱含量较其他两个时期更高。其中40d时土豆汁浓度为250g/L的培养基中原球茎含量最高，总生物碱含量为0.032％，这与褚燕等的研究结果相似，与对照组相比高出了30.93％。而番茄汁的浓度为350g/L时总生物碱含量最高达0.0295％，比对照高21.99％。
本发明的结果表明：以适宜浓度的天然有机物土豆汁或番茄汁代替激素培养铁皮石斛原球茎，随着培养时间的延长，其干物率逐渐减少，而增殖率逐渐增加，其原因可能是原球茎大量增殖，分化程度相对较低，没有积累纤维素和果胶等物质的原因。
铁皮石斛原球茎是否可以作为铁皮石斛茎段的替代性药源，主要取决于其有效成分的含量和药理作用。本发明结果表明：适宜浓度的天然有机物作用下无激素培养的原球茎多糖含量高于有激素培养的多糖含量，总生物碱含量为0.032％，在传统栽培的石斛药材含量0.019％-0.043％范围之间。而关于多糖参照2010年版《中华人民共和国药典》规定，按干燥品计算，其含量不得少于25％，而本发明测定的原球茎多糖含量最大值为17.92％，分析其原因是原球茎培养到了一定时间培养基中的碳源以及营养成分基本消耗造成培养基的渗透压降低，影响原球茎的生长，多糖则水解，供细胞生长之用。
综合以上研究结果：本发明的无激素培养铁皮石斛原球茎可以替代外源激素培养，其中以培养基：MS+土豆汁250g/L+蔗糖30g/L+琼脂条7～8g/L效果最好，培养条件为：温度为23～25℃，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～3000Lx，pH为5.8～6.0。操作方法简便易行，实用价值高。
本发明以天然有机物代替激素培养铁皮石斛原球茎，其多糖和总生物碱积累的速率远远大于传统人工栽培的植物茎段，且生产成本较低，无添加激素可放心食用或加工，另外还可以考虑作为石斛多糖和石斛碱的生产来源，在一定程度上可成为促进铁皮石斛价格理性回归的方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种铁皮石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于，所述铁皮石斛原球茎无激素培养方法以铁皮石斛T4的原球茎为试材，在培养基中添加不同浓度梯度的土豆汁，并测定不同培养时间铁皮石斛原球茎的干物率、增殖率、多糖和总生物碱含量；
所述铁皮石斛原球茎无激素培养方法包括以下步骤：
步骤一，铁皮石斛原球茎诱导：使用铁皮石斛T4成熟果荚作为原球茎的诱导材料，在超净工作台上先用体积比为75%的酒精表面消毒20~30s，再用重量比为0.1%的升汞消毒5~8min，无菌水冲洗4~6次；用解剖刀将蒴果切开，将种子播种在无激素培养基MS+土豆汁100~150g/L+蔗糖20~30g/L+琼脂条7~8g/L的培养基中，种子平铺于培养基表面；培养条件为：温度为23~25℃，光照时间为14~16h/d，光照强度为2000~3000Lx，pH为5.8~6.0；培养30~40d后，得到膨大的铁皮石斛原球茎；
步骤二，铁皮石斛原球茎增殖：得到的原球茎接种于上述无激素培养基MS+土豆汁100~150g/L+蔗糖20~30g/L+琼脂条7~8g/L中增殖，接种量为每瓶10个点，每个点原球茎直径大小为0.8~1cm，30~40d后继代一次；培养条件为：温度为23~25℃，光照时间为14~16h/d，光照强度为2000~3000Lx，pH为5.8~6.0；
步骤三，铁皮石斛原球茎无激素培养：选择市场销售的新鲜土豆和番茄，切块，煮沸，纱布过滤，取汁液；将250 g/L的土豆汁添加于MS培养基中，将得到的原球茎接种于培养基中培养，培养条件为：温度为23~25℃，光照时间为14~16h/d，光照强度为2000~3000Lx，pH为5.8~6.0；
步骤四，测定铁皮石斛原球茎的干物率；
所述干物率的测定，具体包括：小心取出于培养室中培养30 d、40 d、50 d的铁皮石斛原球茎，称取30g铁皮石斛原球茎新鲜样品干质量M于105℃杀青30min，50℃烘干至恒质量，准确称取铁皮石斛样品干质量m；
干物率=（m/M）*100%；
步骤五，测定铁皮石斛原球茎的增殖率；
所述步骤五增殖率的测定包括：接种前称取培养瓶的重量m1，接种后再次称重m2，计算出原球茎的初重，于培养室中培养30d、40d、50d后小心取出原球茎，称取增殖后的原球茎重量M；
增殖率=（M-(m2-m1) ）/(m2-m1)*100%；
步骤六，测定铁皮石斛原球茎的多糖和总生物碱含量。
2.如权利要求1所述的铁皮石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于，所述步骤六的多糖含量的测定采用苯酚硫酸法，总生物碱含量的测定采用氯仿法。
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