CN110583483B - 一种诱导粉葛丛生芽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导粉葛丛生芽的方法，涉及药用植物生物技术领域，包括：取粉葛藤于冬季扦插于温室中，来年的3~4月份取新发的嫩枝作为外植体；外植体在最适条件下消毒后，接种于启动培养基，诱导出无菌新芽后转入丛生芽诱导培养基中，获得丛生芽；其中所述的启动培养基中含有浓度为0.1~2.0 mg/L的NAA以及浓度为0.1~0.9 mg/L的6‑BA；其中所述的丛生芽诱导培养基中含有浓度为0.5~1.5 mg/L的TDZ以及0.1~1.0 mg/L的NAA。本发明特别优化调整粉葛丛生芽诱导培养基的组分及浓度配比，提高粉葛丛生芽的诱导率及增殖率，该方法具有培养简单、增殖系数高、再生周期短等优点。

Description

一种诱导粉葛丛生芽的方法

技术领域

本发明属于药用植物生物技术领域，具体涉及到的方法是：筛选一种特定的培养基以提高粉葛丛生芽诱导率的方法。

背景技术

粉葛为豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根。是一种常用中药，并且富含淀粉，是国家卫生部首批批准的药食同源两用植物。功效为解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等，常用于治疗高血压、心绞痛、心肌梗死等，具有十分重要的药食用产业开发价值。粉葛因其独特的利用价值，被广泛的种植与利用，主要种植区域有广东、广西、湖南、贵州、云南等地，截至目前，已有四种国家地理标志的产品。粉葛种植是一项投资小、见效快、增效大的产业，全国各地陆续有许多乡镇都进行了大规模的粉葛种植。

粉葛的传统育苗方式主要有块茎繁殖、葛头繁殖、压条繁殖和扦插繁殖，目前的规模化生产中又以扦插繁殖方式为主要使用的育苗生产方式。由于长期使用，种性、品质和抗性均下降，生产效率较低，生长周期长，难以满足市场对粉葛种苗的需求。

采用组织培养技术可以达到快速生产优质种苗的目的，在无菌和人为控制的营养及环境等条件下对植物进行大规模无性繁殖。尽管有关粉葛的离体快繁已有少量报道，但污染和褐化问题严重，增殖系数低，愈伤组织难分化等都是粉葛组织培养难以实现规模化生产的瓶颈。

因此，基于以上，本发明想通过以粉葛的带节茎段为材料，用萌发出的无菌新芽直接诱导大量丛生芽，一方面可以避免愈伤诱导途径的易褐化及难分化的问题，另一方面也可以提高增殖系数，从而缩短粉葛的再生周期。

本发明人通过不同激素配比及添加物不同浓度的条件探索，结合粉葛生长的特点，发明了一种可以让粉葛大量诱导出丛生芽的培养基。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的技术中粉葛组培苗增殖系数低的问题，通过从腋芽诱导途径中对丛生芽诱导条件的技术探索，从而提供一种极大提高粉葛丛生芽诱导率的新方法。

本发明的技术方案：

一种诱导粉葛丛生芽的方法，包括外植体材料的获取、灭菌条件的筛选、启动培养条件探索、丛生芽诱导条件探索，其特征在于：包括以下步骤：

（1）外植体获取：取粉葛藤于冬季扦插于温室中，定期浇水，来年的3~4月份，优选健壮的植株，待新长出的嫩枝带有4~5个节的时候，剪下作为外植体；

（2）灭菌条件筛选：将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷蘸取洗洁精水刷洗表面，特别是茎的分支处需特别清洗，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次，装入无菌瓶中；将洗好的外植体置于超净工作台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液或2%次氯酸钠溶液灭菌8~10 min，加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次；

（3）启动培养条件探索：将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中；所述启动培养基包括1/2MS、MS、B5、N6、KC培养基，同时含有浓度为0.1~2.0 mg/L的6-BA、浓度为0.1~0.9 mg/L的NAA以及含有蔗糖30g/L、琼脂4 g/L、活性炭0.2 g/L，经过28 d的培养后获得无菌新芽；

（4）丛生芽诱导条件探索：将启动培养阶段获得的无菌嫩芽转接到丛生芽诱导培养基中，所述的丛生芽诱导培养基包括MS、1/2MS、1/4MS、改良MS培养基，同时含有浓度为0.1~1.5 mg/L的TDZ、浓度为0.05~1.0 mg/L的NAA、浓度为0.5 mg/L的6-BA、KT、ZT细胞分裂素、浓度为0.05~0.1 mg/L的IBA、不同浓度的水解酪蛋白、水解乳蛋白、牛肉蛋白胨各有机添加物以及含有蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L、活性炭0.2 g/L，经过28 d的培养后获得丛生芽。

进一步地，所述步骤（1）中，材料为1~2年生的且来源于广西藤县的葛藤。

进一步地，所述步骤（1）中，扦插的基质由表土和腐殖土混合而成，其中表土为黄壤土，腐殖土为当地松林下的表层黑色腐殖土壤；所述的表土和腐植土的体积比为2:1~3:1。

进一步地，所述步骤（2）中，灭菌条件为：用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液灭菌10 min，加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次。

进一步地，所述步骤（3）中，培养基组成是MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8。

进一步地，所述步骤（4）中，培养基组成是MS+TDZ1.5 mg/L+NAA1.0 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8。

进一步地，所述步骤（3）和步骤（4）中，培养条件为：温度条件为23~25 ℃、光照条件为2500 Lx、每天光照12 h、湿度为50~60%的培养室中，培养28 d。

进一步地，所述步骤（2），省略加入表面活性剂吐温80。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明以粉葛幼嫩带节茎段作为外植体材料，通过启动培养基培养28 d后，得到无菌新芽，可以作为诱导丛生芽的优质材料，经过优选的丛生芽诱导培养基，培养28 d后获得大量优质的丛生芽。

2、本发明直接从腋芽诱导途径出发，通过特定的培养基，在一定的时间内诱导出大量的丛生芽，达到快速增殖的效果，避免了愈伤诱导途径中愈伤组织易产生褐化和愈伤组织难以分化成芽的问题。同时，所取的外植体为健壮的粉葛带节茎段，由于植物体自身抵抗力较强，因此灭菌剂对植物体本身的伤害可以迅速的恢复，并进行快速生长，极大的提高了外植体的成活率。

3、本发明所用的外植体材料为幼嫩的带节茎段，由于粉葛本身的特性，该植物藤蔓在取过一次后，可在1个月时间内重新长出新藤蔓，因此，本发明可有充足的资源作为外植体，便于粉葛种苗的大规模生产。

4、本发明诱导丛生芽所用的周期短，约为2个月的时间，并且1株丛芽的芽数高达12株芽（通常1个茎段只能发1~2个芽），不仅可以缩短生产粉葛苗的周期，还能提高增殖系数，极大的提高了生产效率。

5、本发明操作简便，过程简捷，可行性高，非常易于投入大规模生产，是一种实用、高效、快速、可行的方法。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果清晰的呈现，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例2中外植体在MS培养基中启动培养28 d时的长势。

图2为一般培养基培养28 d时的长势与实施例4中在效果较好的丛生芽诱导培养基中培养28 d时的长势作对比。

图3为实施例5中，优化处理的1~9号的丛生芽诱导培养基中培养28 d时的长势。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实例进行详细的描述。

实施例1

外植体灭菌条件筛选

晴天上午，取新发的无病虫害、生长健壮、发育良好的粉葛幼嫩枝条，将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷蘸取洗洁精水刷洗表面，特别是茎的分支处需特别清洗，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次，装入无菌瓶中，放到超净台上。将粉葛嫩枝用75%的乙醇灭菌30 s，用无菌水冲洗2次，用以下不同方法进行灭菌处理。

不同的方法分别为：（1）0.1%升汞灭菌10 min；（2）0.1%升汞灭菌10 min+2滴吐温-80；（3） 2%次氯酸钠灭菌12 min；（4） 2%次氯酸钠灭菌12 min+2滴吐温-80。各种消毒方法处理结束后，均用无菌水清洗5次，后将带节茎段在滤纸上吸干表面的水，切成1.5 cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中。每种处理10瓶，重复3次，28 d后统计结果，如表1所示。

表1不同灭菌方法对粉葛成活率及污染率的影响

由表1所示的结果可以看出处理2的效果最好，成活率高且污染率低，即最适灭菌条件为0.1%升汞灭菌10 min+2滴吐温-80，成活率达93.33%。

实施例2

粉葛腋芽启动培养的方法及其培养基的选择

1）外植体灭菌

将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷慢慢清洗茎和叶，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次。将洗好的外植体置于超净台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液灭菌10 min，同时加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次。

2)启动培养及其培养基选择

将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5 cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中。分别以1/2MS、MS、B5、N6、KC为基本培养基，都加入6-BA0.2 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8，每个处理10瓶，重复3次，分别于培养后的28 d统计出芽情况，如表2所示。

表2不同类型基本培养基启动培养结果

由表2的结果可以看出，在N6培养基上生长的外植体芽基本上全部都萌发，但是芽非常的细小，生长缓慢。在MS培养基上生长的外植体萌发率也较高，并且芽长势健壮，因此得出MS培养基为适合粉葛腋芽启动培养的培养基。

实施例3

粉葛腋芽启动培养的方法及其6-BA浓度的选择

1）外植体灭菌

将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷慢慢清洗茎和叶，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次。将洗好的外植体置于超净台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液灭菌10 min，同时加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次。

2）启动培养及其6-BA浓度选择

将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5 cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中。以MS+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭0.2 g/L为基本培养基，pH值为5.8，分别加入0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L5个不同浓度6-BA进行实验，以不添加6-BA为空白对照。每个处理10瓶，重复3次，分别于培养后的28 d统计出芽情况，如表3所示。

表3不同6-BA浓度对粉葛腋芽启动培养结果

由表3的结果可以看出，当6-BA浓度为0.5 mg/L时，芽长势较好，且萌发率较高，达到93.33%。即启动培养的激素为6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L。

实施例4

粉葛丛生芽诱导培养基条件初探

1）外植体灭菌

将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷慢慢清洗茎和叶，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次。将洗好的外植体置于超净台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液灭菌10 min，同时加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次。

2）启动培养

将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5 cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中。启动培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8.

3）丛生芽诱导

将启动培养阶段获得的无菌嫩芽转接到丛生芽诱导培养基中，通过对激素配比和有机添加物的考察，确定诱导丛生芽的培养条件。以MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭0.2g/L为基础培养基，按照表4中激素浓度和添加物进行实验，每个处理4瓶，重复3次，分别于培养后的第28 d统计出芽情况，结果如表5所示。

表4丛生芽诱导培养基L₁₆（4⁵）正交设计表

表5丛生芽诱导培养基条件初探结果

由表5的实验结果进行直观分析，可以得到各因素对粉葛丛生芽诱导的影响先后顺序为：细胞分裂素>生长素>培养基类型>有机添加物。其中，最适培养基为MS培养基，最适激素为TDZ0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L，添加物之间没有明显差异。

实施例5

粉葛丛生芽诱导培养基条件优化

1）外植体灭菌

将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷慢慢清洗茎和叶，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次。将洗好的外植体置于超净台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液灭菌10 min，同时加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次。

2）启动培养

将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5 cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中。启动培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8.

3）丛生芽诱导

将启动培养阶段获得的无菌嫩芽转接到丛生芽诱导培养基中，根据实例4的实验结果可知，适合丛生芽分化的培养基为MS培养基，适合的细胞分裂素为TDZ，适合的生长素为NAA，有机添加物没有明显差别，在此基础上，将进行进一步的实验，确定诱导丛生芽的培养条件。以MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭0.2 g/L为基础培养基，按照表6中激素浓度和添加物进行实验，每个处理10瓶，重复3次，分别于培养后的第28 d统计出芽情况，结果如表7所示。

表6粉葛丛生芽诱导培养基条件优化L₉(3⁴)正交设计表

表7粉葛丛生芽诱导培养基条件优化结果

从以上实验结果可以看出，当NAA浓度为0.1 mg/L时，即可有愈伤组织长出，NAA浓度越高，长出的愈伤组织越多。当TDZ浓度为0.5 mg/L，NAA浓度为0.1 mg/L时，粉葛苗可以正常生长，但是分化的芽较少。当NAA浓度等于或大于TDZ浓度时，脱分化程度高，长出大量愈伤组织。当TDZ浓度大于NAA浓度时，丛生芽可大量分化。根据实验结果，处理9，即当TDZ浓度为1.5 mg/L，NAA浓度为1.0 mg/L时，丛生芽诱导率达90%，因此，MS+TDZ1.5 mg/L+NAA1.0mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8，为最优丛生芽诱导培养基。

以上实施例中，培养条件为：温度条件为23~25 ℃、光照条件为2500 Lx、每天光照12 h、湿度为50~60%的培养室中，培养28 d。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管上述实例已详细描述了本发明方法，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出不同的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的内容。

Claims (5)

1.一种诱导粉葛丛生芽的方法，包括外植体材料的获取、灭菌条件的筛选、启动培养条件探索、丛生芽诱导条件探索，其特征在于：包括以下步骤：

（1）外植体获取：取粉葛藤于冬季扦插于温室中，定期浇水，来年的3~4月份，选择健壮的植株，待新长出的嫩枝带有4~5个节的时候，剪下作为外植体；

（2）灭菌条件筛选：将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷蘸取洗洁精水刷洗表面，特别是茎的分支处需特别清洗，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次，装入无菌瓶中；将洗好的外植体置于超净工作台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液或2%次氯酸钠溶液灭菌8~10 min，加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次；

（3）启动培养条件探索：将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中；所述启动培养基组成是MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8；经过28 d的培养后获得无菌新芽；

（4）丛生芽诱导条件探索：将启动培养阶段获得的无菌嫩芽转接到丛生芽诱导培养基中，所述的丛生芽诱导培养基组成是MS+TDZ1.5 mg/L+NAA1.0 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8；经过28 d的培养后获得丛生芽；

所述步骤（3）和步骤（4）中，培养条件为：温度条件为23~25 ℃、光照条件为2500 Lx、每天光照12 h、湿度为50~60%的培养室中，培养28 d。

2.根据权利要求1所述的一种诱导粉葛丛生芽的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，外植体为1~2年生的且来源于广西藤县的葛藤。

3.根据权利要求1所述的一种诱导粉葛丛生芽的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，扦插的基质由表土和腐殖土混合而成，其中表土为黄壤土，腐殖土为当地松林下的表层黑色腐殖土壤；所述的表土和腐植土的体积比为2:1~3:1。

4.根据权利要求1所述的一种诱导粉葛丛生芽的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，灭菌条件为：用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液灭菌10 min，加入表面活性剂吐温80，用无菌水清洗5次。

5.一种诱导粉葛丛生芽的方法，包括外植体材料的获取、灭菌条件的筛选、启动培养条件探索、丛生芽诱导条件探索，其特征在于：包括以下步骤：

（1）外植体获取：取粉葛藤于冬季扦插于温室中，定期浇水，来年的3~4月份，选择健壮的植株，待新长出的嫩枝带有4~5个节的时候，剪下作为外植体；

（2）灭菌条件筛选：将健壮的嫩枝放入洗洁精和84消毒液混合溶液中浸泡10 min，然后用软毛刷蘸取洗洁精水刷洗表面，特别是茎的分支处需特别清洗，之后用自来水清洗干净，再用纯水清洗一次，装入无菌瓶中；将洗好的外植体置于超净工作台上，用75%乙醇溶液浸泡30 s，无菌水清洗2次后，用0.1%升汞溶液或2%次氯酸钠溶液灭菌8~10 min，用无菌水清洗5次；

（3）启动培养条件探索：将灭菌处理后的粉葛枝条切成1.5cm左右的带节茎段，多余部分去除，将切好的茎段接种到启动培养基中；所述启动培养基组成是MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8；经过28 d的培养后获得无菌新芽；

（4）丛生芽诱导条件探索：将启动培养阶段获得的无菌嫩芽转接到丛生芽诱导培养基中，所述的丛生芽诱导培养基组成是MS+TDZ1.5 mg/L+NAA1.0 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L+活性炭0.2 g/L，pH值为5.8；经过28 d的培养后获得丛生芽；

所述步骤（3）和步骤（4）中，培养条件为：温度条件为23~25 ℃、光照条件为2500 Lx、每天光照12 h、湿度为50~60%的培养室中，培养28 d。

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